使用磁纳米粒子转导病毒载体进行冷冻切片的原小鼠肠道器官的遗传工程

摘要

我们描述了分步说明:1) 使用磁性纳米粒子对慢透或抗逆转录病毒转导进行高效工程肠道有机体,以及 2) 从工程有机物生成冷冻部分。这种方法提供了一个强大的工具,有效地改变基因表达在有机体的研究下游效应。

摘要

肠道器官培养为研究肠道干细胞和体外密码生物学提供了独特的机会,尽管操纵器官基因表达的有效方法在这一领域进展有限。虽然CRISPR/Cas9技术允许对细胞进行精确的基因组编辑,以便产生有机体,但这一策略需要通过序列分析进行广泛的选择和筛选,这既耗时又昂贵。在这里,我们提供了一个详细的方案,为有效的病毒转导肠道器官。这种方法快速、高效,从而减少了CRISPR/Cas9技术固有的时间和费用。我们还提出了一个协议,从完整的有机体培养物中生成冷冻部分,以便用免疫组织化学或免疫荧光染色进行进一步分析,可用于确认基因表达或沉默。在成功转导病毒载体进行基因表达或沉默后,可迅速评估肠道干细胞和密码功能。虽然大多数器官研究采用体外检测,但有机体也可以传送给小鼠进行体内功能分析。此外,我们的方法有利于预测对药物的治疗反应,因为目前可用的疗法通常通过调节基因表达或蛋白质功能而不是改变基因组来发挥作用。

引言

长时间将小鼠或人类墓穴细胞培养为小肠或结肠的三维 (3D) 有机体的能力提供了重大突破,因为这些培养物显示了肠道上皮在体内的决定性特征^1,2,3.从原发墓穴衍生的有机体能够自我更新和自我组织,表现出与其原产组织相似的细胞功能。事实上,有机物不仅概括了体内墓穴的结构组织,而且概括了许多分子特征,为研究正常生物学和疾病状态提供了有用的工具。为了说明,器官研究揭示了参与组织再生1、2、3、4、5以及可增强功能的药物的新型分子途径。在病理设置6,⁷。

对肠道干细胞的研究特别感兴趣,因为肠道内衬是高度再生的哺乳动物组织之一,每3-5天更新一次,以保护生物体免受细菌、毒素和其他病原体的侵害。肠道流明。肠道干细胞(ISCs)负责这种非凡的再生能力,从而为研究成人干细胞功能1,2提供了独特的范例。在小鼠的沿线追踪实验表明,分离的Lgr5阳性干细胞可以培养出来,在体外产生3D器官或"迷你胃",在体外它们密切镜像体内的同类。有机体培养也可以从肠道密码细胞分离物中衍生,这些分离物由祖细胞、ISC 和 Paneth 细胞组成,后者构成体内的上皮利基细胞。事实上,来自原发性肠道密码细胞的有机体培养已经演变为一种相对常规的技术,在大多数实验室使用广泛可用的试剂很容易实现。该模型还适用于RNA测序(RNA-Seq)的基因表达定量分析,以及通过质谱法、免疫组织化学或免疫荧光染色2、4、8对蛋白质进行定量分析。此外,功能遗传学可以使用功能增益(基因过度表达或激活突变基因的表达)或功能丧失(基因沉默或功能丧失突变的表达)方法2。

重要的是,标准质粒DNA或多蛋白的病毒转导方案的低效率和高毒性仍然是该领域的一个主要障碍。虽然CRISPR/Cas9技术允许精确的基因组编辑,这种方法需要耗时的选择,然后是序列验证9。在这里,我们提出了一个病毒转导方案,用于初级肠道器官,通过结合到磁性纳米粒子和应用磁场来优化病毒颗粒的传递。对先前协议4、5、10、11、12、13作了关键修改,并提出提高效率的建议。我们还描述了一种从3D母体凝胶(今称为基底膜基质或基质)中培养的完整有机物生成冷冻部分的方法,以便通过免疫组织化学或免疫荧光染色进行进一步分析。

研究方案

该协议得到了约翰霍普金斯医疗机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。该协议是从以前发布的方法10,11,12,13修改。

1. 试剂制备

1. 提前几个小时准备新鲜的293T介质,在水浴中加热至37°C,使用前至少10分钟(表1)。
2. 准备质粒DNA2,13,14用于病毒包装。(表2)。
3. 获取所有其他必需材料 (材料表).

