Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

Resumo

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

Resumo

CDH1a, uma transcrição não-canônicos do gene CDH1 , foi encontrado para ser expressa em algumas linhas de células de câncer gástrico (GC), Considerando que está ausente na mucosa gástrica normal. Recentemente, nós detectamos variante de transcrição CDH1a em tecidos de tumor fresco congelado obtidos de pacientes com GC. A expressão desta variante em amostras de tecido foram investigada pela microplaqueta digital PCR (dPCR) abordagem aqui apresentada. dPCR oferece o potencial para uma medição precisa, robusta e altamente sensível de ácidos nucleicos e é cada vez mais utilizada para muitas aplicações em diferentes campos. dPCR é capaz de detectar alvos raros; Além disso, dPCR oferece a possibilidade de quantificação absoluta e precisa de ácidos nucleicos, sem a necessidade de calibradores e curvas padrão. Na verdade, o particionamento de reação enriquece o alvo do plano de fundo, o que melhora a eficiência de amplificação e tolerância aos inibidores. Tais características fazem dPCR uma ferramenta ideal para a deteção da transcrição CDH1a rara.

Introdução

O gene CDH1 codifica para E-caderina, um factor-chave envolvidos na manutenção do epitélio gástrico normal através da regulamentação de¹, de adesão, sobrevivência, proliferação e migração celular. Perda de proteína E-caderina, como resultado do germline deletério ou alterações somáticas de CDH1 tem sido associadas com o desenvolvimento de GC^2,3. Non-canônico transcrições decorrentes intrão 2 do gene também tem sido a hipótese para desempenhar um papel na carcinogênese gástrica^4,5. Em particular, uma tal transcrição, CDH1a, foi mostrada para ser expressa em células no GC, mas está ausente do estômago normal⁴. Recentemente detectamos CDH1a em amostras de tecido do GC de pacientes do GC usando chip baseada dPCR⁵. dPCR foi utilizado para avaliar, pela primeira vez, a presença da transcrição do gene CDH1a em GC intestinal e no tecido normal.

O método padrão-ouro para determinar a expressão do gene é PCR quantitativo em tempo real (qPCR). No entanto, os dados resultantes podem às vezes ser variável e de má qualidade, especialmente quando o nível do alvo na amostra é baixo. Esta variabilidade pode ser causada por contaminantes, que inibem a atividade do polymerase e recozimento da primeira demão, levando a amplificação não-específica e o lado competitivo reações⁶.

Embora os princípios básicos de bioquímicos da dPCR são semelhantes da qPCR, dPCR mostra algumas vantagens, permitindo medidas muito precisas do DNA genômico (gDNA) / complementar as moléculas de DNA (cDNA). Com efeito, dPCR é uma reação de ponto de extremidade que depende o particionamento calibrado de uma amostra em milhares de poços, para que cada um contém bem zero ou uma molécula alvo único. Então, amplificação ocorre apenas em poços que contém uma cópia do alvo e é indicada por um sinal fluorescente. O número absoluto de moléculas-alvo na amostra original, então, pode ser calculado determinando a proporção de positivos para totais partições usando binomial Poisson estatísticas⁷.

Além disso, a técnica de dPCR elimina a necessidade para a execução de uma curva padrão e, portanto, o viés associado e variabilidade, permitindo uma quantificação directa de alvos^8,9; produz resultados mais precisos e reprodutíveis independentemente de contaminantes e eficiência devido a sua alta tolerância a inibidores de¹⁰; é mais sensível e específico que qPCR e, portanto, é um método confiável para a detecção de um destino de rara. Finalmente, o particionamento da amostra em várias reações reduz a competição com moléculas de fundo e melhora o limite de detecção de alvo, possibilitando a amplificação e facilitar a detecção de moléculas simples de gDNA/cDNA⁶ . A detecção e quantificação de ácidos nucleicos por chip baseada dPCR foi cada vez mais aplicado para copiar número variação, fragmentos de quantificação de DNA e mutação analisa^11,12,13, dada a precisão e material de baixa exigência do método de entrada. Além disso, dPCR recentemente foi integrada a análise de ambos os microRNAs¹⁴ e gene transcrições^5,15.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana do IRST.

Nota: Este procedimento é projetado especificamente para a detecção de um reduzido número de moléculas de cDNA em tecidos humanos fresco congelado. As secções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congelado, previamente validado tumor gástrico paciente-derivado ou amostras de tecido normal.

