密度梯度离心法分离小鼠原发胶质细胞的研究

摘要

本文提出了一种从小鼠脑中分离原发胶质细胞的方法。这种技术有助于促进目前对神经系统状况的理解。将密度梯度离心和磁分离相结合, 产生高纯样品的充分屈服。此外, 我们概述了小胶质细胞的表征步骤。

摘要

小胶质细胞, 是大脑中的驻留免疫单元, 是中枢神经系统炎症或损伤的第一反应者。最近的研究发现小胶质细胞是动态的, 能够同时承担炎症和抗炎的表型。两种 M1 (亲炎症) 和 M2 (支持修复) 表型在诸如围产期脑损伤等 neuroinflammatory 条件下起着重要作用, 并表现出不同的功能, 以应对某些环境刺激。胶质激活的调节已被注意到赋予神经保护, 因此提示小胶质细胞可能有治疗潜力的脑损伤。然而, 需要更多的研究, 以更好地了解小胶质细胞在疾病中的作用, 这项议定书有利于这一点。下面描述的协议结合了密度梯度离心过程, 以减少细胞碎片, 与磁性分离, 产生一个高度纯净的主要胶质细胞样本, 可用于体外实验, 没有需要2-3 周的培养。此外, 这些表征步骤产生了关于小胶质细胞的强健的功能数据, 帮助研究, 以更好地了解这两种干细胞的极化和启动, 这在再生医学领域具有很强的意义。

引言

围产期期间从炎症、缺氧缺血性和出血中获得的损伤可以有一系列的长期后遗症。围产期脑损伤的复杂病理生理学理论涉及炎症和缺血与随后的神经和轴突死亡¹。先天免疫应答在导致伤害的一连串事件中起重要作用²。

小胶质细胞, 中枢神经系统 (CNS) 内的居民免疫单元, 是伤害³的第一个应答者。小胶质细胞是具有保护或毒性能力的塑料电池类型, 依赖于环境⁴。它们参与趋化、吞噬、抗原表达和细胞因子的产生和活性氧种类的^4,5。衰老小胶质细胞不断地对环境进行调查, 并由异物或有害物质的存在⁴激活。激活会导致一种支持炎症的响应, 在 CNS 保护⁴中至关重要。这些 M1 的 "亲炎" 表型小胶质细胞主要参与抗原表示和病原体的死亡⁴。尽管炎症反应在神经保护中起着关键作用, 但不受控制或长时间的炎症可能有害, 导致神经元损伤⁴。然而, 当暴露在某些环境刺激, 小胶质细胞可以表现出一种抗炎的表型。这些支持修复的 M2 小胶质细胞在伤口愈合和修复过程中具有关键作用⁶, 释放出一系列 downregulate 炎症、增加吞噬功能和促进修复^{4, 7}. 小胶质细胞的作用多种多样, 包括在髓鞘形成中驱动少^突胶质分化 8, 在中风模型的氧和葡萄糖耗尽^期间保护神经元9并促进突起在脊髓损伤模型¹⁰。

对这些胶质细胞的研究是理解和操作 neuroinflammation 反应的一个重要方面。所述的协议允许进一步研究小胶质细胞调制在 neuroinflammatory 疾病中的治疗潜力。

胶质激活对神经保护角色的调制被观察到了一系列条件^11,12,13。因此, 提高当前的理解和进一步研究胶质激活的调制是至关重要的, 需要使用包括体外和体内在内的各种模型。体外研究是一种重要的工具, 因为它们具有更高的效率、更低的成本和调查孤立细胞群体的能力。

文献中描述了一系列的协议, 用于从小鼠脑中分离小胶质细胞, 从而有效地生产出高产样品, 具有良好的生存能力和高纯度。常见的小胶质细胞的分离方法是通过磁分离和长时间晃动的混合胶质细胞培养。通过个人经验发现, 有很大程度的细胞碎片阻碍了磁柱。因此, 使用了下面的协议, 其中包括初始密度梯度离心步骤后, CD11b 磁分离。下面描述的协议已经过优化, 以产生足够数量的高度纯样本。它是有利的由于它的高纯度和短的时间周期-你可以在2天内进行化验, 而无需培养2-3 周。该协议有可能被改编为小鼠星形胶质细胞的分离。

