Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Resumo

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Resumo

Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.

Introdução

Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal¹complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão².

Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão³. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, dependente do ambiente⁴. Eles estão envolvidos na quimiotaxia, fagocitose, apresentação de antigénios e produção de citocinas e de^4,de espécies reativas de oxigênio⁵. Microglia senescente constantemente pesquisa o ambiente e são ativados pela presença de uma substância estrangeira ou prejudiciais⁴. Ativação leva a uma resposta pró-inflamatória, crítica no CNS proteção⁴. Estes M1 "pro-inflamatórios" fenótipo microglia são principalmente envolvida na apresentação de antigénios e a morte de patógenos⁴. Apesar do papel crucial da resposta inflamatória na neuroproteção, inflamação descontrolada ou prolongada pode ser prejudicial e levar a dano neuronal⁴. No entanto, quando expostos a certos estímulos ambientais, microglia pode apresentar um fenótipo anti-inflamatórios. Estes pro-reparativa M2 microglia têm um papel fundamental na cicatrização de feridas e reparação⁶, liberando uma variedade de citocinas e outros mediadores solúveis que downregulate inflamação, aumentam a fagocitose e promovem reparo^{4, 7}. os papéis de micróglia são diversos e incluem condução diferenciação oligodendrocyte durante re-mielinização⁸, protegendo os neurônios durante a depleção de oxigênio e glicose em curso modelos⁹ e promovendo o axônio consequência em ¹⁰modelos de lesão da medula espinhal.

O estudo destas células gliais representa um aspecto importante na compreensão e manipulando a resposta ao neuroinflammation. O protocolo descrito permite ainda mais a investigação sobre o potencial terapêutico de micróglia modulação em desordens MPTP.

A modulação da ativação microglial para um papel neuroprotetor tem sido observada em uma variedade de condições^11,12,13. Assim, melhorar o entendimento atual e ainda mais, estudando modulação da ativação microglial é fundamental, exigindo o uso de vários modelos, incluindo tanto em vitro como em vivo. Estudos in vitro representam uma ferramenta importante devido à sua maior eficiência, menor custo e capacidade para investigar uma população de células isoladas.

Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia do cérebro murino, o desafio de produzir com eficiência uma amostra de alto rendimento com boa viabilidade e pureza elevada. Métodos comumente utilizados de isolamento primário microglia são por separação magnética e agitação prolongada das culturas gliais mistas. Através da experiência pessoal, verificou-se que havia um alto grau de restos celulares que obstruiu a coluna magnética. Assim, foi utilizado o seguinte protocolo, que incorpora uma etapa de centrifugação gradiente de densidade inicial seguida de CD11b separação magnética. O protocolo descrito abaixo foi otimizado para produzir uma amostra altamente pura em quantidade suficiente. É vantajoso devido à sua alta pureza e o curto período de tempo — um pode realizar ensaios dentro de 2 dias sem a necessidade de cultura para 2-3 semanas. Este protocolo potencialmente pode ser adaptado para o isolamento de astrócitos murino primários.

Protocolo

Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.

1. enzimática digestão

Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros murino podem ser concluídas fora um capuz de fluxo laminais, com todas as etapas realizadas dentro de uma capa de fluxo laminar.

1. Usando instrumentos esterilizados, eutanásia o mouse por deslocamento cervical, decapitar o animal e enxágue com 100% de etanol. Usando pequenas tesouras estéreis, faça pequenas incisões ao longo dos lados direito e esquerdos da cabeça. Nesta idade, a pele descasca facilmente. Usando as pontas da pinça curvada, deslize suavemente o tecido para a tribuna para expor o crânio, incluindo o Bregma.
2. Inserir a ponta da tesoura na abertura do canal medular e fazer uma incisão lateral ao canal auditivo. Fazer uma incisão ao longo da sutura sagital para o Bregma, apontando suavemente a ponta da tesoura para cima para não danificar o cérebro. Introduza a ponta da tesoura em Bregma e fazer incisões laterais para os lados direito e esquerdos da cabeça ao longo da sutura coronal.
3. Usando fórceps, delicadamente descasca o crânio para expor o cérebro. Para fazer isso, segure as extremidades da caveira exposta a incisão lateral e puxe cuidadosamente o crânio para o lado. O crânio deve descascar facilmente. Usando a pinça curvada, colher suavemente sob o cérebro para removê-lo.
4. Coloque o cérebro num recipiente estéril 5 mL, lavar 2 - 3 vezes com mídia de lavagem gelada (de baixa glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 1% penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL meios de comunicação social por lavagem, para retirar o sangue.
5. Numa vizinhança de fluxo de ar laminar, coloca o conteúdo do recipiente em um pequeno prato de petri (35 mm), 5 mL, descansando no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura esterilizada, retire o cerebelo e o bulbo olfativo. Faça uma linha média corte para separar os dois hemisférios.
6. Cuidadosamente descasca afastado a camada meníngea com pinça fina, tendo cuidado para não danificar os córtices. Identifica a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração avermelhada na superfície do cérebro, com visíveis os vasos sanguíneos. Manter o cérebro frio é essencial para a remoção adequada de meninges. Se quebrar a camada meníngea, continue descascando afastado os fragmentos rasgados até que ele seja completamente removido.
7. Transferi os hemisférios para um novo pequeno prato de petri (no gelo) e encha-a com a lavagem de mídia. Pique o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril/tesoura.
   Nota: Estes devem ser mm ~ 1² no tamanho, e deve ter cuidado para não cortá-los em pedaços muito pequenos, como isto pode reduzir o rendimento.
8. Adicionar 100 µ l papaína (estoque de 17 U/mg) e 150 µ l DNase eu na mídia e incube por 30 min a 37 ° C
9. Após digestão, Triture o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido são grandes demais para entrar a pipeta, considere o uso de um par ou tesoura esterilizada para alargar a ponta da pipeta. Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas na mídia como isto pode reduzir a viabilidade celular.

