الكشف عن متغير CDH1 نسخة نادرة في الأنسجة المجمدة الطازجة سرطان المعدة ببكر الرقمية المستندة إلى شرائح

Summary

ويصف المخطوط القائم على رقاقة رقمية PCR مقايسة للكشف عن CDH1 نادرة نسخة variant (CDH1a) في العادي مجمدة طازجة وورم الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة.

Abstract

CDH1a، نسخة غير مقبول من الجينات CDH1 ، قد وجد أن يتم التعبير عنها في بعض خطوط خلايا سرطان المعدة (GC)، في حين أنه غائب في مخاطية المعدة العادية. في الآونة الأخيرة، اكتشفنا CDH1a النص البديل في أنسجة الورم المجمدة الطازجة التي تم الحصول عليها من مرضى GC. كان التحقيق في التعبير عن هذا البديل في عينات الأنسجة النهج بكر (دبكر) الرقمي القائم على رقاقة المعروضة هنا. دبكر يوفر إمكانيات قياس دقيقة وقوية وحساسة للغاية للأحماض النووية، وهو يتزايد استخدام العديد من التطبيقات في مختلف المجالات. دبكر قادر على كشف الأهداف النادرة؛ وبالإضافة إلى ذلك، يوفر دبكر إمكانية مطلقة ودقة التقدير الكمي للأحماض النووية دون الحاجة إلى آلة لفرز والمنحنيات القياسية. في الواقع، فعل تقسيم يثري الهدف من الخلفية، مما يحسن كفاءة التضخيم والتسامح لمثبطات. هذه الخصائص تجعل دبكر أداة مثلى للكشف عن نسخة نادرة CDH1a .

Introduction

ترميز الجينات CDH1 لهاء-كادهيرين، عاملاً رئيسيا يشارك في الحفاظ على ظهارة المعدة العادية من خلال تنظيم خلية التصاق والبقاء على قيد الحياة، والانتشار والهجرة¹. فقدان البروتين كادهيرين ه نتيجة للفعل الضار أو تعديلات جسدية من CDH1 ارتبطت بتطوير GC^2،3. قد تم الافتراض المستنسخات المتعارف عليه عدم الناشئة عن إنترون 2 الجينات أيضا أن تلعب دوراً في التسرطن المعدة^4،5. على وجه الخصوص، واحد هذه المحاضر، CDH1a، لقد ثبت أن يتم التعبير عنها في خطوط الخلايا GC لكن تغيب من المعدة العادي⁴. ونحن مؤخرا الكشف عن CDH1a في عينات الأنسجة GC من المرضى GC استخدام دبكر المستندة إلى شرائح⁵. دبكر واستخدم لتقييم، للمرة الأولى، وجود نسخة الجين CDH1a في GC الأمعاء وأنسجة طبيعية.

هو أسلوب المعيار الذهبي لتحديد التعبير الجيني PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قبكر). ومع ذلك، البيانات الناتجة في بعض الأحيان يمكن أن يكون متغير وذات نوعية رديئة، خصوصا عند مستوى المستهدفة في العينة منخفضا. يمكن أن يكون سبب هذا التغير من الملوثات، التي تعوق النشاط بوليميريز والصلب التمهيدي، مما أدى إلى تضخيم غير محددة و ردود فعل الجانب التنافسي⁶.

على الرغم من أن مبادئ دبكر البيوكيميائية الأساسية مشابهة لتلك التي قبكر، دبكر يظهر بعض المزايا، مما يسمح لقياسات دقيقة جداً للحمض النووي (جدنا)/التكميلية جزيئات الحمض النووي (كدنا). وفي الواقع، هو دبكر فعل نقطة نهاية التي تعتمد على تقسيم معايرة من عينة إلى آلاف آبار، حيث يحتوي كل جيدا جزيء هدف واحد أو صفر. التضخيم ثم يحدث فقط في الآبار التي تحتوي على نسخة من الرقم المستهدف وهو مبين بإشارة فلورسنت. ويمكن حساب العدد المطلق للجزيئات المستهدفة في العينة الأصلية ثم بتحديد نسبة إيجابية لمجموع الأقسام باستخدام إحصاءات Poisson ثنائي الحد⁷.

وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب دبكر يلغي الحاجة لتشغيل منحنى قياسي، ومن ثم، التحيز المرتبطة بها، والتقلبات المناخية، مما يسمح لإجراء تقييم كمي مباشر للأهداف^8،9؛ فإنها تعطي نتائج أكثر دقة واستنساخه مستقل عن الملوثات وكفاءة نتيجة عن التسامح عالية لمثبطات¹⁰؛ هو أكثر حساسية وتحديداً من قبكر، وهو وسيلة موثوق بها للكشف عن هدف نادر وهكذا. وأخيراً، تقسيم العينة إلى ردود فعل متعددة يقلل من المنافسة مع جزيئات الخلفية ويحسن الحد من الكشف عن الهدف، مما يجعل من الممكن التضخيم وتيسير الكشف عن الجزيئات واحدة من جدنا/كدنا⁶ . الكشف والتحديد الكمي للأحماض النووية بالقائم على رقاقة دبكر قد طبق متزايد لنسخ تباين عدد والتحديد الكمي للحمض النووي وشظايا والطفرات ويحلل^11،،من¹²¹³، نظراً الدقة والمواد المنخفضة إدخال شرط للأسلوب. وباﻹضافة إلى ذلك، أدمج دبكر مؤخرا في تحليل كل ميكرورناس¹⁴ والجينات النصوص^5،15.

Protocol

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية IRST.

ملاحظة: هذا الإجراء هو مصممة خصيصا للكشف عن عدد قليل من الجزيئات كدنا في الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة. وخفضت الفروع الأنسجة على الثلج الجاف، بينما لا تزال مجمدة، من ورم المعدة المصادق عليه سابقا مشتقة من المريض أو عينات الأنسجة العادية.

1-الجيش الملكي النيبالي العزل وتنقية

1. استخراج الحمض النووي الريبي
   ملاحظة: يتم عزل الحمض النووي الريبي تحت غطاء محرك السيارة باستخدام منتج معين (انظر الجدول للمواد). ومع ذلك، مجموعة متنوعة من مواد العزل المتاحة تجارياً.
   1. مجانسة 50-100 ملغ عينة ناعما قطع الأنسجة المجمدة الطازجة في أنبوب 1.5 مل مع 1 مل من كاشف عزل الحمض النووي الريبي ودوامه بقوة عن 15 س. إينكوباتي الأنابيب في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   2. احتضان الأنبوبة التي تحتوي على العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ومزيج من فورتيكسينج لمدة 15 ثانية.
   3. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد، وإضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم، ودوامه بقوة لمدة 15 ثانية.
   4. احتضان هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة ل 60 s وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   5. نقل في مرحلة مائي في أنبوب 1.5 مل وإضافة 20 ميكروغرام من الجليكوجين.
      ملاحظة: من المهم تجنب بعناية نقل أي من الطور البيني أو الطبقة العضوية بغية الحد من التلوث.
   6. إضافة 500 ميليلتر من الايزوبروبانول، عكس أنبوب لمزيج، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
   7. الطرد المركزي الأنبوب في ز س 12,000 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية يعجل بالجيش الملكي النيبالي.
      ملاحظة: سوف تكون الحمض النووي الريبي موجودة في بيليه مثل هلام على الجانب والسفلي من الأنبوب، كثيرا ما غير مرئية بعد الطرد المركزي.
   8. إزالة المادة طافية دون الإخلال ترسبات وغسله مع 1 مل إيثانول 75% من بيبيتينج.
   9. الطرد المركزي الأنبوب في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه.
   10. واسمحوا بيليه الجاف حتى يصبح شفافاً ترسبات وتذوب في 50 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
   11. تجميد العينات في-80 درجة مئوية على الأقل بين عشية وضحاها قبل القياس الكمي.
2. القضاء على الحمض النووي الجينومي وتنقية الحمض النووي الريبي
   ملاحظة: ينصح خطوة هضم الدناز، متبوعاً تنقية الحمض النووي الريبي المستندة إلى عمود، لتحليل الأهداف المنخفضة-وفرة من أجل هضم تلويث الحمض النووي.
   1. حل الدناز المجففة بالتبريد الأول (1500 كيس [كونيتز]) في ميليلتر 550 الحرة رناسي المياه استخدام المحاقن، المزيج بلطف بعكس القنينة، وتقسيم الحل الأسهم المعاد تشكيلها إلى مختبرين.
   2. نقل في أنبوب 1.5 مل حجم العينة المحسوب مع 15 ميكروغرام للجيش الملكي النيبالي، 10 ميليلتر من "الهضم الدناز" المخزن المؤقت من kit (المدرجة في الجدول للمواد)، 2.5 ميليلتر من الدناز أنا حل الأسهم، وخالية من رناسي المياه إلى 100 ميليلتر. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   3. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة (من الطقم، انظر الجدول للمواد)، ومزيج من بيبيتينج.
   4. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 100% ومزيج من بيبيتينج.
   5. نقل وحدة التخزين بأكملها (700 ميليلتر) في عمود الدوران جديد وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 ثانية.
   6. نقل عامل التصفية إلى أنبوب جمع جديد، إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 2 دقيقة.
   7. افتح غطاء لعمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق مع أنبوب جمع جديد الجاف للتصفية؛ ثم نقل عامل التصفية إلى أنبوب 1.5 مل.
   8. إضافة 14 ميليلتر من المياه خالية من رناسي مباشرة إلى عمود التصفية والطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
   9. تبقى العينات على الجليد والمضي قدما للقياس الكمي باستخدام 2 ميليلتر من العينة على مقاعد البدلاء-أعلى جهاز المطياف الضوئي أو تخزين الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2-كدنا التوليف