研究方案

下列程序已获在莫纳什大学动物伦理学委员会批准。健康未经治疗的新生儿 C57Bl6/J P3-6 小鼠被用来产生代表性的结果。

1. 酶消化

注意: 在分离和培养主细胞时, 考虑不孕是很重要的。虽然确保环境尽可能的不育, 但最初的解剖和小鼠大脑的收获可以在层流流罩之外完成, 随后的所有步骤都在层流罩内进行。

1. 使用无菌器械, 弄死小鼠颈椎脱位, 斩首动物, 用100% 乙醇冲洗。使用小的不育剪刀, 使小切口沿左右两侧的头部。在这个年龄, 皮肤很容易脱落。使用弯曲钳的尖端, 轻轻地滑向讲台上的组织, 以揭露头骨, 包括 Bregma。
2. 在椎管内的开口插入剪刀尖端, 并在耳道上进行侧向切口。沿矢状缝线切开 Bregma, 轻轻地指着剪刀的尖端, 以防止损伤大脑。在 Bregma 上插入剪刀尖端, 并沿冠状缝合在头部的左右两侧进行侧向切口。
3. 使用镊子, 轻轻剥去头骨暴露大脑。要做到这一点, 掌握侧切口暴露的颅骨边缘, 轻轻地将头骨拉到侧面。头骨应该很容易剥开。使用弯曲钳, 轻轻铲下大脑, 以消除它。
4. 将大脑放置在5毫升无菌容器中, 用冷洗介质 (低葡萄糖 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM) 补充1% 青霉素-链霉素), 大约5毫升介质每洗涤, 以去除血液。
5. 在层流气流罩, 放置5毫升容器的内容在一个小的培养皿 (35 毫米), 休息在冰上。使用无菌手术刀刀片或无菌剪刀, 取出小脑和嗅球。进行中线切割以分离两个半球。
6. 小心剥去脑膜层的细钳, 小心不要损伤皮质。将脑膜层识别为一层非常薄的细胞, 在大脑表面有红色的色调, 有明显的血管。保持脑部寒冷对于正确的脑膜摘除是必不可少的。如果脑膜层断裂, 继续剥去撕裂的碎片, 直到完全移除。
7. 将半球转移到一个新的小的培养皿 (在冰上), 并填充洗涤介质。用无菌手术刀刀片/剪刀把大脑切成小块。
   注: 这些尺寸应为1毫米² , 并且应注意不要将它们切成太小的部分, 因为这可能会降低产量。
8. 添加100µL 木瓜蛋白酶 (17 U/毫克股票) 和150µL DNase 我进入媒体和孵化30分钟在37°c
9. 消化后, triturate 组织使用 P1000 吸管。如果组织件太大而不能进入吸管, 考虑使用一对或无菌剪刀扩大吸管尖端。在此过程中, 注意不要将气泡引入媒体, 因为这可能会降低细胞的生存能力。

2. 去除髓鞘碎片

1. 在层流罩下使用无菌设备, 为每个大脑准备一个50毫升圆锥管, 100 µm 细胞过滤器。将培养皿中的内容倒入过滤器中, 将消化介质和脑片放在滤网上。通过使用不育的3毫升注射器的柱塞在研磨运动中通过大脑的片断, 直到没有更多的组织可见。消化后, 脑组织应该容易地瓦解。
2. 用洗涤介质连续清洗过滤器, 通过在整个过程中加满细胞滤网。这将洗涤通过过滤器中的任何细胞。
   注意: 这应该做, 直到有约15毫升的管。这是为了确保过滤器得到充分的清洗, 并最大限度地增加所收集的细胞数量。
3. 离心机单细胞悬浮在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。在这段时间内, 准备密度梯度介质, 如所述。
   1. 准备股票等渗 percoll (SIP), 这是密度梯度介质使用。通过增加9:1 密度梯度介质与10x 无菌汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 的比例来做到这一点。
   2. 准备渐变为 30% sip 在 DMEM 和 70% sip 在 1x HBSS。例如, 准备10毫升 30% sip, 添加3毫升的 sip 到7毫升 DMEM。
4. 从锥形管中吸取上清, 在 DMEM 中并用重悬8毫升30% 口的细胞颗粒。把完整的体积转移到一个新鲜的15毫升圆锥管。
5. 衬 70% SIP 解决方案。要做到这一点, 填补一个转移吸管与 70% SIP, 并仔细推通过转移吸管到底部的锥形管。一旦尖端接近底部, 轻轻地推通过转移吸管的内容。
   注意: 这样做缓慢, 以免扰乱30/70 界面。必须有一条清晰的线分隔两层。
6. 离心机的 SIP 层, 包括细胞, 在 650 x g 与刹车0和加速度 4, 在室温下25分钟。
   注: 必须完成旋转与刹车关闭, 并允许离心机缓慢停止, 因为刹车的应用将扰乱界面, 大大减少了在 SIP 层之间的细胞收集。
7. 吸入管顶部的细胞碎片, 从顶部取出大约4毫升的介质。这将减轻在以下步骤中的单个核细胞的去除。使用 P1000 吸管, 小心地将吸管尖向下移向界面。将单个核细胞从30/70 密度梯度介质界面中分离出来。收集大约3毫升从多云接口和转移到一个新的15毫升圆锥管。在此之后, 用9毫升的 HBSS 稀释混合物, 以帮助去除密度梯度介质。
8. 离心稀释密度梯度介质界面, 包含单个核细胞 500 x g 5 分钟, 吸出上清和并用重悬1毫升生长培养基 (DMEM 补充10% 胎牛血清和1% 抗生素)。接着, 用台盼蓝染色悬浮细胞, 用 haemocytometer 进行细胞计数。

