الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Summary

نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.

Abstract

توفر الثقافات العضوية المعوية فرصة فريدة للتحقيق في الخلايا الجذعية المعوية وبيولوجيا السرداب في المختبر، على الرغم من أن النهج الفعالة للتعامل مع التعبير الجيني في الأعضاء قد حققت تقدما محدودا في هذا المجال. في حين أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم الدقيق للخلايا لتوليد الأعضاء، فإن هذه الاستراتيجية تتطلب اختيارًا وفرزًا واسعًا من خلال تحليل التسلسل، وهو أمر يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفًا على حد سواء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لنقل الفيروسية كفاءة من الأعضاء المعوية. هذا النهج سريع وعالي الكفاءة، وبالتالي تقليل الوقت والنفقات المتأصلة في تكنولوجيا CRISPR/Cas9. كما نقدم بروتوكولا لتوليد أقسام مجمدة من الثقافات العضوية سليمة لمزيد من التحليل مع تلطيخ المناعية الكيميائية أو الفلورسنت المناعية، والتي يمكن استخدامها لتأكيد التعبير الجيني أو إسكات. بعد أن يتم تحقيق انتقال ناجح من النواقل الفيروسية للتعبير الجيني أو إسكات، يمكن تقييم الخلايا الجذعية المعوية ووظيفة سرداب بسرعة. على الرغم من أن معظم الدراسات العضوية تستخدم في الاختبارات المختبرية، يمكن أيضا أن يتم تسليم الأعضاء إلى الفئران للتحليلات الوظيفية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن نُهجنا مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية للأدوية لأن العلاجات المتاحة حاليا تعمل عموما عن طريق تعديل التعبير الجيني أو وظيفة البروتين بدلا من تغيير الجينوم.

Introduction

القدرة على ثقافة الماوس أو خلايا سرداب الإنسان كما ثلاثي الأبعاد (3D) الأعضاء من الأمعاء الدقيقة أو القولون على مدى فترات زمنية طويلة قدمت اختراقا كبيرا لأن هذه الثقافات عرض ملامح تعريف ظهارة الأمعاء في الجسم الحي ^{1 , 2 , 3}. العضوية المستمدة من سرداب الأولية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي، وتظهر وظائف الخلوية مماثلة لأنسجة المنشأ الخاصة بهم. في الواقع، فإن الأعضاء تُخزّن ليس فقط التنظيم الهيكلي للأقبية في الجسم الحي، ولكن أيضاً العديد من السمات الجزيئية، وبالتالي توفير أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا الطبيعية وحالات المرض. لتوضيح ذلك، كشفت الدراسات العضوية مسارات جزيئية جديدة تشارك في تجديد الأنسجة^{1،2،3،4،5،} فضلا عن الأدوية التي يمكن أن تعزز وظيفة في الإعدادات المرضية^6،7.

دراسة الخلايا الجذعية المعوية ذات أهمية خاصة لأن بطانة الأمعاء هي من بين أنسجة الثدييات الأكثر تجديدا للغاية، وتجديد نفسها كل 3-5 أيام لحماية الكائن الحي من البكتيريا والسموم، وغيرها من مسببات الأمراض داخل اللومن المعوية. الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) هي المسؤولة عن هذه القدرة التجديدية الرائعة وبالتالي توفير نموذج فريد لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية الكبار^1،2. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب في الفئران أن الخلايا الجذعية الإيجابية Lgr5 المعزولة يمكن أن يتم زرعها لتوليد أجهزة عضوية ثلاثية الدائية أو "أحشاء صغيرة" في المختبر حيث تعكس عن كثب نظيراتها في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستمد الثقافات العضوية من عزل خلايا سرداب الأمعاء تتألف من الذرية، ISCs، وخلايا بانيث، وهذا الأخير التي تشكل الخلايا المتخصصة الظهارية في الجسم الحي. في الواقع، تطورت الثقافة العضوية من خلايا سرداب الأمعاء الأولية إلى تقنية روتينية نسبيا التي من السهل تنفيذها في معظم المختبرات باستخدام الكواشف المتاحة على نطاق واسع. هذا النموذج هو أيضا قابلة للتحليل الكمي للتعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) والبروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي، والكيمياء المناعية، أو تلطيخ الفلورسنت المناعي^2،4،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة علم الوراثة الوظيفية باستخدام كسب الوظيفة (التعبير المفرط للجين أو التعبير عن جين متحول المنشط) أو فقدان الوظيفة (إسكات الجينات أو التعبير عن متحولة فقدان الوظيفة) النهج².

