JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.

Abstract

Microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ، وهي أول المستجيبين لالتهاب أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي. وقد كشفت الأبحاث الأخيرة ميكروجليا لتكون قادرة على تولي تعمل كل برو-التهابات والالتهابات، ودينامية. M1 (برو-التهابات) و M2 (برو الترميمي) تعمل تلعب دوراً مهما في الظروف نيوروينفلاماتوري مثل إصابة في الدماغ قبل الولادة، واختلاف معرض الوظائف استجابة لبعض المؤثرات البيئية. وقد لوحظ تحوير microglial التنشيط لإضفاء نيوروبروتيكتيون مما يوحي microglia قد الإمكانات العلاجية في إصابة في المخ. ومع ذلك، مطلوب إجراء مزيد من البحوث لتحسين فهم دور microglia في المرض، وهذا البروتوكول يسهل أن. البروتوكول هو موضح أدناه يجمع بين عملية الطرد المركزي تدرج كثافة الحد من الحطام الخلوية، مع فصل المغناطيسية، إنتاج عينة نقية جداً من خلايا microglial الأولية التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب في المختبر ، دون الحاجة إلى 2-3 أسابيع استزراع. بالإضافة إلى ذلك، وصف الخطوات التي تسفر عن بيانات وظيفية قوية حول microglia، مساعدة دراسات لتحسين فهمنا للاستقطاب وفتيلة من هذه الخلايا، التي لها آثار قوية في مجال الطب التجديدي.

Introduction

الأضرار التي حصلت خلال فترة ما حول الولادة من الالتهاب، التاكسج احتباس الدم والنزيف يمكن أن يكون صفيف عقابيل على المدى الطويل. هي نظرية الفسيولوجيا المرضية المعقدة لإصابة في الدماغ قبل الولادة إلى إشراك التهاب والاسكيميه التي تلت موت الخلايا العصبية ومحواري1. الاستجابة المناعية الفطرية دوراً هاما في سلسلة الأحداث التي أدت إلى إصابة2.

Microglia، الخلايا المناعية المقيمين داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS)، هي أول المستجيبين لإصابة3. ميكروجليا أنواع البلاستيك الخلية مع القدرة على أن تكون وقائية أو السامة، سواء التي تعتمد على البيئة4. أنهم متورطون في إنزيمية، البلعمه، مستضد العرض التقديمي وإنتاج السيتوكينات والأكسجين التفاعلية الأنواع4،5. ميكروجليا مسن باستمرار مسح البيئة ويتم تنشيطها بوجود مادة ضارة أو أجنبية4. ويؤدي التنشيط إلى استجابة برو تحريضية، أهمية حاسمة في حماية الجهاز العصبي المركزي4. هذه microglia النمط الظاهري "برو-التحريضية" M1 تشارك أساسا في مستضد العرض التقديمي والموت من مسببات الأمراض4. رغم الدور الحاسم للاستجابة الالتهابية في نيوروبروتيكشن، التهاب غير المنضبط أو لفترات طويلة يمكن أن تكون ضارة وتؤدي إلى تلف الخلايا العصبية4. ومع ذلك، عند التعرض لبعض المؤثرات البيئية، يمكن أن يحمل microglia النمط الظاهري للالتهابات. هذه microglia M2 برو الترميمي لها دور حاسم في التئام الجروح وإصلاح6، الإفراج عن مجموعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين للذوبان أن التهاب downregulate، زيادة البلعمه وتعزيز إصلاح4، 7-أدوار microglia متنوعة وتشمل التمايز oligodendrocyte القيادة أثناء إعادة-مييلينيشن8، حماية الخلايا العصبية من خلال استنزاف الأوكسجين والجلوكوز في السكتة الدماغية نماذج9 وتعزيز ثمرة نورت في إصابات النخاع الشوكي ونماذج10.

دراسة هذه الخلايا الدبقية يمثل جانبا مهما في فهم ومعالجة الرد على نيوروينفلاميشن. وصف بروتوكول يسمح للمزيد من التحقيق في القدرة العلاجية للتحوير microglia في اضطرابات نيوروينفلاماتوري.