1. 1,000 مكان نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، 4 ميليلتر من مزيج الرئيسي، 1 ميليلتر المنتسخة العكسية، والمياه خالية من رناسي إلى وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر في أنبوب PCR عقيمة. المزيج بلطف وتدور إلى أسفل.
2. احتضان هذا المزيج رد فعل في cycler حرارية، تطبق الشروط التالية: 5 دقيقة عند 25 درجة مئوية، 30 دقيقة في 42 درجة مئوية، مدة 5 دقائق في 85 درجة مئوية.
3. الطرد المركزي هذه الأنابيب بإيجاز والمضي قدما إلى تحليل دبكر أو تخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.

3-إعداد رد بكر الرقمية

1. رد فعل دبكر مزيج وعينه إعداد
   1. ذوبان الجليد في مزيج الرئيسي والمقايسة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   2. تمييع العينات كدنا لتركيز 300 نانوغرام في 6 ميليلتر من الماء.
   3. بلطف دوامة سيد مزيج وإعداد المزيج في أنبوب عقيم مع 8.7 ميليلتر من مزيج الرئيسي و 0.87 ميليلتر من التمهيدي المقايسة تصميم مخصص CDH1a ميليلتر 1.83 المياه خالية من نوكلاس لوحدة تخزين نهائي من 11.4 ميليلتر.
      ملاحظة: لتفاصيل التمهيدي المقايسة تصميم مخصص CDH1a انظر الجدول للمواد.
   4. نقل ميليلتر 11.4 مزيج استعداد للعينة كدنا المخفف وتخلط بلطف والطرد المركزي بإيجاز.
      ملاحظة: تتضمن وحدات التخزين الزائد 20% للتعويض عن فقدان وحدة التخزين من بيبيتينج. إعداد المزيج لجميع العينات وعنصر تحكم قالب لا (المجلس الوطني الانتقالي).
2. إعداد شرائح
   ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج تحميل الرقائق أسرع.
   1. قم بتوصيل رقاقة المحمل والانتظار حتى يتحول مؤشر الضوء الأخضر.
   2. إزالة غطاء المحاقن السوائل الغمر بلطف سحب المكبس 1-2 مم وإطلاقه لتسهيل هذه الخطوة، واستبدالها بمعلومات سرية.
   3. تأخذ شريحة جديدة وتأخذ علما بالتعليمات البرمجية المكتوبة على غطاء لإقرانها بالعينة.
   4. عقد الغطاء بعناية من جانبها وقشر بعيداً الفيلم الواقية ومكان الغطاء مع الوجه لزجة حتى في الاتجاه الصحيح.
   5. التقاط شريحة، مع الحرص على عدم لمس الجزء الداخلي، وتحميلها على العش رقاقة في الموضع الصحيح بالضغط لأسفل رافعة لفتح المشبك بعناية.
   6. تحميل شفرة تحميل جديد على المحمل ودفعها برفق التأكد من أنها بشدة في المكان.
   7. نقل 14.5 ميليلتر من مزيج دبكر الرد على شفرة تحميل دون صنع فقاعات الهواء أو تحريف بليد، بعد الصحافة التي الأسود تحميل زر لتوزيع الصوت على الشريحة.
   8. استخدام المحاقن غمر السائل لنقل حوالي 20 قطرات على سطح رقاقة مع الحرص على عدم لمس السطح مع التلميح.
      ملاحظة: من المهم لتغطية كامل السطح دون تسرب السوائل على الحواف.
   9. تدوير الذراع محمل جعل غطاء تتلامس الرقاقة واضغط باستمرار لمدة 15 ثانية.
   10. اضغط على زر غطاء للإفراج عن شرائح وإرجاع الذراع إلى موضعه.
   11. عقد رقاقة المجتمعون بزاوية 45 درجة بعناية الاستغناء المحاقن من خلال منفذ تعبئة السوائل الغمر وتدوير رقاقة قليلاً للتأكد من عدم وجود لا فقاعات الهواء، وإزالة أي السوائل الزائدة مع مسح عقيمة.
   12. إغلاق القضية رقاقة بلطف بعيداً تقشير التسمية على رأس غطاء شريحة والصحافة عبر منفذ التعبئة لمالا يقل عن 5 s.
   13. تخزن الرقاقة في الظلام حتى جاهزة التحميل في cycler الحرارية.
       ملاحظة: يجب استخدام رقائق المعدة ضمن ح 2.
3. رد فعل دبكر
   1. فتح الغطاء وتثبيت المحولات لكل الكتل، حتى عندما يتم استخدام كتلة واحدة.
   2. وضع الرقائق على كتلة العينة في الموضع الصحيح.
      ملاحظة: يجب أن يكون المنفذ تعبئة نحو الجزء الأمامي cycler الحرارية في وضع مرتفعة للسماح أي فقاعات الهواء لتطفو إلى الأعلى دون إزعاج النافذة للرقاقة. استخدام رقائق فارغة لتحقيق التوازن بين الكتلتين.
   3. إرساء لوحة الحرارية على كتلة العينة تغطي كامل رقائق البطاطس.
   4. إغلاق الغطاء وتبدأ بكر تشغيل، تطبق الشروط التالية: عقد في 96 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ دورات 45 من 60 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ عقد 60 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ عقد في 4 درجات مئوية. إيقاف cycler الحراري وذوبان الجليد الرقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يجب إجراء تحليل رقاقة خلال ساعة واحدة.
4. تحليل رقاقة
   1. افتح غطاء للصك وإزالة الوسادات الحرارية، ثم إزالة الرقائق من المحولات.
      ملاحظة: تخزين الرقائق في موقع داكنة ونظيفة حتى التحليل.
   2. تنظيف سطح الرقاقة مع الايزوبروبانول ومسح عقيمة.
      ملاحظة: فحص كل شريحة لتسرب أو المشاكل المحتملة.
   3. إدراج USB في النظام الكاشف لحفظ البيانات.
   4. فتح علبة رقاقة نظام كشف وتحميل رقاقة الوجه للأعلى في الموضع الصحيح ثم قم بإغلاق علبة الورق.
   5. انتظر 30 s للمعالجة، ثم إزالة الرقائق وإدراج واحد القادم.
   6. انتظر تحليل للانتهاء بالنسبة لجميع الشرائح المجهزة ثم إدراج USB في جهاز كمبيوتر لنقل الملفات.
      ملاحظة: الوقت الإجمالي للتحليل هو حوالي 2 إلى 3 دقيقة/رقاقة.

4-بيانات التحليل والتفسير

1. قم بتوصيل منصة المستندة إلى مجموعة النظراء البرمجيات اللازمة للقيام بجميع التحاليل المتلقين للمعلومات.
2. إنشاء مشروع واستيراد كافة ملفات البيانات من الرقائق الفائدة.
3. قم بإدخال اسم العينة؛ حدد صبغ والمقايسة المستخدمة في علامة التبويب "تعريف رقائق".
4. تحديد ما إذا كان الرقاقة مقبولة بتصور أنه في علامة التبويب "مراجعة البيانات"، التحقق من مدى دقة العينة كانت محملة على الرقاقة وكم عدد نقاط البيانات من المدانين.
   ملاحظة: رفض رقائق مع 13,000 أقل من نقاط البيانات المدانين.
5. الانتقال إلى مؤامرة مبعثر رقاقة المحددة على الجانب الأيمن من الشاشة؛ تطبيق عتبة 000 6 إشارات صبغ مراسل أميديتي (الاتحاد الماليزي) fluorescein المحور (ص) من جميع الشرائح.
   ملاحظة: قد تختلف عتبة أنشئت على أساس الاختبارات المستخدمة.
6. إزالة أي إشارات إيجابية مشكوك فيها لمنع النتائج الإيجابية الكاذبة عن طريق تحديد بقعة النسبي على مبعثر الأرض باستخدام أداة الحبل والضغط على "غير محدد". جميع النقاط الإيجابية المتبقية وتشير إلى وجود نسخ كدنا الهدف نادرة تم تحليلها.

النتائج

استخدام الإجراء المعروضة هنا، نحن فحص للتعبير عن البديل نسخة نادرة CDH1a في الأنسجة المجمدة الطازجة المعدة. وأجرى التحليل دبكر على إقران 21 عينات الأنسجة العادية والسرطان وفي عينات إضافية الورم 11. CDH1a كان من الممكن اكتشاف الأورام 15 من أصل 32 (47%)، بينما أي عينات أنسجة...

Discussion

دبكر وضعت أصلاً للحمض النووي الجزيئي القياسات^10،11،،من¹²¹³ وفي وقت تم تكييف هذه التكنولوجيا للتحديد الكمي ميكرورناس، والجيش الملكي النيبالي النصوص^{5، ،}من ¹⁴¹⁵. في هذا البر?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084