والأهم من ذلك، أن انخفاض الكفاءة والسمية العالية للحمض النووي البلازمي القياسي أو بروتوكولات الانكل الفيروسي مع البوليبرين لا تزال تشكل عقبة رئيسية في هذا المجال. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم بدقة، فإن هذا النهج يتطلب اختيارًا يستغرق وقتاً طويلاً متبوعًا بالتحقق من صحة التسلسل⁹. هنا، نقدم بروتوكول تحويل الفيروسية للأعضاء المعوية الأولية التي يحسن تسليم الجسيمات الفيروسية عن طريق الاقتران إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية وتطبيق حقل مغناطيسي. وترد التعديلات الرئيسية على البروتوكولات السابقة^4و5و10و11و12 و13 وتوصيات لتعزيز الكفاءة. كما نقوم بوصف نهج لتوليد أقسام مجمدة من الأعضاء السليمة المستزرعة في matrigel 3D (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو مصفوفة) لمزيد من التحليل مع الكيمياء المناعية أو تلطيخ الفلورسنت المناعي.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات الطبية جونز هوبكنز (IACUC). يتم تعديل هذا البروتوكول من أساليب نشرت^{مسبقا10و11و12و13}.

1. إعداد الكواشف

1. إعداد 293T الطازجة المتوسطة عدة ساعات مقدما ودافئة إلى 37 درجة مئوية فيحمام مائي لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الاستخدام (الجدول 1).
2. إعداد الحمضالنووي بلازميد 2،^13،14 للتغليف الفيروسي. (الجدول2).
3. الحصول على جميعالمواد الأخرى المطلوبة (جدول المواد).