وقد لوحظ تحوير التنشيط microglial نحو دور محصن في طائفة من الظروف11،،من1213. وبالتالي، تحسين الفهم الحالي ومواصلة دراسة تحوير microglial التنشيط الحرجة، التي تتطلب استخدام نماذج مختلفة بما في ذلك على حد سواء في المختبر و في فيفو. في المختبر الدراسات تمثل أداة هامة نظراً لزيادة كفاءتها وأقل تكلفة والقدرة على التحقيق في نسبة سكان خلية معزولة.

وهناك مجموعة من البروتوكولات المذكورة في الأدب لعزل ميكروجليا من العقول مورين، التحدي المتمثل في كفاءة إنتاج عالية غلة عينة مع بقاء جيدة ودرجة نقاء عالية. أساليب شائعة لعزل microglia الأولية بالفصل المغناطيسي وتهز المطول للثقافات الدبقية مختلطة. من خلال تجربة شخصية، ووجد أن هناك درجة عالية من الحطام الخلوية التي أعاقت العمود المغناطيسي. وبالتالي، استخدم البروتوكول التالي، الذي يتضمن خطوة الطرد المركزي تدرج كثافة أولية متبوعاً بالفصل المغناطيسي CD11b. وقد تم تحسين البروتوكول، المذكورة أدناه لإنتاج عينة نقية جداً بكميات كافية. فإنه من المفيد درجة نقاء عالية وفترة زمنية قصيرة بسبب — واحد يمكن إجراء فحوصات خلال يومين دون الحاجة إلى الثقافة لمدة 2-3 أسابيع. هذا البروتوكول يمكن تكييفها محتملة لعزل astrocytes موريني الأولية.

Protocol

الإجراءات التالية التي أقرتها "لجنة الأخلاقيات الحيوان" في جامعة موناش. واستخدمت الفئران C57Bl6/ي ف-3-6 الوليد غير المعالجة الصحية لتوليد نتائج الممثل.

1-الانزيمية الهضم

ملاحظة: من المهم النظر في العقم عند عزل واستزراع الخلايا الأولية. حين ضمان البيئة العقيمة، قدر الإمكان، بالتشريح الأولى وحصاد العقول مورين يمكن أن تكتمل خارج غطاء تدفق لامينال، مع الخطوات اللاحقة كلها داخل غطاء الاندفاق الصفحي.