2. 伦蒂病毒或逆转录病毒颗粒生产

1. 人类胚胎肾 (HEK) 293T 细胞播种(第1天)
   1. 在室温(RT)下涂上溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS;10 mL/盘)中的50微克/mL多-D-莱盐水,准备一个150毫米培养皿。
   2. 去除磷酸盐缓冲盐水 (PBS)/多 D-莱辛,用 5 mL PBS 洗涤涂层盘两次。
   3. 种子293T细胞(8\u201210 x10 6)在293T介质(表1)的总体积为15 mL。
   4. 在标准组织培养箱(37°C,5% CO₂)中一夜之间培养293T细胞。
2. HEK 293T 细胞转染(第 2 天)
   1. 一旦细胞达到70-80%汇合(通常在播种8\u201210 x 10⁶细胞后约24小时)进行转染。
   2. 使用一种有效的方法制备转染混合物,如商业阳离子脂质体配方(表1\u20122,材料表)2。
      1. 稀释扁病毒DNA在1.2 mL转染介质中构造12(共+24 μg质粒DNA),在1.5 mL管(材料表)的RT孵育5分钟。
      2. 在1.2 mL转染介质(材料表)中稀释转染摄政(36 μL),并根据制造商的说明在5mL管中孵育5分钟。
      3. 将慢透病毒试剂(步骤 2.2.2.1)添加到转染试剂(步骤 2.2.2.2),并使用 5 mL 移液器缓慢上下移液轻轻混合。
      4. 在RT孵育混合物20分钟。
   3. 用5mL转染介质轻轻清洗293T细胞,用10mL转染介质代替。
   4. 将DNA-脂质复合物(从步骤2.2.2.3)滴入293T细胞的培养基,通过水平和垂直方向移动,仔细混合培养皿中的介质,以确保每道菜中DNA-脂质复合物的均匀分布。
   5. 在标准组织培养箱(37°C,5% CO₂)中孵育6小时。
   6. 孵育后,用20mL新鲜病毒收集介质(表1)替换培养基。
3. 病毒收集(第 3 天\u20125)
   1. 将病毒培养基收集在50 mL管中,并储存在4°C冰箱中以进一步浓缩。
   2. 每24小时更换20 mL的新鲜病毒收集介质,并隔夜(±24小时)培养。在接下来的 2 天内重复媒体收集(第 4 天\u20125)。
   3. 确保第 5 天之后收集的介质总体积为 ± 60 mL(20 mL/天 x 3 天)。
4. 病毒浓度(第5天)
   1. 在 400 x g 下将收集的介质 (60 mL) 离心 5 分钟。然后,通过过滤器(0.45 μm 孔隙)将上清液排出,以清除任何细胞碎屑。
5. 在离心过滤单元(材料表)中加入15 mL的过滤病毒介质,以浓缩病毒。在 2,500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟。由于病毒无法通过此过滤器,它将集中在过滤器的上腔。
   1. 从管(底部腔室)吸出流量,并添加另外15 mL的剩余病毒收集介质上清液到同一离心过滤器单元。如上所述(2,500 x g在 4°C 下 15 分钟)从上清液中浓缩额外的病毒。
   2. 在单个转导板中对 60 mL 介质使用相同的过滤器重复此过程,直到达到所需的浓度(±100 倍)。
      注意:我们通常将 +60 mL 的病毒收集介质浓缩到 +600 μL。
   3. 使用 1 mL 移液器从过滤器上腔中取出浓缩病毒,然后等分并储存在 1.5 mL 管 (50μu201260 μL/管) 中,以 -80 °C 供以后使用。储存浓缩颗粒长达6~u201212个月。