2. لينتيفيروس أو إنتاج الجسيمات الرجعية

1. الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T زرع الخلايا (اليوم الأول)
   1. إعداد طبق ثقافة واحد 150 مم عن طريق الطلاء مع 50 ميكروغرام / مل بولي-د-يسين المذاب في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS؛ 10 مل / طبق) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. إزالة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)/ بولي د-يسين وغسل الطبق المطلي مرتين مع 5 مل PBS.
   3. خلايا البذور 293T (8\u201210 x 10⁶⁾في 293T المتوسطة (الجدول1)إلى حجم إجمالي قدره 15 مل.
   4. ثقافة 293T الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنةزراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
2. HEK 293T خلية التغوط (اليوم 2)
   1. إجراء التغوط بمجرد أن تصل الخلايا 70-80٪ التقاء (عادة حوالي 24 ساعة بعد البذر 8\u201210 × 10⁶ الخلايا).
   2. إعداد خليط التغوط باستخدام نهج فعال مثل تركيبة اللبوسوم الموجبة التجارية (الجداول1\u20122، جدولالمواد)^2.
      1. يخفف الحمض النووي لينتيفيروس 12 (مجموع ~ 24 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي، الجدول 2)في 1.2 مل من التغوط المتوسطة والحضانة لمدة 5 دقائق في RT في أنابيب 1.5 مل (جدول المواد).
      2. تخفيف transfection ريجنت (36 درجة مئوية) في 1.2مل من التغوط المتوسطة (جدول المواد) وحضانة في أنابيب 5 مل لمدة 5 دقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. إضافة كاشف فيروس lenti (الخطوة 2.2.2.1) إلى كاشف التغوط (الخطوة 2.2.2.2) وخلط بلطف عن طريق الأنابيب بطيئة صعودا وهبوطا باستخدام pipet 5 مل.
      4. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT.
   3. غسل بلطف خلايا 293T مع 5 مل من التغوط المتوسطة واستبدال مع 10 مل من المتوسطة transfection.
   4. إضافة مجمعات الدهون الحمض النووي (من الخطوة 2.2.2.3) قطرة إلى وسط الخلايا 293T وخلط بعناية وسائل الإعلام في أطباق الثقافة عن طريق التحرك في الاتجاهات الأفقية والرأسية لضمان التوزيع المتساوي للمجمعات الدهون الحمض النووي في كل طبق.
   5. حضانة لمدة 6 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية(37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
   6. بعد الحضانة، استبدال وسائل الإعلام مع 20 مل فيروسجديد جمع المتوسطة (الجدول 1).
3. مجموعة الفيروسات (الأيام 3\u20125)
   1. جمع وسائل الإعلام الفيروس في أنابيب 50 مل، وتخزينها في ثلاجة 4 درجة مئوية لمزيد من التركيز.
   2. استبدال 20 مل من فيروس جديد جمع المتوسطة كل 24 ساعة والثقافة بين عشية وضحاها (~ 24 ساعة). كرر جمع الوسائط خلال اليومين التاليين (أيام 4\u20125).
   3. تأكد من أن الحجم الإجمالي للمتوسط الذي تم جمعه بعد اليوم 5 هو ~ 60 مل (20 مل / يوم × 3 أيام).
4. تركيز الفيروس (اليوم 5)
   1. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها (60 مل) لمدة 5 دقائق في 400 × ز. ثم، تمرير supernatant من خلال مرشح (0.45 ميكرومتر المسام) لإزالة أي الحطام الخلوي.
5. تركيز الفيروس عن طريق إضافة 15 مل من وسائل الإعلام الفيروس تصفيتها في وحدة تصفية الطرد المركزي (جدول المواد). الطرد المركزي في 2500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. لأن الفيروس لا يمكن أن تمر من خلال هذا التصفية، سيتم تتركز في الغرفة العليا من عامل التصفية.
   1. يستنشق التدفق من خلال من الأنبوب (الغرفة السفلى) وإضافة آخر 15 مل من وسائل الإعلام جمع الفيروسية المتبقية supernatant إلى نفس وحدة تصفية الطرد المركزي. الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه (2500 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية) لتركيز فيروس إضافي من supernatant.
   2. كرر العملية باستخدام نفس الفلتر لوسائط 60 مل من لوحة واحدة مستحثة حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب (~ 100 أضعاف).
      ملاحظة: نحن عادة ما تركز ~ 60 مل من وسائل الإعلام جمع الفيروس إلى ~ 600 درجة مئوية.
   3. إزالة الفيروس المركز من الغرفة العليا للمرشح باستخدام أنبوب 1 مل، ثم aliquot وتخزينها في أنابيب 1.5 مل (50\u201260 μL/tube) في -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. تخزين الجسيمات المركزة لمدة تصل إلى 6\u201212 أشهر.