  1. باستخدام أدوات معقمة، euthanize الماوس بخلع سرطان عنق الرحم، وقطع رأس الحيوان وشطف مع الإيثانول 100%. باستخدام مقص معقم صغيرة، جعل شقوق صغيرة على طول الجانبين الأيمن والأيسر من الرأس. في هذا العصر، قشور الجلد بعيداً بسهولة. استخدام نصائح الملقط المنحنية، الشريحة بلطف الأنسجة نحو المنصة لفضح الجمجمة، بما في ذلك في بريجما.
  2. إدراج غيض مقص في افتتاح القناة الشوكية وجعل شق أفقي لقناة الإذن. إجراء شق على طول خياطة السهمي بريجما، مشيراً بلطف طرف المقص صعودا لمنع الأضرار بالدماغ. إدراج تلميح مقص في بريجما وإجراء شقوق جانبية على الجانبين الأيمن والأيسر من الرأس على طول خياطة كرونال.
  3. برفق باستخدام الملقط، قشر خارج الجمجمة لفضح الدماغ. للقيام بذلك، فهم حواف الجمجمة كشفها بواسطة الشق الأفقي، واجذب الجمجمة إلى الجانب. وينبغي أن قشر الجمجمة بعيداً بسهولة. استخدام الملقط المنحنية، حلج القطن بلطف تحت الدماغ لإزالته.
  4. الدماغ في حاوية معقمة 5 مل، يغسل 2-3 مرات مع وسائل الإعلام يغسل المثلج (تعديل النسر المتوسطة (دميم الجلوكوز منخفضة دولبيكو) وتستكمل مع 1% البنسلين-ستربتوميسين)، حوالي 5 مل وسائل الإعلام كل المياه والصرف الصحي، لإزالة الدم.
  5. في غطاء تدفق الهواء الصفحي، وضع محتويات الحاوية 5 مل في طبق بتري صغيرة (35 ملم)، ويستريح على الجليد. استخدام شفرة مشرط معقم أو مقص العقيمة، إزالة المخيخ ولمبة شمي. جعل خط الوسط قطع لفصل نصفي.
  6. قشر بعيداً بعناية الطبقة سحائي مع الملقط غرامة، مع الحرص على عدم الأضرار كورتيسيس. تحديد الطبقة سحائي كطبقة رقيقة جداً من الخلايا مع مسحه حمراء على سطح الدماغ، ومع الأوعية الدموية مرئية. حفظ الدماغ البارد ضروري لإزالة السحايا السليم. إذا كانت الطبقة سحائي فواصل، مواصلة تقشير بعيداً من شظايا ممزقة حتى تتم إزالته تماما.
  7. نقل في نصفي الكرة الأرضية إلى صحن بتري صغير جديد (على الجليد) والتعبئة مع الغسيل وسائل الإعلام. ختم المخ إلى قطع صغيرة بدون مشرط عقيم بليد/مقص.
    ملاحظة: ينبغي أن تكون هذه ~ 1 مم2 في الحجم، وينبغي الحرص لا قطع منها إلى قطع صغيرة جداً، وهذا قد يقلل من المحصول.
  8. إضافة 100 ميليلتر غراء (17 ش/mg الأسهم) و 150 ميليلتر الدناز أنا في وسائط الإعلام، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية
  9. وبعد عملية الهضم، تريتوراتي الأنسجة باستخدام ماصة P1000. إذا قطع الأنسجة تكون كبيرة جداً للدخول الماصة، النظر في استخدام زوج أو مقص معقم لتوسيع تلميح ماصة. أثناء هذه العملية، تأخذ الحرص على عدم إدخال فقاعات في وسائل الإعلام، وهذا قد يقلل من جدوى خلية.