3. 隔离墓穴

1. 根据当地的IACUC指南,使用CO2对小鼠实施安乐死。
2. 将安乐死动物放在其背上,用70%乙醇喷洒,洗腹部。
3. 执行从胸骨到腹股沟的纵向中线切口,先切开皮肤,然后切开皮下组织。
4. 取出小肠从胃到cecum。
5. 确定小肠内感兴趣的区域;墓穴可以从十二指肠、十二指肠和回肠中分离出来。
6. 使用10 mL注射器,用密码分离缓冲液冲洗分离的小肠(预冷冻PBS含有1 mM二硫尿酸醇(DTT),1%青霉素/链霉素(无Ca²⁺和Mg 2+))在10厘米组织培养盘中(表) 1)
7. 取出周围脂肪组织,在无菌玻璃板上纵向打开或"圆角"肠道组织(15 厘米 x 15 厘米)。
8. 使用细胞刮刀轻轻刮掉肠道上皮绒。
9. 将小肠切成2\u20123厘米长度的截面。
10. 使用扁平钳子(116 mm)将组织转移到含有预冷却PBS的15 mL管中。用手大力摇动30s(将管子朝相反方向移动+60次),洗净组织碎片。
11. 刷新 PBS 并重复洗涤,直到 PBS 变清楚。
    注意:我们通常清洗片段 2\u20123 次。
12. 一旦PBS清除,在轨道摇床上以中等速度在4°C下孵育组织,在含有10 mL的隐解分离缓冲液(表1)中孵育组织10分钟。
13. 用手用力摇动管 30 s(相反方向 = 60 次),并使用扁平钳将组织转移到另一根包含 10 mL 的隐解分离缓冲液的 15 mL 锥形管。在冰上孵育这个分数。不要使用第一部分的有机体培养,因为它主要包含绒面。
14. 重复步骤 3.11\u20123.13 3\u20124 次,收集每个分数并将其放在冰上。
15. 通过在倒置显微镜(4x)下扫描每个馏分的200μL样本,选择富含最大百分比的肠道密码的分数。按前面描述的典型形态(图1A)10识别墓穴。
    注:它们的形状呈圆形或椭圆形,并包含颗粒状的Paneth细胞。相反,villi 是手指状结构,缺少颗粒状的 Paneth 细胞(图 1B)。
16. 如果需要,通过 40 μm 细胞滤网传递所选分数,以获得大小相似的密码。或者,如果小鼠被交叉到EGFP-Lgr5+背景或其他合适的模型,能够识别Lgr5+细胞2,则分离出基于绿色荧光蛋白(GFP)流式细胞测定的Lgr5+干细胞。
17. 计算所选分数中的密码总数,如下所示。
    1. 将所选分数的移液器 50 μL 放入细胞计,并使用倒置光学显微镜 (4x) 计算密码数。使用 48 孔板进行转导实验时,每孔放置 ±100 个密码,其中 3\u20126 孔将按实验条件转导,用于基因沉默或过度表达。
    2. 根据每 50 μL 的密码数,计算所需的密码解散缓冲液的体积,并将该体积转移到 1.5 mL 管中。
       注意:例如,每 50 μL 计算 10 个密码,300 个墓穴需要 6 x 50 μL 或 300 μL。
18. 在 300 x g的 1.5 mL 管中将密码离心 5 分钟。
19. 小心地丢弃上清液,轻轻移掉上部液体层,并在100μL的生长因子中重新悬浮颗粒,减少冰基膜基质(材料表)。
20. 将含基质的墓穴播种到37°C预加热的48孔板(30 μL/孔,+100个基点/孔)。在标准组织培养箱中孵育板5\u201215分钟,允许基质凝胶化(37°C,5%CO₂)。
21. 用250μL有机体培养基(ENR)培养基覆盖每个凝胶(表1),并将48孔板放回标准组织培养箱(37°C,5%CO_2)。检查24小时后,为小,圆形,囊性形状的墓穴组织的培养物;芽将在2\u20125天后形成。
22. 每 3 天轻轻更换一次 ENR 介质。用柔和的吸力拆下旧的 ENR 介质,在更换介质时注意不要触摸基质。
23. 通道有机体培养每4\u20127天如前^所述11。