3. عزل سرداب

1. قتل الفئران باستخدام CO₂ وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC المحلية.
2. وضع الحيوان القتل الرحيم على ظهره وغسل البطن عن طريق الرش مع الإيثانول 70٪.
3. إجراء شق خط الوسط الطولي من القص إلى الفخذ، وتقطيع الجلد أولا، ومن ثم الأنسجة تحت الجلد.
4. إزالة الأمعاء الدقيقة من المعدة إلى cecum.
5. تحديد المناطق ذات الاهتمام داخل الأمعاء الدقيقة؛ يمكن عزل سرداب من الاثني عشر، جيجونوم واللفائفي.
6. باستخدام حقنة 10 مل، امسح الأمعاء الدقيقة المعزولة مع حاجز انفصال سرداب (PBS المبردة مسبقا ً التي تحتوي على 1 مليون ديثيوثريتول (DTT)، 1٪ بنسلين/ ستريتوبيسين (لا Ca²⁺ وMg²⁺)) في طبق زراعة الأنسجة 10 سم (جدول 1)
7. إزالة الأنسجة الدهنية الطرفية، وفتح أو "فيليه" الأنسجة المعوية طوليا على لوحة زجاجية معقمة (15 سم × 15 سم).
8. كشط بلطف قبالة الزغب الظهاري المعوي باستخدام مكشطة الخلية.
9. قطع الأمعاء الدقيقة إلى 2\u20123 سم طول الحكمة المقاطع.
10. نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على PBS المبردة مسبقا باستخدام ملقط مسطحة (116 ملم). غسل شظايا الأنسجة عن طريق هز بقوة باليد ل ~ 30 ق (تحريك الأنبوب في اتجاهات معاكسة ~ 60 مرات).
11. قم بتحديث PBS وكرر الغسيل حتى يصبح PBS واضحًا.
    ملاحظة: عادة ما نغسل الشظايا 2\u20123 مرات.
12. احتضان الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت فك التشفير (الجدول1) لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية على شاكر المداري ة بسرعة متوسطة بمجرد أن يكون PBS واضحا.
13. هز بقوة الأنبوب باليد ل ~ 30 ق (الاتجاهات المعاكسة 60 مرات) ونقل الأنسجة باستخدام ملقط مسطحة إلى أنبوب مخروطي آخر 15 مل تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت انفصال سرداب. احتضان هذا الكسر على الجليد. لا تستخدم الكسر الأول للثقافة العضوية لأنه يحتوي على الزغب في المقام الأول.
14. كرر الخطوات 3.11\u20123.13 لـ 3\u20124 مرات، وجمع كل كسر ووضعها على الجليد.
15. حدد الكسر الذي يتم إثراؤه بأعلى نسبة مئوية من سرداب الأمعاء عن طريق مسح عينات 200 ميكرولتر من كل كسر تحت المجهر المقلوب (4x). تحديد الأقبية من قبل مورفولوجيا نموذجية كما هو موضح سابقا (الشكل1A)¹⁰.
    ملاحظة: وسوف تظهر مستديرة أو بيضاوية في الشكل وتحتوي على خلايا بانيث الحبيبية. وعلى النقيض من ذلك، فإن الزغب هياكل تشبه الأصابع تفتقر إلى خلايا البانيث الحبيبية (الشكل1B).
16. تمرير الكسر المحدد من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على سرداب من حجم مماثل إذا لزم الأمر. بدلا من ذلك، عزل Lgr5 + الخلايا الجذعية على أساس تدفق الخلايا للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) إذا تم عبور الفئران على خلفية EGFP-Lgr5 + أو نموذج آخر مناسب التي تمكن من تحديد الخلايا Lgr5 +².
17. حساب العدد الإجمالي للأقبية في الكسر المحدد كما يلي.
    1. ماصة 50 درجة مئوية من الكسر المحدد في مقياس الهيموكيتومتر وحساب عدد من سرداب باستخدام المجهر الضوئي المقلوب (4X). ضع حوالي 100 سرداب لكل بئر عند استخدام لوحة من 48 بئرًا للسماح بتجارب التحويل التي سيتم فيها نقل 3\u20126 من الآبار لكل حالة تجريبية لإسكات الجينات أو التعبير المفرط.
    2. استناداً إلى عدد الأقبية لكل 50 ميكرولتر، احسب حجم المخزن المؤقت للانفصال عن القبو اللازم ونقل هذا الحجم إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
       ملاحظة: على سبيل المثال، يتم حساب 10 سرداب لكل 50 ميكرولتر، 6 × 50 ميكرولتر أو 300 ميكرولتر لـ 300 سرداب.
18. طرد مركزي سرداب في أنابيب 1.5 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
19. تجاهل بعناية supernatant عن طريق الأنابيب بلطف قبالة الطبقة السائلة العليا وإعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من عامل النمو خفض مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد (جدولالمواد).
20. قم بزرع الأقبية المحتوية على المصفوفة في لوحة 48 بئرًا مُسخنة مسبقًا بـ 37 درجة مئوية (30 درجة مئوية/بئر، أي حوالي 100 سرداب/بئر). احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة 5\u201215 دقيقة للسماح لهلام مصفوفة (37 درجة مئوية، 5٪ CO_2).
21. تراكب كل هلام مع 250 درجة مئوية ثقافةالجهاز (ENR) المتوسطة (الجدول 1) ووضع لوحات 48 جيدا مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO_2). تحقق من الثقافات لتنظيم سرداب في الأشكال الصغيرة، جولة، الكيسي بعد 24 ساعة. سوف تشكل براعم بعد 2\u20125 أيام.
22. استبدال وسائل الإعلام ENR بلطف كل 3 أيام. إزالة وسائل الإعلام ENR القديمة مع شفط لطيف، مع الحرص على عدم لمس المصفوفة عند استبدال وسائل الإعلام.
23. مرور الثقافات العضوية كل 4\u20127 أيام كما سبق وصفها¹¹.