3. 磁性活化细胞分类

注意: 这些步骤是从制造商协议中修改的。

1. 将所收集的单个核细胞以4°c 的 300 x g 为10分钟, 以去除生长介质, 因为这会干扰磁隔离。使用从步骤2.8 获得的相同单元格计数, 并用重悬在 PBS (^Ca ++ 和^Mg ++ 免费) 中的 1 x¹⁰ 8 有核细胞/mL, 其中包含2% 个血清和1毫米 EDTA, 在体积范围内为 0.1-2.5 毫升。
2. 从上一步到5毫升 (12 x 75 毫米) 聚苯乙烯圆底管, 在 PBS 中添加完整的有核细胞。添加50µL CD11b PE 标签试剂每1毫升的样品。在室温下孵化15分钟免受光照。
3. 添加70µL 的选择鸡尾酒 (CD11b 单克隆抗体的组合) 每1毫升的样品。在室温下孵化15分钟免受光照。
4. 通过吹打混合磁性粒子5倍以上。将50µL/毫升添加到样品中。在室温下孵化10分钟免受光照。
   注意: 这些微粒然后形成一个 tetrameric 复合物与抗体并且将被连接到磁性专栏。
5. 如果细胞混合物的总体积小于2.5 毫升, 顶部由 PBS (Ca⁺⁺和 Mg⁺⁺免费) 组成, 含有2% 的血清和1毫米 EDTA, 并通过轻轻吹打2-3 次混合。把管子 (没有盖子) 放进磁铁里, 在室温下孵育5分钟。
6. 在一个连续的运动中, 完全反转含有 2-3 s 管的磁铁, 倒出上清。将磁铁返回到直立位置, 然后从磁铁中取出管。准备从列中清洗剩余的单元格。
   注: 上清中含有无标号和不需要的细胞, 通过反转管, 同时仍在磁铁中去除。该管包含附加的 Cd11b⁺单元格。
7. 通过重复步骤3.5 和3.6 两次, 来洗涤细胞。如果样品大于1毫升, 建议进一步重复步骤3.5 和3.6。
8. 并用重悬所需的生长培养基中的细胞。同时冲洗收集容器的侧面 (e. g. 15 毫升管) 从管的两侧收集细胞, 并使产量最大化。

4. 小胶质细胞纯度的验证

注: 从3升 (n = 5 动物总数) 中分离出的主要小胶质细胞通过荧光活化单元分类 (资产管制仪) 进行验证, 以确定代表结果的纯度。

1. T-25 瓶中的培养细胞, 其生长培养基中含有10% 的血清, 每瓶的密度为 1-2 x 10⁶细胞。
2. 用 PBS 3x 将 T-25 烧瓶中的细胞洗净5分钟, 以去除可能干扰 trypsinization 的任何剩余生长介质。
3. 加入2毫升0.25% 胰蛋白酶, 从烧瓶中分离出细胞。确保胰蛋白酶的体积足以覆盖整个瓶子的表面。下面的烧瓶温和旋转, 以确保胰蛋白酶均匀覆盖, 孵育5分钟在37摄氏度。
4. 通过在烧瓶中加入2毫升的生长培养基, 其中含有10% 的血清, 从而使 trypsinization 过程淬火。
5. 收集含有 trypsinized 细胞和离心机在 500 x g 5 分钟在4摄氏度收集细胞的上清液。
6. 移除含有生长培养基和胰蛋白酶的上清液, 并在 500 ul 的并用重悬中对颗粒进行清除。使用台盼蓝进行细胞计数。
7. 离心机在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。在每 5 x 10⁶单元格中添加 50 ul 操作器缓冲区 + 1 ul FcR 拦截器, 执行 Fc 受体块。孵育15分钟, 在4摄氏度。
   注意: fc 受体阻滞是染色过程中的一个关键步骤, 以防止免疫球蛋白的非特异性结合到 Fc 受体细胞中。这种封锁不影响其他抗体的下游约束力。
8. 通过稀释 500 ul 流化器缓冲区来终止阻塞过程。在此之后, 离心机的混合物包含细胞在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。
9. 并用重悬在新鲜的 500 ul 的资产管制器缓冲区。
10. 放置大多数单元格 (例如, 如果将 resuspending 500 ul 中的单元格, 使用 400 ul) 放入取样管中。将剩余的电池分布在控制管中, 每个控制管最多可达100个 ul (例如, 6 个控制管, 将 16.67 ul 放入每个控制管中, 并以 83.33 ul 的流控器缓冲区为顶部)。使组 (控制管以粗体) 为无瑕, 单染色 (CD45, CD11b), 单活/死染色, FMOs 和样品管。
11. 通过离心在 500 x g 5 分钟, 在4摄氏度将所有管子中的细胞颗粒状。
12. 每 5 x 10⁶单元格中, 用 1 ul 抗体对管中的细胞进行染色, 每 100 ul 的检测器缓冲区。孵育20分钟, 在4摄氏度。
    注: 如果使用少于 2 x 10⁶单元格, 请使用 50 ul 抗体鸡尾酒。
13. 用 500 ul 的流器缓冲器清洗细胞。离心细胞在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。
14. 并用重悬 300 ul 的传感器缓冲区中的单元格。
    注: 如果单元格计数小于 2 x 10⁶, 则使用 100 ul。
15. 使用流式细胞仪分析, 量化 CD45^低和阳性 CD11b 染色的细胞。这个百分比对应于被隔绝的主要小胶质细胞。

5. 原发性小胶质细胞的免疫组化染色

1. 将96井板中的细胞以 1 x 10⁵细胞的密度与生长培养基结合, 并在一夜之间孵化。
2. 取出上清液, 用 PBS 清洗3次。
3. 将4% 多聚甲醛的单元格固定在 PBS 中15分钟. 用 P1000 吸管取出粉煤灰, 然后用 pbs + 0.1% 海卫 x 清洗3次。
4. 室温下以3% 牛血清白蛋白为1小时的非特异结合块。
5. 孵育与兔子 Iba-1 (1:100) 为24小时在4°c。接着, 取出主要抗体混合物, 用 PBS 清洗3次。
6. 二次抗兔 GFP 共轭 (1:200) 在室温下孵育1小时。接着, 取出二次抗体混合物, 用 PBS 清洗3次。
7. 安装带有荧光安装介质的幻灯片, 并使用荧光显微镜捕捉图像。

6. 用 pHrodo 测定小胶质细胞的数量

注: pHrodo 化验可以识别培养细胞中吞噬功能的水平。通过吞吸收, 内部化进入更酸性的环境, 增加了 bioparticle 共轭物的荧光水平。然后, 可以通过外地资产管制仪量化荧光水平。以下步骤由制造商协议修改。

1. 一夜之间在生长培养基中培养 T-25 烧瓶中的细胞, 每瓶的密度为 1-2 x 10⁶细胞。用 PBS 将 T-25 烧瓶中的细胞洗净3次, 5 分钟。
2. 使用2毫升0.25% 胰蛋白酶分离细胞。孵育5分钟, 在37摄氏度。
3. 通过在烧瓶中加入2毫升的生长培养基, 其中含有10% 的血清, 从而使 trypsinisation 过程淬火。
4. 离心细胞悬浮在 500 x g 为5分钟在4°c 到颗粒细胞。
5. 移除上清和并用重悬在¹⁰ 6 细胞/mL 培养基中含有主要小胶质的小球。
   注: 另一种情况是, 96 井板中的平板细胞至少在一天前, 并在进行化验的当天以 1 x 10⁵可行细胞为目标。
6. 板单元成96井板在 1 x 10⁵细胞/好, 100 ul 每井。板控制和实验井三个, 并留下一个空井每积极控制的无细胞控制背景减法。
7. 添加 100 ul 的增长介质到井留空为无细胞背景减法。
   注意: 与任何其他体外检测一样, 适当的控制对于读数的准确性至关重要。除了无细胞控制 (背景阅读), 还包括负控制井 (pHrodo 共轭添加, 但放置在冰上)。
8. 盖板和孵化1小时在一个孵化器与 5% CO₂在37摄氏度。
9. 通过添加兴奋剂和治疗来制备实验井。将车辆控制 (仅增长媒体) 添加到未经处理的油井。
   注: 脂多糖1µg/毫升 [兴奋剂] 和人羊膜上皮细胞 (hAEC) 条件的媒体 [治疗] 被用来产生代表性的结果。
10. 解冻一小瓶共轭染料, 加入2毫升吸收缓冲和简要涡。将管的内容转化为干净的玻璃管和油脂实验5分钟, 以确保颗粒均匀分散。
11. 从微板块井中吸取培养基, 用 100 ul 的染料悬浮液快速替换。覆盖和孵化在37°c 1 小时。
    注: 请记住, 也要弄脏控制管。
12. 应用流式细胞仪分析, 量化细胞染色阳性的共轭 pHrodo 珠, 目前作为一个百分比 (父母) 的积极吞噬小胶质。

7. 炎症性侮辱后小胶质细胞凋亡的量化

1. 重复步骤1-7 从 "验证小胶质细胞纯度" 一节。
2. 放置大多数单元格 (例如, 如果您将 500 ul 的悬浮中的单元格, 使用 400 ul) 放入取样管中。将剩余的电池分布在控制管中, 每个控制管最高可达 100 ul (例如6 控制管, 将 16.67 ul 放入每个控制管中, 并以 83.33 ul 的流控器缓冲区为顶部)。组 (控制管粗体): 无瑕, 单污渍 (AnnexinV, 碘碘化), 单活/死染色, FMOs, 样品管。
3. 通过离心在 500 x g 5 分钟内将所有管子中的细胞颗粒。
4. 孵育与 1 ul antibody/100 ul buffer/5 x 10⁶单元格为20分钟在4°c。
   注: 如果少于 2 x 10⁶单元格, 请使用 50 ul。
5. 在 500 x g 处添加 500 ul 的流道缓冲液和离心机以5分钟冲洗细胞。
6. 并用重悬在 300 ul 的内流器缓冲器中的细胞颗粒。
   注: 如果单元格计数小于 2 x 10⁶, 则为 100 ul。
7. 量化每个象限内的细胞 (Q1: 坏死, Q2: 晚期凋亡, Q3: 可行, Q4: 早期凋亡)。

结果

使用此处概述的方法, 可以隔离小胶质细胞的纯种群, 并可以使用体外和资产管制分析来进行表征。首先, 多达18只动物可以使用每一个剔除, 预期产量约 45万-60万胶质细胞。首先确认分离细胞的纯度是至关重要的, 这样做是通过对两个标记 CD45 和 CD11b 的染色来进行的. 胶质细胞的鉴定可以证明是麻烦的, 因为小胶质细胞表达的许多标记也表达了巨噬细胞, 并使用这两个...

讨论

小胶质细胞具有支持和抗炎的能力, 通过环境刺激改变。先前的研究表明, 小胶质细胞活化的调节可以赋予神经保护作用。他们为神经元提供保护和修复损伤的能力需要更多的研究来进一步了解这些复杂细胞的现状。因此, 高纯度原发性小胶质细胞的分离是一项重要而有用的技术。这是一个相对较快的方法, 获得高纯度的主要小胶质细胞为体外实验在2天内准备好。

文献?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, low glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
EasySep magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Corning	352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom	Corning	CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	Company	Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233