4. 有机体碎片制备

1. 转导有机体一旦形成(在1\u20122周内)或通过后。对于单个转导实验,根据 +100_u2012200 有机体/孔或 +200\u2012600 有机物,在 48 孔板中制备 200\u2012600 有机体。每个条件。
2. 与250μL转导介质(表1)交换ENR和转导介质中的培养,为期3天或更长时间,或直到器官采用囊状形态。在转导介质中同时包括Wnt3a和ROCK抑制剂(Y27632),以增加茎和Paneth细胞的数量;烟酰胺(尼古丁)提高培养效率(见表1中的转导介质)。
3. 使用 1 mL 移液器用介质和移液器尖端机械地破裂圆顶状基底膜基质结构。
4. 将有机物和介质转移到无菌的 1.5 mL 管中。
5. 使用 200 μL 移液器进行移液 ,以机械方式进一步破坏基质。10μu201215 次。
6. 在 RT 下以 500 x g将有机体碎片离心 5 分钟。
7. 小心使用移液器丢弃上清液,并将颗粒重新悬浮在 1 mL DMEM/F12 介质中(表 1)。
8. 加入分酶I(6 μL,10毫克/mL)和DNase I(2.5 μL,10毫克/mL)。使用 1 mL 移液轻轻移液,将混合良好。
9. 在37°C下孵育有机体20分钟,在1.5 mL管中。
10. 加入500μL的ENR介质以终止解散反应;ENR 中的血清终止反应。
11. 通过20μm细胞过滤器将有机体细胞传递,并在400 x g下将有机体片段离心5分钟。
12. 用150μL转导介质重新悬浮有机体片段(表1)。

5. 病毒转化的有机物或隐细胞的遗传工程

注:参见图2。

1. 种子有机细胞簇与200μL转导介质/孔在48孔板和孵育在标准组织培养箱(37°C,5%CO₂)。或者,将新鲜分离的墓穴细胞(+1,000个密码)放入200μL转导介质/孔中,放入48孔板中,孵育在标准组织培养箱(37°C,5%CO_2)。
2. 用于转导的病毒解冻小瓶,允许在48孔板中每孔转导每孔50μL的浓缩病毒,或24孔板中每孔100μL的浓缩病毒转导。
3. 在1.5 mL管中用12μL的磁性纳米颗粒溶液孵育病毒15分钟(表3)。
4. 将磁性纳米颗粒溶液/病毒混合物添加到要转导的细胞中。
5. 将细胞培养板放在磁板上,在标准组织培养箱(37°C,5% CO₂)中孵育至少2小时(最多+6小时)。

6. 受感染的有机体碎片的播种

1. 将受感染的有机体细胞簇和转导介质从每个孔转移到1.5 mL管中。
2. 500 x g离心 5 分钟。
3. 用温和的吸力丢弃上清液,将含有颗粒的管子冷却5分钟。
4. 加入120 μL的基底膜基质,通过慢慢上下移液重新悬浮颗粒。
5. 种子30μL将基质细胞混合物滴入新的48孔板中。
6. 在 37°C 孵育板 5\u201215 分钟,直到基质凝固。
7. 向每口井添加转导介质,并在标准组织培养箱中孵育3~u20124天(37°C,CO₂5%)。
8. 3\u20124天后,在光学显微镜(10x)下检查培养物,以确保细胞簇组织成有机体结构。然后,用250μL ENR介质轻轻更换转导介质。
9. 每 3\u20124 天更换一次介质。

7. 选择(如适用)

1. 2\u20123天后,在适当情况下将相关抗生素或激素加入转导培养基中进行选择。
   注:我们使用紫霉素(2 μg/mL)来选择扁豆转导,因为质粒含有一个紫霉素抗基因2,14。

8. 成功转导和基因表达或沉默的确认

1. 如果使用FUGW慢病毒2,14,通过荧光显微镜或流式细胞测量测量GFP信号来估计转导效率。
2. 使用定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)验证基因过度表达或沉默,用于对照和实验有机体培养中mRNA的定量比较。
3. 通过西布洛特或免疫^染色2确认蛋白质编码基因表达或沉默的蛋白质水平。

9. 地下室膜基质中的有机体冷冻剖分

注:参见图3。

1. 通过温和的吸力去除ENR介质,小心不要扰动地下室膜基质,用500μL的PBS轻轻洗涤一次。
2. 用1.0 mL的4%甲醛(PFA)溶液(材料表)在RT上固定有机物30分钟。
3. 通过吸力去除 PFA,用 1 mL PBS 轻轻洗涤两次。
4. 通过吸力去除PBS,并在每个样品中加入1.0 mL的30%蔗糖缓冲液。在冷室、冰箱或冰上孵育蔗糖中固定有机物1小时,在4°C下脱水样品。
5. 通过吸出蔗糖缓冲液,并添加足够多的嵌入化合物(材料表),以覆盖每个井中的基质层(+300 μL/井)。
6. 在 RT 孵育 5 分钟。
7. 将样品放入-80°C冷冻室10分钟,或直到嵌入化合物变成固体和白色。
8. 将带有冷冻嵌入化合物的盘子放在RT处,以便沿边缘对化合物进行最小程度的熔化。使用手术刀将方块与井壁隔开。
9. 使用钳子去除基体嵌入复合块,并将其放入试样块(例如低温),快速工作以防止熔化。
10. 用嵌入化合物完全填充模具,并在-80°C冷冻30分钟。
11. 使用块是切片或存储在-80°C冰柜进一步使用。

结果

在这里,我们描述了一种快速和高效的转导技术,该技术利用暴露于磁场的磁性纳米粒子,将慢病毒输送到感兴趣的细胞。利用现成的工具,我们不仅应用了这种方法来转导新鲜分离的密码细胞(图1A),还应用了有机物(图2)和其他耐火细胞,以用于更常规的转导方法。Lentiviral粒子可以很容易地与磁性纳米粒子结合,因此,通过使用磁板施加...

讨论

成人肠道上皮作为有机物的初级培养物为研究干细胞功能、肠道上皮平衡和病理学1、2、3、病理的分子机制提供了强有力的工具。 ⁴.虽然CRISPR/Cas9技术可用于基因工程有机物9,但它受到基于序列分析的广泛筛选和选择所需的广泛筛选和选择的限制。该协议的目的是提供清晰和简洁的说...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Base medium for 293T cells
DMEM/F12+	Thermo Fisher Scientific	12634010	Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV	Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific	15140122	Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	10010049	A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140050	Component of organoid culture medium
GlutamaxII	Thermo Fisher Scientific	35050061	Component of organoid culture medium
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080	Component of organoid culture medium
EGF	Millipore Sigma	E9644	Component of organoid culture medium
Noggin	Peprotech	250-38 B	Component of organoid culture medium
R-spondin	R&D	7150-RS-025/CF	Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin	Millipore Sigma	I9278-5ml	Component of organoid culture medium
Nicotinamide	Millipore Sigma	N3376-100G	Component of Transduction medium
Wnt3A	R&D	5036-WN-010	Component of Transduction medium
Y27632	Millipore Sigma	Y0503-1MG	Component of Transduction medium
0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol)	Thermo Fisher Scientific	R0861	Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I	Millipore Sigma	D4818-2MG	Component of organoid digestion buffer
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced)	Corning	356231	Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L	Oz Biosiences	RL40200	Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate	Oz Biosiences	MF10000	Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine	Millipore Sigma	A-003-E	Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution	Boster	AR1068	Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound	Thermo Fisher Scientific	4583S	For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes	Corning	352054
50 mL Falcon Tubes	Sarstedt	62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker	Boekel Scientific	260250
Olympus Inverted microscop CK30	Olympus	CK30	for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence	Nikon	Axiovert 200	for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane	Milipore Sigma	UFC910024	For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer)	pluriSelect	SKU 43-50020	For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer	Fisher Scientific	352340	For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)	Millipore Sigma	M8937-100EA	ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J	Jackson Lab	#000664	For organoid culture