4. إعداد جزء العضوية

1. الأعضاء المنقولة بمجرد تشكيلها (في غضون 1\u20122 أسابيع) أو بعد مرورها. لتجربة نقل واحدة، إعداد 2\u20123 الآبار من الأعضاء المستزرعة في لوحة 48 جيدا لكل حالة مع ~ 100\u2012200 organoids/well أو ~ 200\u2012600 organoids لكل حالة تحويل تجريبية.
2. تبادل ENR مع 250 μLوسائل الإعلام transduction (الجدول 1) والثقافة في وسائل الإعلام transduction لمدة 3 أيام أو أكثر أو حتى الأعضاء اعتماد مورفولوجيا الكيسي. تضمين كل من Wnt3a ومثبطات ROCK (Y27632) في وسيط التحويل لزيادة عدد الخلايا الجذعية والبانيث. نيكوتيناميد (Nic) يحسن كفاءة الثقافة (انظر المتوسطة transduction في الجدول 1).
3. تمزق ميكانيكيا هيكل مصفوفة غشاء الطابق السفلي مثل قبة مع وسائل الإعلام وطرف pipet باستخدام أنبوب 1 مل.
4. نقل الأعضاء ووسائل الإعلام إلى أنبوب معقمة 1.5 مل.
5. ميكانيكيا تعطيل المصفوفة كذلك عن طريق الأنابيب مع 200 ميكرولتر pipet ~ 10\u201215 مرات.
6. طرد مركزي شظايا الجهاز ية في RT في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
7. تخلص من الـ supernatant بعناية باستخدام ماصة وتعليق بيليه في 1مل DMEM/F12 المتوسطة (الجدول 1).
8. إضافة ديسباسي الأول (6 ميكرولتر في 10 ملغ / مل) وDNase الأول (2.5 ميكرولتر في 10 ملغ / مل). يُمزج جيداً عن طريق الأنابيب برفق باستخدام أنبوب 1 مل.
9. حضانة الأعضاء في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في أنبوب 1.5 مل.
10. إضافة 500 درجة مئوية من وسائل الإعلام ENR لإنهاء رد فعل التفكك؛ المصل في ENR ينهي رد الفعل.
11. تمرير الخلايا العضوية من خلال مصفاة خلية 20 ميكرومتر والطرد المركزي شظايا الجهاز في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
12. إعادة تعليق الشظايا العضوية مع 150ميكرولتر المنقولة المتوسطة (الجدول 1).