2. إزالة الأنقاض المايلين

  1. تحت غطاء الاندفاق الصفحي استخدام المعدات المعقمة، وإعداد أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة 100 ميكرومتر خلية، كل في الدماغ. صب محتويات طبق بيتري، يحتوي على خلاصة القطع المتوسطة والدماغ على مصفاة. دفع عن طريق قطعة الدماغ باستخدام المكبس من المحاقن المعقمة 3 مل في حركة طحن حتى يكون هناك لا أنسجة أكثر وضوحاً. وبعد الهضم، وأنسجة المخ ينبغي أن ينهار بسهولة.
  2. بشكل مستمر يجب غسل الفلتر مع وسائط الإعلام، والمياه والصرف الصحي التي تتصدر حتى مصفاة الخلية طوال هذه العملية. هذا سوف تغسل من خلال أية خلايا محاصرين في مصفاة.
    ملاحظة: ينبغي أن يتم هذا حتى يكون هناك تقريبا ~ 15 مل في الأنبوب. هذا هو لضمان أن المصفاة يتم غسلها بما فيه الكفاية عن طريق وتعظيم كمية الخلايا التي تم جمعها.
  3. الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في ز 500 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وخلال هذا الوقت، إعداد المتوسطة الكثافة التدرج كما هو موضح.
    1. إعداد بركل الأسهم متساوي التوتر (SIP)، التي هي وسيلة التدرج كثافة استخدامها. القيام بذلك عن طريق إضافة 9:1 نسبة الكثافة المتوسطة الانحدار إلى 10 × العقيمة هانكس الملح حل متوازن (حبس).
    2. إعداد التدرجات ك 30 المسبار المسبار في دميم % و 70% في 1 x HBSS. على سبيل المثال، لإعداد 10 مل 30% SIP، أضف 3 مل المسبار إلى 7 مل دميم.
  4. نضح المادة طافية من أنابيب مخروطية الشكل وريسوسبيند بيليه الخلية مع مل 8% 30 المسبار في دميم. نقل المجلد كامل إلى أنبوب مخروطي طازجة 15 مل.
  5. الأساس الذي تقوم عليه الحل المسبار 70%. للقيام بذلك، ملء ماصة نقل مع 70% المسبار والدفع عن طريق ماصة نقل إلى الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية بعناية. مجرد التلميح يقع بالقرب من الأسفل، دفع بلطف من خلال محتويات ماصة نقل.
    ملاحظة: القيام بذلك ببطء حتى لا يؤدي إلى تعطيل الواجهة 30/70. يجب أن يكون هناك خط واضح يفصل بين الطبقتين.
  6. الطرد المركزي الطبقات المسبار، بما في ذلك الخلايا، في 650 x ز مع الفرامل 0 وتسريع 4، لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: من الضروري لإكمال وتدور مع الفرامل قبالة والسماح لأجهزة الطرد المركزي تأتي ببطء إلى توقف تطبيق الفرامل سيتم تعطيل في الطور البيني وتخفيض هائل في جمع الخلايا بين الطبقات المسبار.
  7. نضح الحطام الخلوية في الجزء العلوي من الأنبوب، وإزالة ما يقرب من 4 مل وسائل الإعلام من الأعلى. وسوف يخفف هذا من إزالة الخلايا وحيدات النوى في الخطوة التالية. استخدام ماصة P1000، بعناية أقل تلميح ماصة صوب الطور البيني. عزل الخلايا وحيدات النوى من واجهة متوسطة الانحدار كثافة 30/70. جمع حوالي 3 مل من واجهة غائم ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. وفي أعقاب ذلك، يضعف المخلوط مع مل 9 من هبس للمساعدة في إزالة المتوسطة الكثافة المتدرجة.
  8. الطرد المركزي الطور البيني المتوسط التدرج في كثافة مخففة، وتحتوي على خلايا وحيدات النوى في 500 غرام x للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية وريسوسبيند مع 1 مل النمو المتوسطة (دميم تستكمل مع الصادات المصل و 1% البقري الجنين 10%). وفي أعقاب ذلك، وصمة عار الخلايا ريسوسبينديد مع تريبان الأزرق وأداء عدد خلايا استخدام هايموسيتوميتير.

3-المغناطيسية تنشيط الخلية الفرز

ملاحظة: يتم تعديل هذه الخطوات من البروتوكول الصانعين.

  1. الطرد المركزي الخلايا وحيدات النوى التي جمعت في 300 غرام x لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة متوسط النمو هذا سوف تتداخل مع العزل المغناطيسي. باستخدام نفس عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.8، المنبسطة ريسوسبيند في 1 × 108 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني (Ca++ وملغ++ الحرة) التي تحتوي على يدتا FBS ومم 1 2%، ضمن نطاق حجم 0.1-2.5 مل.
  2. إضافة حجم الخلايا المنواه كاملة في برنامج تلفزيوني من الخطوة السابقة إلى أنبوب أسفل جولة البوليستيرين طازجة 5 مل (12 × 75 مم). إضافة 50 ميليلتر CD11b PE كاشف الوسم كل 1 مل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
  3. إضافة ميليلتر 70 من التحديد كوكتيل (مجموعة من الأجسام المضادة ضد CD11b في برنامج تلفزيوني) كل 1 مل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
  4. خلط الجسيمات المغناطيسية التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً أكثر من 5 مرات. إضافة 50 ميليلتر/مل للعينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق محمية من الضوء.
    ملاحظة: هذه الجسيمات ثم تشكيل مجمع تيتراميريك مع الأجسام المضادة وسوف تحصل على إرفاق العمود المغناطيسية.
  5. إذا كان الحجم الإجمالي الخليط خلية أقل من 2.5 مل، أعلى تصل إلى هذا الحجم مع برنامج تلفزيوني (Ca++ وملغ++ الحرة) التي تحتوي على يدتا FBS ومم 1 2%، ومزيج من بيبيتينج بلطف 2-3 مرات. ضع الأنبوب (بدون غطاء) في المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. في حركة مستمرة واحدة، تماما عكس المغناطيس الذي يحتوي على الأنبوب ق 2-3، صب قبالة المادة طافية. العودة المغناطيس إلى وضع مستقيم، وإزالة الأنبوب من المغناطيس. إعداد لتغسل الخلايا المتبقية من العمود.
    ملاحظة: المادة طافية يحتوي على خلايا غير موسومة وغير المرغوب فيها، التي تتم إزالتها بعكس الأنبوب في حين لا يزال في المغناطيس. الأنبوب يحتوي على Cd11b المرفقة+ الخلايا.
  7. غسل الخلايا بتكرار الخطوات من 3.5 و 3.6 أكثر مرتين. إذا كانت العينة أكبر من 1 مل، يوصي زيادة تكرار الخطوات 3.5 و 3.6.
  8. ريسوسبيند الخلايا في متوسط نمو المنشود. شطف إلى جانب السفينة، فضلا عن جمع (على سبيل المثال. أنبوب 15 مل) لجمع الخلايا من الجانبين من الأنبوب وتحقيق أقصى قدر من الغلال.