2. a mielina remoção de entulhos

1. Sob uma capa de fluxo laminar, usar equipamento estéril, prepare um tubo cónico de 50 mL com um coador de célula de 100 µm, para cada cérebro. Despeje o conteúdo da caixa de Petri, contendo as peças de médio e cérebro digerir em um coador. Empurre com os pedaços de cérebro usando o êmbolo de uma seringa de 3ml estéril em um movimento de moagem até que não há nenhum tecido mais visível. Após a digestão, o tecido cerebral deve desmoronar facilmente.
2. Continuamente, lave o filtro com os meios de lavagem, por encher o filtro de célula em todo este processo. Isto vai lavar através de quaisquer células presas no filtro.
   Nota: Isto deve ser feito até que haja cerca de ~ 15 mL no tubo. Isto é para garantir que o filtro é suficientemente lavado através de e para maximizar a quantidade de células coletadas.
3. Centrifugar a suspensão de célula única 500 x g por 5 min a 4 ° C. Durante este tempo, prepare o suporte de gradiente de densidade conforme descrito.
   1. Prepare o estoque percoll isotônica (SIP), que é o meio de gradiente de densidade utilizado. Faça isso adicionando-se 9:1 relação de médio gradiente de densidade de 10 x solução salina equilibrada do Hanks estéril (HBSS).
   2. Prepare-se gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em 1 x HBSS. Por exemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, adicionar 3 mL de SIP para 7 mL DMEM.
4. Aspire o sobrenadante do tubos cónicos e ressuspender o sedimento celular com 8 mL de 30% SIP em DMEM. Transferi todo o volume para um tubo cónico de 15 mL.
5. Subjacência a solução SIP de 70%. Para fazer isso, encha uma pipeta de transferência com 70% SIP e cuidadosamente empurrar através da pipeta de transferência para o fundo do tubo cónico. Uma vez que a ponta está perto do fundo, empurre suavemente através do conteúdo da pipeta de transferência.
   Nota: Faça isto lentamente para não perturbar a interface 30/70. Deve haver uma linha clara separando as duas camadas.
6. Centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 x g com freio 0 e 4, a aceleração para 25 min à temperatura ambiente.
   Nota: É essencial para completar o giro com freio fora e permitir que a centrífuga para lentamente vir a uma parada, como aplicação do freio perturbará a interfase e reduzir drasticamente a coleção de células entre as camadas SIP.
7. Aspire os restos celulares na parte superior do tubo e remova aproximadamente de 4 mL mídia do topo. Isto facilitará a remoção das células mononucleares na etapa seguinte. Usando uma pipeta P1000, baixe cuidadosamente a ponta da pipeta para a interfase. Isole as células mononucleares da interface médio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente 3 mL da interface nublado e transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Em seguida, dilua a mistura com 9 mL de HBSS para ajudar à remoção do meio de gradiente de densidade.
8. Centrifugue a interfase médio gradiente de densidade diluída, que contém as células mononucleares em 500 x g, durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de meio de crescimento (DMEM suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% antibióticos). Em seguida, manchar as ressuspensa células com trypan azul e realizar uma contagem de células usando um haemocytometer.

3. magnético celular ativado classificação

Nota: Estes passos são modificados de protocolo dos fabricantes.

1. Centrifugar as células mononucleares coletadas a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover o meio de crescimento, pois isto irá interferir com o isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida passo 2.8, Ressuspender a 1 x 10⁸ nucleated células/mL em PBS (+⁺ de Ca e Mg +⁺ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM EDTA, dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mL.
2. Adicione o volume total de células nucleadas em PBS da etapa anterior para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar 50 reagente de rotulagem CD11b PE µ l por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
3. Adicione 70 µ l de seleção cocktail (uma combinação de anticorpos monoclonais contra CD11b em PBS) por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
4. Misture partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de 5 vezes. Adicione 50 µ l/mL para a amostra. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.
   Nota: Estas partículas então formam um complexo tetramérica com os anticorpos e vão ficar ligadas a coluna magnética.
5. Se o volume total da mistura de célula é inferior a 2,5 mL, top esse volume com PBS (+⁺ de Ca e Mg +⁺ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM de EDTA e misture suavemente pipetando 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem tampa) para o ímã e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
6. Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo para 2-3 s, decantar o sobrenadante. Retornar o ímã para uma posição vertical e retire o tubo do ímã. Prepare-se para lavar as restantes células da coluna.
   Nota: O sobrenadante contém células rotuladas e indesejadas, que são removidas por inversão do tubo enquanto ainda no imã. O tubo contém o Cd11b anexado⁺ células.
7. Lave as células, repetindo as etapas 3.5 e 3.6 mais duas vezes. Se a amostra for maior que 1 mL, é recomendado um mais repetição de etapas 3.5 e 3.6.
8. Ressuspender as células em um meio de crescimento desejado. Enxágue o lado do navio coleção também (ex. um tubo de 15 mL) para coletar as células dos lados do tubo e maximizar o rendimento.

4. verificação da pureza da micróglia

Nota: O primário microglia isolada de 3L (n = total de 5 animais) foram verificados através de fluorescente ativado celular classificação (FACS) para determinar a pureza para os resultados representativos.

1. Células de cultura num balão de T-25 no meio de crescimento, contendo 10% FBS durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 10⁶ células por balão.
2. Lavar as células os frascos de T-25 com PBS 3 x por 5 min remover qualquer mídia de crescimento remanescente, que pode interferir com a tripsinização.
3. Adicione 2 mL de tripsina 0,25% para separar as células dos frascos. Certifique-se de que o volume de tripsina é suficiente para cobrir toda a superfície do balão. Após agitação suave do frasco para assegurar uma cobertura uniforme de tripsina, incubar durante 5 min a 37 ° C.
4. Extinguir o processo tripsinização, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.
5. Recolha o sobrenadante contendo as células trypsinized e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células.
6. Remover o sobrenadante contendo o meio de crescimento e tripsina e resuspenda o pellet em buffer de FACS 500 μL. Realize a contagem de células usando trypan azul.
7. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Execute o bloco de receptor Fc adicionando 50 buffer de FACS μL + bloqueador de FcR 1 μL por 5 x 10⁶ células. Incube por 15 min a 4 ° C.
   Nota: O bloco do receptor Fc é um passo crítico no processo de coloração para evitar inespecificas de imunoglobulinas aos receptores de Fc em populações de células imunes. Este bloqueio não afeta a ligação a jusante de outros anticorpos.
8. Finalizar o processo de bloqueio diluindo com buffer de FACS 500 μL. Em seguida, centrifugar a mistura que contém as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
9. Resuspenda em fresco buffer de FACS 500 μL.
10. Coloque a maioria das células (por exemplo, se resuspending as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL por tubo de controle (por exemplo, para 6 tubos de controle, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top 83.33 buffer de FACS μL). Fazer os grupos (tubos de controle em negrito) como Unstained, single manchado (CD45, CD11b), única mancha ao vivo/morto, FMO e tubos de amostra.
11. Pelotas as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
12. Manche as células no tubo com 1 anticorpo μL por buffer de FACS 100 μL por 5 x 10⁶ células. Incubar durante 20 min a 4 ° C.
    Nota: Use 50 μL anticorpo cocktail se menos de 2 x 10⁶ células são usadas.
13. Lave as células com buffer de FACS 500 μL. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
14. Ressuspender as células em buffer de FACS 300 μL.
    Nota: Use ~ 100 μl, se a contagem de células é de menos de 2 x 10⁶.
15. Usando análise de citometria de fluxo, quantificar as células que são positivas para coloração de CD11b e CD45^baixa . Esta percentagem corresponde a microglia primário isolado.