5. الهندسة الوراثية للأورغانويدات أو خلايا سرداب عن طريق الترانسدوكشن الفيروسي

ملاحظة: انظر الشكل 2.

1. مجموعات الخلايا العضوية البذور مع 200 درجة مئوية transduction المتوسطة / جيدا في لوحة 48 جيدا وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂). بدلا من ذلك، وضع خلايا سرداب معزولة حديثا (~ 1000 سرداب) في 200 μL transduction المتوسطة / جيدا في لوحة 48 جيدا وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂).
2. ذوبان قارورة من الفيروس للانتراب مما يسمح ل ~ 50 ميكرولتر من الفيروس المركز لنقل كل بئر في لوحات 48 جيدا أو ~ 100 ميكرولتر من الفيروس المركز لكل بئر في لوحات 24 جيدا.
3. فيروس احتضان مع 12 ميكرولتر من محلول الجسيمات النانوية المغناطيسية لمدة 15 دقيقة في RT في أنبوب 1.5 مل (الجدول3).
4. إضافة محلول الجسيمات النانوية المغناطيسية / خليط الفيروس إلى الخلايا التي سيتم نقلها.
5. وضع لوحة ثقافة الخلية على لوحة مغناطيسية وحضانة لمدة 2 ساعة على الأقل (وتصل إلى ~ 6 ح)في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).

6. بذر شظايا الأعضاء المصابة

1. نقل مجموعات الخلايا العضوية المصابة ووسائل نقل الوسائط من كل بئر إلى أنبوب 1.5 مل.
2. الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
3. تخلص من الـ supernatant مع شفط لطيف وتبريد الأنبوب الذي يحتوي على بيليه على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. إضافة 120 درجة مئوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا.
5. البذور 30 ميكروغرام قطرات من خليط مصفوفة الخلية في لوحة جديدة 48 جيدا.
6. قم باحتضان اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5\u201215 دقيقة حتى تترسخ المصفوفة.
7. إضافة وسيط ة تحويل إلى كل بئر وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة 3\u20124 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ CO_2).
8. بعد 3\u20124 أيام، فحص الثقافات تحت المجهر الخفيف (10X) لضمان تنظيم مجموعات الخلايا في هياكل الجهازية. ثم، استبدال بلطف وسائل الإعلام transduction مع 250 μL ENR المتوسطة.
9. استبدال الوسائط كل 3\u20124 أيام.

7- الاختيار (إن وجد)

1. بعد 2\u20123 أيام، إضافة المضادات الحيوية ذات الصلة أو الهرمونات للاختيار إلى وسيط ة التحويل إذا كان ذلك مناسباً.
   ملاحظة: استخدمنا البورومسين (2 ميكروغرام / مل) لاختيار الترانسدوكشن lentivrial لأن بلازميدات يأوي الجينات المقاومة البورومسين^2،14.

8. تأكيد الترانسدوكتيون الناجحة والتعبير الجيني أو الإسكات

1. إذا كان استخدام FUGW lentivirus^2،14،تقدير كفاءة transduction عن طريق قياس إشارات GFP عن طريق المجهر الفلورسنت أو تدفق قياس السيتومترية.
2. التحقق من صحة الإفراط في التعبير الجيني أو إسكات باستخدام الكمية عكس النسخ polymerase تفاعل سلسلة (RT-PCR) للمقارنة الكمية من mRNA في الثقافات العضوية التحكم والتجريبية.
3. تأكيد مستويات البروتين للتعبير الجيني الترميز البروتين أو إسكات من قبل لطخة الغربية أو تلطيخ المناعة².

9. استئصال التبريد العضوي في الطابق السفلي غشاء مصفوفة

ملاحظة: انظر الشكل 3.