4-تحقق نقاء ميكروجليا

ملاحظة: microglia الأولية المعزولة من 3 لتر (n = مجموع 5 الحيوانات) تم التحقق منها عن طريق خلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتحديد نقاء لنتائج تمثيلية.

  1. خلايا الثقافة في قارورة T-25 في الأجلين المتوسط والنمو الذي يحتوي على 10% FBS بين عشية وضحاها، البذر في كثافة 1-2 × 106 خلايا كل قارورة.
  2. تغسل الخلايا في قوارير T-25 مع برنامج تلفزيوني 3 x لمدة 5 دقائق لإزالة أي وسائط النمو المتبقية التي قد تتداخل مع تريبسينيزيشن.
  3. إضافة 2 مل التربسين 0.25% لفصل الخلايا من قوارير. تأكد من أن حجم التربسين يكفي لتغطية كامل سطح قارورة. عقب لطيف يحوم من قارورة لضمان تغطية موحدة التربسين، احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. إخماد عملية تريبسينيزيشن بإضافة 2 مل وسائط النمو التي تحتوي على 10% FBS في قارورة.
  5. جمع المادة طافية تحتوي على خلايا تريبسينيزيد وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع الخلايا.
  6. إزالة المادة طافية تتضمن النمو المتوسطة والتربسين وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 500. القيام بعدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تنفيذ كتلة مستقبلات Fc بإضافة 50 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + 1 ميكروليتر FcR مانع الواحدة 5 × 106 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: كتلة مستقبلات Fc خطوة حاسمة في الإجراء المصبوغة لمنع الربط غير محددة من المناعية لمستقبلات Fc في الخلية محصنة ضد السكان. لا يؤثر هذا الحصار على ربط المصب من أجسام أخرى.
  8. إنهاء عملية التجميد بتمييع مع 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. وفي أعقاب ذلك، الطرد المركزي خليط تحتوي على الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. ريسوسبيند طازجة 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت.
  10. وضع معظم الخلايا (مثلاً إذا ريسوسبيندينج الخلايا في 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية، واستخدام 400 ميكروليتر) في أنبوب عينة. توزيع الخلايا المتبقية بين أنابيب التحكم وأعلى يصل إلى 100 ميكروليتر كل أنبوب التحكم (مثلاً لأنابيب التحكم 6، طرح ميكروليتر 16.67 في كل أنبوب التحكم وأعلى مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 83.33). جعل المجموعات (أنابيب التحكم بخط غامق) أونستينيد وواحد ملون (CD45، CD11b)، واحد يعيش الميت وصمة، فموس وأنابيب العينة.
  11. بيليه الخلايا في جميع الأنابيب التي سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  12. وصمة عار الخلايا في الأنبوب مع جسم ميكروليتر 1 من كل 100 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة الواحدة 5 × 106 خلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدم 50 ميكروليتر جسم كوكتيل إذا استخدمت أقل من 2 × 106 خلايا.
  13. تغسل الخلايا مع 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  14. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 300.
    ملاحظة: استخدم ~ 100 ميكروليتر إذا كان عدد خلايا أقل من 2 × 106.
  15. باستخدام تحليل التدفق الخلوي، التحديد الكمي للخلايا CD45منخفضة وإيجابية لصبغة CD11b. وهذه النسبة المئوية يناظر microglia الأولية المعزولة.