1. purificação e isolamento de RNA

1. Extração de RNA
   Nota: A isolação do RNA é executada sob o capô, usando um produto específico (ver Tabela de materiais). No entanto, uma variedade de kits de isolamento estão comercialmente disponíveis.
   1. Homogeneizar 50-100 mg de amostra de tecido finamente cortada de fresco congelado em um tubo de 1,5 mL com 1 mL do reagente de isolamento de RNA e vórtice vigorosamente durante 15 s. Incubar os tubos a-80 ° C durante a noite.
   2. Incubar o tubo contendo a amostra em temperatura ambiente por 5 min e mistura vortexing por 15 s.
   3. Mantenha o tubo no gelo, adicionar 200 µ l de clorofórmio e vórtice vigorosamente durante 15 s.
   4. Incubar os tubos à temperatura ambiente por 60 s e centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
   5. Transferir a fase aquosa em um tubo de 1,5 mL e adicionar 20 µ g de glicogênio.
      Nota: É importante evitar cuidadosamente transferir qualquer interfase ou camada orgânica a fim de reduzir a contaminação.
   6. Adicione 500 µ l de isopropanol, inversão do tubo para misturar e incubar no gelo por 10 min.
   7. Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C, para precipitar o RNA.
      Nota: RNA estará presente em uma pelota gelatinosa do lado e o fundo do tubo, muitas vezes invisível após a centrifugação.
   8. Remover o sobrenadante sem perturbar o precipitado e lave-a com 1 mL de etanol a 75% por pipetagem.
   9. Centrifugar o tubo a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   10. Deixe o sedimento secar até que o precipitado torna-se transparente e dissolvê-lo em 50 µ l de água livre de RNase.
   11. Congele as amostras a-80 ° C pelo menos durante a noite antes de quantificação.
2. Eliminação de DNA genômica e purificação de RNA
   Nota: Um passo de digestão de DNase, seguido por uma purificação de RNA baseados em colunas, é recomendado para análises de baixa abundância Alvos para digerir o DNA contaminante.
   1. Dissolva o liofilizado DNase I (1.500 Kunitz unidades) em 550 µ l de RNase-livre da água utilizando uma seringa, misture gentilmente por inversão do frasco e dividir a solução reconstituída em alíquotas.
   2. O volume calculado da amostra com 15 µ g de RNA de transferência em um tubo de 1,5 mL, 10 µ l de DNase digestão buffer do kit (listados na Tabela de materiais), 2,5 µ l de DNase solução estoque e RNase-livre da água a 100 µ l. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
   3. Adicione 350 µ l de tampão de lise do tecido (do kit, consulte Tabela de materiais) e misture por pipetagem.
   4. Adicione 250 µ l de etanol 100% e misture por pipetagem.
   5. Transferir todo o volume (700 µ l) em uma nova coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 15 s.
   6. Transferir o filtro para um novo tubo de coleção, adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 2 min.
   7. Abra a tampa da coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 5 min com um novo tubo de coleta para secar o filtro; Depois de transferir o filtro para um tubo de 1,5 mL.
   8. Adicione 14 µ l de água livre de RNase diretamente para a coluna de filtro e centrifugar a 12.000 x g por 1 min.
   9. Mantenha as amostras no gelo e proceder à quantificação usando 2 µ l da amostra em um Espectrofotômetro de bancada ou armazenar o RNA a-80 ° C até o uso.

2. síntese de cDNA

1. Lugar de 1.000 ng do RNA, 4 µ l do mix mestre, 1 µ l de transcriptase reversa e água livre de RNase, até um volume final de 20 µ l em um tubo estéril de PCR. Misture delicadamente e spin para baixo.
2. Incubar a mistura de reação em um termociclador, aplicando as seguintes condições: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C.
3. Os tubos de centrifuga brevemente e proceder à análise dPCR ou armazenar a-20 ° C até ser necessário.