1. إزالة ENR المتوسطة عن طريق شفط لطيف، والحرص على عدم تعكير مصفوفة غشاء الطابق السفلي وغسل بلطف مرة واحدة مع 500 درجة مئوية من PBS.
2. إصلاح organoids مع 1.0 مل من 4٪ بارافورمالهايد(PFA) الحل (جدول المواد) في RT لمدة 30 دقيقة.
3. إزالة PFA عن طريق الشفط، وغسل بلطف مرتين مع 1 مل PBS.
4. إزالة PBS عن طريق شفط وإضافة 1.0 مل من 30٪ السكروز العازلة إلى كل عينة. حضانة الأعضاء الثابتة في السكروز لمدة ساعة واحدة في 4 درجة مئوية في غرفة باردة، ثلاجة، أو على الجليد لتجفيف العينات.
5. إزالة العازلة السكروز عن طريق شفطوإضافة ما يكفي من مجمع تضمين (جدول المواد) لتغطية طبقة المصفوفة (~ 300 درجة مئوية / جيدا) في كل بئر.
6. حضانة في RT لمدة 5 دقائق.
7. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أو حتى يتحول مجمع التضمين إلى صلب وأبيض.
8. ضع الطبق مع مركب التضمين المجمدة في RT للسماح لذوبان الحد الأدنى من المجمع على طول الحواف. استخدام مشرط لفصل كتلة من جدران البئر.
9. إزالة كتلة مركب مصفوفة التضمين باستخدام ملقط ووضعها في كتلة عينة (على سبيل المثال cryomold)، والعمل بسرعة لمنع ذوبان.
10. ملء القالب تماما مع مجمع تضمين وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. استخدام كتلة هو للتقسيم أو التخزين في -80 درجة مئوية الفريزر لمزيد من الاستخدام.

النتائج

هنا، ونحن نصف تقنية نقل سريعة وعالية الكفاءة التي تسخر الجسيمات النانوية المغناطيسية المعرضة لحقل مغناطيسي لتسليم فيروس لينتي إلى الخلايا ذات الأهمية. مع الأدوات المتاحة بسهولة، قمنا بتطبيق هذا النهج ليس فقط لنقل خلايا سرداب معزولة حديثا (الشكل 1A)،ولكن ...

Discussion

الثقافة الأولية للظهارة المعوية الكبار كما organoids يوفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في وظيفة الخلايا الجذعية، التوازن الظهاري المعوي، وعلم الأمراض^{1،2،3، 4}. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 يمكن استخدامها ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Base medium for 293T cells
DMEM/F12+	Thermo Fisher Scientific	12634010	Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV	Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific	15140122	Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	10010049	A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140050	Component of organoid culture medium
GlutamaxII	Thermo Fisher Scientific	35050061	Component of organoid culture medium
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080	Component of organoid culture medium
EGF	Millipore Sigma	E9644	Component of organoid culture medium
Noggin	Peprotech	250-38 B	Component of organoid culture medium
R-spondin	R&D	7150-RS-025/CF	Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin	Millipore Sigma	I9278-5ml	Component of organoid culture medium
Nicotinamide	Millipore Sigma	N3376-100G	Component of Transduction medium
Wnt3A	R&D	5036-WN-010	Component of Transduction medium
Y27632	Millipore Sigma	Y0503-1MG	Component of Transduction medium
0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol)	Thermo Fisher Scientific	R0861	Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I	Millipore Sigma	D4818-2MG	Component of organoid digestion buffer
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced)	Corning	356231	Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L	Oz Biosiences	RL40200	Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate	Oz Biosiences	MF10000	Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine	Millipore Sigma	A-003-E	Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution	Boster	AR1068	Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound	Thermo Fisher Scientific	4583S	For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes	Corning	352054
50 mL Falcon Tubes	Sarstedt	62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker	Boekel Scientific	260250
Olympus Inverted microscop CK30	Olympus	CK30	for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence	Nikon	Axiovert 200	for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane	Milipore Sigma	UFC910024	For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer)	pluriSelect	SKU 43-50020	For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer	Fisher Scientific	352340	For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)	Millipore Sigma	M8937-100EA	ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J	Jackson Lab	#000664	For organoid culture