5-المناعي تلطيخ من Microglia الأولية

  1. لوحة الخلايا الموجودة في لوحة 96-جيدا في كثافة الخلايا 1 × 105 مع متوسط النمو واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. إزالة المادة طافية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لإزالة منهاج عمل بيجين مع ماصة P1000 15 دقيقة، ثم غسلها 3 مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.1% تريتون العاشر.
  4. كتلة للربط غير محددة مع ألبومين المصل البقري 3% ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان مع الأرنب 1-رابطة المحامين الدولية (1: 100) عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. وفي أعقاب ذلك، إزالة الخليط جسم الأولية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  6. احتضان مع ثانوية أرنب المضادة التجارة والنقل المتقارن (1: 200) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. وفي أعقاب ذلك، إزالة الخليط جسم الثانوية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. تحميل الشرائح مع الفلورسنت تصاعد المتوسطة والتقاط الصور باستخدام مجهر فلوري.

6-تحديد مقدار استخدام Microglia فرودو المقايسة

ملاحظة: يسمح الإنزيم فرودو لتحديد مستويات البلعمه في الخلايا المستزرعة. عند امتصاص عن طريق الالتقام، يزيد الاستيعاب في البيئة الحمضية أكثر مستويات الأسفار يصرف بيوبارتيكلي. ثم يمكن قياس مستويات الأسفار بنظام مراقبة الأصول الميدانية. يتم تعديل الخطوات التالية من البروتوكول الصانعين.

  1. ثقافة الخلايا في قارورة T-25 في الأجلين المتوسط والنمو بين عشية وضحاها، البذر في كثافة 1-2 × 106 خلايا كل قارورة. تغسل الخلايا في قوارير T-25 مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
  2. فصل الخلايا باستخدام 2 مل 0.25% التربسين. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. إخماد عملية تريبسينيسيشن بإضافة 2 مل وسائط النمو التي تحتوي على 10% FBS في قارورة.
  4. الطرد المركزي بتعليق خلية في ز x 500 لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الخلايا.
  5. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه المحتوية على microglia الأولية في الثقافة المتوسطة في 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، لوحة خلايا في صفيحة 96-جيدا على الأقل قبل يوم واحد وتهدف ل 1 × 105 خلايا قابلة للتطبيق للبئر الواحد في اليوم التحليل التي يتعين القيام بها.
  6. خلايا لوحة إلى لوحة 96-جيدا في 1 × 105 خلايا/حسنا، 100 ميكروليتر كل بئر. لوحة التحكم وآبار تجريبية في ثلاث نسخ، وترك بئر فارغة واحدة في مراقبة إيجابية لطرح خلفية الخلية لا تحكم.
  7. إضافة 100 ميكروليتر من وسائط النمو إلى الآبار التي تركت فارغة لخلفية الخلية لا الطرح.
    ملاحظة: مثل أي أخرى في المختبر المقايسة، عناصر التحكم المناسبة حيوية بالنسبة لدقة قراءات. جنبا إلى جنب مع لا-الخلية التحكم (خلفية القراءة)، كما تشمل مراقبة سلبية جيدا (المتقارن فرودو وأضاف ولكن على الجليد).
  8. وتغطي اللوحة واحتضانها ح 1 في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  9. تحضير آبار تجريبية عن طريق إضافة المنشطات والعلاج. إضافة عناصر التحكم المركبة (وسائط النمو فقط) إلى الآبار غير المعالجة.
    ملاحظة: Lipopolysaccharide 1 ميكروغرام/مل [منبه] والخلايا الظهارية amnion البشرية (حايك)-استخدمت وسائط الإعلام مكيفة [المعاملة] لتوليد نتائج تمثيلية.
  10. ذوبان الجليد قنينة صبغ مترافق، إضافة 2 مل الإقبال على المخزن المؤقت ودوامه بإيجاز. نقل محتويات الأنبوبة في أنبوب زجاج نظيفة و sonicate لمدة 5 دقائق، التأكد من أن الجزيئات موزعة بالتساوي.
  11. نضح المتوسطة الثقافة من آبار الميكروسكوبية واستبدالها بسرعة 100 ميكروليتر من تعليق صبغ. تغطية واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
    ملاحظة: تذكر لوصمة عار أنابيب التحكم كذلك.
  12. باستخدام تحليل التدفق الخلوي، التحديد الكمي للخلايا تلطيخ إيجابية بالنسبة الخرز فرودو مترافق ويقدم كنسبة مئوية (أصل) من نشاط فاجوسيتوسينج ميكروجليا.