3. reação de PCR digital setup

1. reação de dPCR misturar e preparação da amostra
   1. Descongele o mestre mix e o ensaio à temperatura ambiente pelo menos 20 min.
   2. Diluir as amostras de cDNA a uma concentração de 300 ng em 6 µ l de água.
   3. Delicadamente, vórtice o mestre misturar e preparar a mistura em um tubo estéril com 8.7 µ l do mix mestre, 0,87 µ l do primer personalizado projetado ensaio CDH1a e 1.83 µ l de água livre de nuclease para um volume final de 11,4 µ l.
      Nota: Para detalhes de primeira demão CDH1a personalizado projetado ensaio consulte a Tabela de materiais.
   4. Transferência de 11,4 µ l da mistura preparada para a amostra diluída do cDNA, misture delicadamente e brevemente centrifugar.
      Nota: Os Volumes incluem excesso de 20% para compensar a perda de volume de pipetagem. Prepare a mistura para todas as amostras e um controle modelo não (NTC).
2. Preparação da microplaqueta
   Nota: Para obter melhores resultados carregar os chips mais rápido possível.
   1. Conecte o carregador a microplaqueta e esperar até que a luz indicadora fica verde.
   2. Retire a tampa da seringa fluido imersão puxando suavemente o êmbolo 1-2 mm e liberá-lo para facilitar essa etapa e substituí-lo com uma dica.
   3. Pegue um novo chip e tome nota do código escrito na tampa para associá-la com a amostra.
   4. Segure a tampa com cuidado, por seu lado, descascar afastado a película protetora e coloque a tampa com a cara pegajosa na orientação correta.
   5. Cuidadosamente pegue um chip, tomando cuidado para não tocar na parte interna e carregá-lo em ninho chip na posição correta, pressionando para baixo a alavanca para abrir a pinça.
   6. Carregar uma nova lâmina de carregamento sobre o carregador e empurre suavemente para garantir que é firmemente no lugar.
   7. Transferência de 14,5 µ l do mix dPCR reação sobre a lâmina de carregamento sem fazer bolhas de ar ou desviando a lâmina, depois que a imprensa o preto carregando o botão para distribuir o volume no chip.
   8. Use a seringa de fluido de imersão para transferir cerca de 20 gotas na superfície da microplaqueta, tomando cuidado para não tocar na superfície com a ponta.
      Nota: É importante cobrir toda a superfície sem derramar o líquido sobre as bordas.
   9. Gire o braço de carregador para fazer a tampa, entrar em contacto com o chip e pressione para baixo para 15 s.
   10. Pressione o botão da tampa para liberar o chip e coloca o braço para a posição.
   11. Segure o chip montado em um ângulo de 45° e cuidadosamente dispensar o líquido de imersão com a seringa através da porta de preenchimento, girar o chip ligeiramente para certificar-se de que há nenhuma bolha de ar e remover qualquer excesso de líquido com uma limpeza sterile.
   12. Fechar o caso do chip por descascar fora delicadamente a etiqueta em cima do chip tampa e pressione sobre a porta de preenchimento pelo menos 5 s.
   13. Armazene o chip no escuro até que esteja pronto para carregar no termociclador.
       Nota: Fichas preparadas devem ser usadas até 2 horas.
3. reação de dPCR
   1. Abra a tampa e instale os adaptadores para ambos os blocos, mesmo quando é usado um único bloco.
   2. Coloque as fichas sobre o bloco de amostra na posição correta.
      Nota: A porta de preenchimento deve ser orientada para a frente do termociclador em posição elevada para permitir que quaisquer bolhas de ar para flutuar para o topo sem perturbar a janela do chip. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.
   3. Coloque a almofada térmica sobre o bloco de amostra para cobrir completamente as fichas.
   4. Feche a tampa e começar a PCR executar, aplicando as seguintes condições: Segure a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min e 98 ° C por 30 s; Segure a 60 ° C por 2 min; manter a 4 ° C. Desligue o termociclador e descongelar os chips em temperatura ambiente pelo menos 10 min.
      Nota: Análise de Chip deve ser realizada dentro de uma hora.
4. Análise da microplaqueta
   1. Abra a tampa do instrumento e retirar as almofadas térmicas e, em seguida, remover os chips de adaptadores.
      Nota: Guarde as fichas em um local escuro, limpo, até a análise.
   2. Limpe a superfície do chip com isopropanol e uma limpeza estéril.
      Nota: Inspecione cada chip para vazamentos ou problemas potenciais.
   3. Insira o cabo USB o sistema detector para salvar os dados.
   4. Abra a bandeja do chip do sistema detector, carregar o chip voltado para cima na posição correta e feche a bandeja.
   5. Espere 30 s para processamento, então retire o chip e inserir o outro.
   6. Espere que a análise seja concluída para todos os chips transformados, em seguida, inserir o USB em um computador para transferir os arquivos.
      Nota: O tempo total para análise é cerca de 2 a 3 min/chip.

4. interpretação e análise de dados

1. Ligue para a plataforma de software baseado em nuvem necessária para realizar todas as análises a jusante.
2. Criar um projeto e importar todos os arquivos de dados dos chips de interesse.
3. Digite o nome da amostra; Selecione o corante e ensaio utilizado na aba "Definir Chips".
4. Determine se o chip é aceitável, visualizando-a na guia "Dados de revisão", verificando como completamente a amostra foi carregada para o chip e quantos pontos de dados são avaliáveis.
   Nota: Rejeitar chips com menos de 13.000 pontos de dados avaliáveis.
5. Avançar para o gráfico de dispersão do chip selecionado no lado direito da tela; aplica um limite de 6.000 para os sinais de corante fluoresceína amidite (FAM) repórter (eixo y) para todos os chips.
   Nota: O limite configurado pode variar com base em ensaios os usados.
6. Remover quaisquer sinais positivos duvidosos para evitar resultados falso-positivos, selecionando o ponto relativo sobre o scatter plotagem usando a ferramenta laço e pressionar em "indeterminado". Todos os restantes pontos positivos indicam a presença de cópias do cDNA do raro alvo analisado.

Resultados

Usando o procedimento aqui apresentado, verificamos para a expressão da variante rara de transcrição CDH1a em tecidos gástricos fresco congelado. A análise por dPCR foi realizada em amostras de tecido normal e câncer 21-emparelhado e em 11 amostras de tumor adicionais. CDH1a foi detectável em tumores 15 de 32 (47%), Considerando que não há amostras de tecido normal mostraram a presença desta transcrição rara⁵. Em nossa análise, chips ...

Discussão

dPCR foi originalmente desenvolvido para DNA molecular medições^10,11,12,13 e no tempo que essa tecnologia foi adaptada para a quantificação de microRNAs e RNA transcritos^{5, 14,15}. Neste protocolo, ampliamos a lista de aplicativos que incluem detecção de transcrições raras derivada de amostras ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084