5. coloração imuno-histoquímica de micróglia primária

1. As células em uma placa de 96 poços, com uma densidade de 1 x 10⁵ células da placa com o meio de crescimento e incubar durante uma noite.
2. Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com PBS.
3. Consertar as células com paraformaldeído 4% em PBS por 15 min. remover o PFA com uma pipeta P1000 e, em seguida, lavá-los 3 vezes com PBS + 0,1% Triton-X.
4. Bloco de ligação não-específica com 3% albumina de soro bovino por 1h à temperatura ambiente.
5. Incube com coelho Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. Em seguida, retire a mistura do anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBS.
6. Incube com secundário conjugado anticoelho GFP (1: 200) por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, retire a mistura do anticorpo secundário e lavar 3 vezes com PBS.
7. Monte as lâminas com uma fluorescente montagem médio e captura de imagens utilizando um microscópio fluorescente.

6. quantificação da Microglia usando o pHrodo do ensaio

Nota: O ensaio de pHrodo permite a identificação dos níveis de fagocitose em células cultivadas. Após a captação através de endocitose, internalização no ambiente mais ácido aumenta os níveis de fluorescência de conjugados a bioparticle. Em seguida, níveis de fluorescência podem ser quantificados pela FACS. As etapas a seguir são modificadas de protocolo dos fabricantes.

1. Cultura de células num balão de T-25 no meio de crescimento durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 10⁶ células por balão. Lave as células em frascos de T-25 com PBS 3 vezes por 5 min.
2. Separe as células usando a tripsina 0,25% de 2 mL. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
3. Extinguir o processo de trypsinisation, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.
4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 500 x g por 5 min a 4 ° C para células de Pelotas.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo a microglia primário em meio de cultura em 10⁶ células/mL.
   Nota: Como alternativa, placa de células em uma placa de 96 poços, pelo menos, um dia antes e mire a 1 x 10⁵ células viáveis por bem no dia do ensaio é para ser realizado.
6. Células de placa em placa de 96 poços, 1 x 10⁵ células/poço, 100 μL por poço. Placa de controles e experimentais poços em triplicado e deixar um poço vazio por controlo positivo para uma subtração de fundo não-célula de controle.
7. Adicione 100 μL de mídia de crescimento nos poços deixados vazios para subtração de fundo não-célula.
   Nota: Como qualquer outro em vitro ensaio, controles apropriados são vitais para a precisão das leituras. Ao lado da célula não-controle (fundo de leitura), também incluem o controlo negativo (pHrodo conjugado adicionado, mas colocada no gelo).
8. Cobrir a placa e incubar por 1h em uma incubadora com 5% CO₂ a 37 ° C.
9. Prepare experimentais poços, acrescentando estimulante e tratamento. Adicione controles do veículo (apenas mídia de crescimento) para poços não tratados.
   Nota: Lipopolissacarídeo 1 µ g/mL [estimulantes] e células epiteliais humanas âmnio (hAEC)-condicionada mídia [tratamento] foram usadas para gerar os resultados representativos.
10. Descongelar um frasco de corante conjugado, adicionar vórtice e brevemente 2 mL de tampão de captação. Transferir o conteúdo do tubo para um tubo de vidro limpo e proceda à sonicação por 5 min, para garantir que as partículas são uniformemente dispersos.
11. Aspire o meio de cultura de poços de microplacas e substituir rapidamente com 100 μL de suspensão de tintura. Cobrir e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
    Nota: Lembre-se de manchar os tubos de controle também.
12. Usando análise de citometria de fluxo, quantificar células coloração positiva para as contas pHrodo conjugados e apresentar em percentagem (do pai) de ativamente fagocitose microglia.

7. quantificação da Microglia apoptose após insulto inflamatório

1. Repita os passos 1-7 da seção "Verificação de micróglia pureza".
2. Coloque a maioria das células (por exemplo, se você resuspended as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL pelo tubo controle (por exemplo, para tubos de controle 6, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top buffer de FACS 83.33 μL). Grupos (tubos de controle em negrito): manchas Unstained, única (AnnexinV, iodeto de Propidium), única mancha ao vivo/morto, FMO, tubos de amostra.
3. Granule as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min.
4. Incube com 1 μL anticorpo/100 μL FACS tampão/5 x 10⁶ células por 20 min a 4 ° C.
   Nota: Use 50 μL se tiverem menos de 2 x 10⁶ células.
5. Lave as células adicionando 500 μL FACS buffer e centrifugar a 500 x g por 5 min.
6. Resuspenda o pellet de células no buffer de FACS 300 μL.
   Nota: ~ 100 μL se a contagem de células é de menos de 2 x 10⁶.
7. Quantificar as células dentro de cada quadrante (Q1: necrótico, Q2: tarde apoptotic, Q3: viável, Q4: apoptotic precoce).

Resultados

Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da mi...

Discussão

Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, low glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
EasySep magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Corning	352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom	Corning	CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	Company	Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233