7-التحديد الكمي للمبرمج Microglia بعد إهانة التحريضية

  1. كرر الخطوات 1-7 من القسم "تحقق نقاء microglia".
  2. وضع معظم الخلايا (مثلاً إذا كنت حراكه الخلايا في 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية، واستخدام 400 ميكروليتر) في أنبوب عينة. توزيع الخلايا المتبقية بين أنابيب التحكم وأعلى يصل إلى 100 ميكروليتر كل أنبوب التحكم (مثلاً لأنابيب التحكم 6، طرح ميكروليتر 16.67 في كل أنبوب التحكم وأعلى مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية 83.33 ميكروليتر). المجموعات (أنابيب التحكم بخط غامق): البقع أونستاينيد، واحد (أننيكسينف, يوديد Propidium)، واحد يعيش الميت وصمة عار، فموس، عينة أنابيب.
  3. بيليه الخلايا في جميع الأنابيب التي سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 5 دقائق.
  4. احتضان مع 1 ميكروليتر جسم/100 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت/5 × 106 خلايا لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدم 50 ميكروليتر إذا كان أقل من 2 × 106 خلايا.
  5. غسل الخلايا بإضافة 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 300.
    ملاحظة: ~ 100 ميكروليتر إذا كان عدد خلايا أقل من 2 × 106.
  7. التحديد الكمي للخلايا داخل كل رباعي (Q1: نخرية، Q2: الراحل apoptotic، Q3: قابلة للاستمرار، Q4: apoptotic المبكر).

النتائج

استخدام الأساليب المذكورة هنا، يمكن عزل السكان نقية من microglia ويمكن أن تكون جاهزة لتوصيف استخدام في المختبر ، ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. بادئ ذي بدء، ما يصل إلى 18 الحيوانات يمكن استخدام كل إعدام، مع غلة المتوقعة حوالي 450,000-600,000 ميكروجليال الخلايا. من المهم...

Discussion

Microglia لديها القدرة على أن برو والمضادة للالتهابات، غيرت من المحفزات البيئة. وقد أظهرت الدراسات السابقة يمكن أن يضفي تحوير microglia التنشيط نيوروبروتيكشن. قدرتها على توفير الحماية للخلايا العصبية وإصلاح الضرر يتطلب إجراء مزيد من البحوث مزيد من الفهم الحالي لهذه الخلايا معقدة. وهكذا، عزل microgli...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, low glucose, pyruvateGibco11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
DNaseI grade II from bovine pancreasSigma-Aldrich10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solutionSigma-AldrichP3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivatedGibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)Gibco14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)Gibco14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection KitStemCell Technologies18770EasySep magnet variant
EasySep magnetStemCell Technologies18000
EasySep BufferStemCell Technologies20144
Dulbecco's Phosphate buffered salineGibco14040182
Trypsin (2.5%) (10X)Gibco15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)BD Biosciences553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, SterileCorning352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent CapCorning431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8Sigma-AldrichL5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottomCorningCLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)Sigma-Aldrich158127
Triton-XSigma-AldrichX100
Rabbit Anti-Iba1Wako01919741 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS AntibodiesCompanyCatalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ConjugateThermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
Propodium Iodide solutionMiltenyi Biotech130-093-233

References

  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
  4. Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
  5. Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
  6. Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
  7. Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
  8. Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
  9. Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
  10. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
  11. Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
  12. Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
  13. Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
  15. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
  16. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
  17. Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
  18. Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132 Microglia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved