Обнаружение CDH1 редких Стенограмма вариант в тканях свежемороженые рака желудка на основе чипа цифровой ПЦР

Резюме

Рукопись описывает на основе чипа цифровой ПЦР анализа обнаружить редкий вариант Стенограмма CDH1 (CDH1a) в свежезамороженной нормальных и опухолевых тканей, полученных от пациентов с раком желудка.

Аннотация

CDH1a, нестандартные Транскрипт гена CDH1 , было установлено, выражаться в некоторых линий клетки рака желудка (GC), тогда как она отсутствует в нормальной слизистой оболочки желудка. Недавно мы обнаружили CDH1a Стенограмма вариант в свежезамороженной опухолевых тканей, полученных от больных с GC. Выражение этого варианта в образцах тканей были исследованы чип-подход на основе цифровой ПЦР (dPCR) представлены здесь. dPCR предлагает возможности для точной, надежной и высокочувствительный измерения нуклеиновых кислот и все чаще используется для многих приложений в различных областях. dPCR способен обнаруживать редких целей; Кроме того dPCR предлагает возможность абсолютного и точной количественной оценки нуклеиновых кислот без необходимости для калибраторов и стандартных кривых. В самом деле секционирование реакции обогащает целевой объект от фона, который улучшает эффективность усиления и терпимости к ингибиторам. Такие характеристики делают dPCR оптимальный инструмент для выявления редких стенограмме CDH1a .

Введение

CDH1 ген кодирует для E-Кадгерины, участвующих в поддержании нормальной желудка эпителия через регулирование клеток адгезии, выживание, распространением и миграции¹является ключевым фактором. Потеря E-Кадгерины белка в результате пагубного микрофлорой или соматические изменения CDH1 был связан с развитием GC^2,3. Non канонические стенограммы, вытекающих из Интрон 2 гена также предположить, чтобы играть роль в желудка канцерогенеза^4,5. В частности, один из таких стенограмма, CDH1a, было показано, что выражается в GC клеточных линий, но отсутствует от нормальной желудке⁴. Мы недавно обнаруженных CDH1a в образцах тканей GC от GC больных с использованием основанных на чип dPCR⁵. dPCR был использован для оценки, в первый раз, присутствие Транскрипт гена CDH1a в кишечных GC и в нормальной ткани.

Метод золотого стандарта для определения экспрессии генов является Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР). Однако результирующие данные могут иногда быть переменной и плохого качества, особенно когда уровень целевого в образце является низким. Эта изменчивость может быть вызвано примеси, которые ингибируют активность полимеразы и отжига праймера, усиление неспецифической и конкурентные стороны реакции⁶.

Хотя основные принципы биохимических dPCR аналогичны ПЦР, dPCR показывает некоторые преимущества, позволяющие очень точные измерения геномной ДНК (геномная ДНК) / дополнительные молекулы ДНК — (cDNA кДНК). Действительно dPCR является конечной точки реакции, которая опирается на калиброванных разделения образца на тысячи скважин, так что каждый хорошо содержит ноль или молекуле одну цель. Усиление затем происходит только в скважинах, содержащий копию целевого и обозначается флуоресцентного сигнала. Абсолютное количество молекул-мишеней в исходного образца вычисляется путем определения соотношения позитивного для всего разделов с помощью Биномиальное Пуассона статистика⁷.

Кроме того, метод dPCR устраняет необходимость для запуска стандартной кривой и, следовательно, связанные предвзятости и изменчивости, что позволяет прямой количественной оценке цели^8,9; Она производит более точные и воспроизводимые результаты независимо от загрязнений и эффективности из-за его высокой толерантностью к ингибиторы¹⁰; Это более чувствительной, чем ПЦР и таким образом является надежным методом для выявления редких целевого объекта. Наконец секционирование образца на несколько реакций снижает конкуренцию с фон молекул и повышает предел обнаружения целей, делая возможным усиление и облегчения выявления одной молекулы геномная ДНК/cDNA⁶ . Обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на чипе dPCR чаще применялся скопировать номер изменения, количественного определения ДНК фрагментов и мутации анализирует^11,12,13, учитывая точность и низкий материал ввода требование метода. Кроме того dPCR недавно было включено в анализ обоих микроРНК¹⁴ гена стенограммы^5,и¹⁵.

протокол

Протокол следует принципам IRST человека исследовательского комитета этики.

Примечание: Эта процедура разработан специально для обнаружения низкое количество cDNA молекул в тканях человека свежемороженые. В разделах ткани были сокращены на сухой лед, хотя по-прежнему заморожены, из ранее утвержденных пациента производные опухоли желудка или образцов нормальной ткани.

1. РНК изоляция и очищение

1. Извлечение RNA
   Примечание: РНК изоляции производится под капотом, с использованием конкретного продукта (см. Таблицу материалы). Однако коммерчески доступны различные наборы изоляции.
   1. Однородный 50-100 мг мелко нарезанного свежемороженые ткани образца в 1,5 мл трубки с 1 мл раствора реагента изоляции РНК и вихревой энергично для 15 s. инкубировать трубы-80 ° c на ночь.
   2. Инкубировать трубка, содержащая образец при комнатной температуре за 5 минут и перемешать с vortexing для 15 s.
   3. Держите трубку на льду, 200 мкл метилхлороформа и вихрь энергично для 15 s.
   4. Инкубировать трубы при комнатной температуре за 60 сек и центрифуги на 12000 g x 15 мин при 4 ° C.
   5. Передача водной фазе в 1,5 мл трубку и добавить 20 мкг гликогена.
      Примечание: Важно тщательно избегать передачи интерфаза или органического слоя для того, чтобы уменьшить загрязнение.
   6. 500 мкл изопропанола, инвертирование трубки для микширования и инкубировать на льду за 10 мин.
   7. Центрифуга трубки на 12000 g x 15 мин при температуре 4 ° C ускорять РНК.
      Примечание: РНК будет присутствовать в Пелле гель как на стороне и нижней части трубки, часто невидимые после центрифугирования.
   8. Удалить супернатант не нарушая осадок и мыть его с 1 мл 75% этанола, закупорить.
   9. Центрифуга для трубки на 7500 g x 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант не нарушая гранулы.
   10. Пусть гранулы сухого пока осадок становится прозрачным и растворить его в 50 мкл РНКазы свободной воды.
   11. Замораживание образцов-80 ° C по меньшей мере на ночь перед количественной оценки.
2. Ликвидация геномной ДНК и РНК
   Примечание: DNase пищеварение шаг, после очищения RNA на основе столбцов, рекомендуется для анализа низкой изобилие целей для того, чтобы переваривать загрязняющих ДНК.
   1. Растворите лиофилизированные DNase I (1500 Кунитц единиц) в 550 мкл РНКазы свободной воды с помощью шприца, смесь осторожно, переворачивать флакон и разделить на аликвоты восстановленный Стоковый раствор.
   2. Передача в 1,5 мл расчетный объем выборки с 15 мкг РНК, 10 мкл DNase пищеварение буфер из комплекта (перечислены в Таблице материалы), 2,5 мкл DNase Стоковый раствор и РНКазы свободной воды на 100 мкл. инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
   3. 350 мкл буфера lysis ткани (из комплекта, см. Таблицу материалы) и перемешать, закупорить.
   4. Добавьте 250 мкл, 100% этанола и микс, закупорить.
   5. Перевести весь объем (700 мкл) в новый столбец спин и центрифуги на 12000 g x 15 s.
   6. Перевести фильтр в новой коллекции трубки, 500 мкл 80% этанола для столбца и центрифуги на 12000 x g на 2 мин.
   7. Откройте крышку спин столбца и центрифуги на 12000 g x 5 мин с новой коллекции трубки для просушки фильтра; Затем перенесите фильтр 1,5 мл.
   8. Мкл 14 РНКазы свободной воды непосредственно в столбец Фильтр и центрифуги на 12000 x g за 1 мин.
   9. Образцы на льду и провести количественную оценку, используя 2 мкл пример на скамейке Топ спектрофотометр или хранить РНК-80 ° c до использования.

2. синтез cDNA

1. Место 1000 нг РНК, 4 мкл мастер смеси, 1 мкл обратной транскриптазы и РНКазы свободной воды в окончательный объем 20 мкл в стерильную ПЦР-пробирку. Осторожно перемешать и спин вниз.
2. Инкубировать реакция смеси в тепловой велосипедист, применяя следующие условия: 5 мин при 25 ° C, 30 мин при 42 ° C, 5 мин при 85 ° C.
3. Центрифуга трубы кратко и приступить к анализу dPCR или хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется.

3. реакции PCR Цифровая настройка

1. реакция dPCR смешать и пробоподготовка
   1. Оттепель мастер смеси и пробирного при комнатной температуре по крайней мере 20 мин.
   2. Развести образцы cDNA к концентрации 300 нг в 6 мкл воды.
   3. Аккуратно вихревой мастер смешивать и готовить смеси в стерильную пробирку с 8.7 мкл Мастер микс, 0,87 мкл CDH1a пользовательских разработанных пробирного грунтовки и 1,83 мкл нуклеиназы свободной воды для окончательного объема 11.4 мкл.
      Примечание: Для CDH1a пользовательских разработанных пробирного грунтовка подробная Таблица материалов.
   4. Передать образец разбавленный cDNA 11.4 мкл раствора, осторожно перемешать и кратко центрифуги.
      Примечание: Тома включают избыток 20% для компенсации потери объема от закупорить. Подготовьте смесь для всех образцов и не управления шаблона (NTC).
2. Подготовка чип
   Примечание: Для оптимальных результатов как можно скорее загрузить фишки.
   1. Подключите в загрузчик чип и подождите, пока индикатор становится зеленым.
   2. Снимите колпачок с шприца жидкости погружения, осторожно потянув назад поршень 1-2 мм и выпускать его для облегчения этот шаг и заменить его с наконечником.
   3. Возьмите новый чип и принять к сведению часть кода, написанного на крышке, чтобы связать его с образцом.
   4. Держите крышку тщательно ее стороной, удаляйте защитную пленку и поместите крышку с липкой стороной вверх в правильной ориентации.
   5. Тщательно подобрать чип, стараясь не касаться внутренней части и загрузить его на чип гнездо в правильном положении, нажимая на рычаг, чтобы открыть зажим.
   6. Загрузить новое лезвие загрузки на загрузчик и толкать его осторожно, чтобы убедиться, что это твердо на месте.
   7. Передача 14,5 мкл dPCR реакция смеси на лезвие загрузки без делать пузырьки воздуха или отклоняющий лезвие, после которого пресс черный загрузки кнопка распределить объем на чипе.
   8. Используйте для передачи около 20 капель на поверхности чипа, стараясь не прикасаться к поверхности с кончика шприца жидкости погружения.
      Примечание: Важно покрыть всю поверхность без разлива жидкости по краям.
   9. Повернуть руку погрузчик, чтобы сделать крышку соприкасаться с чипа и нажмите вниз на 15 s.
   10. Нажмите кнопку крышки освободить чип и вернуть руку к его позиции.
   11. Держите собрал чип под углом 45° и тщательно обойтись жидкость погружения с шприцем через порт заполнения, повернуть чип слегка, чтобы убедиться, что есть нет пузырьков воздуха и удалить любой избыток жидкости стерильной салфеткой.
   12. Печать в случае чип, мягко пилинг от метки поверх чип крышки и нажмите через порт заливки для по крайней мере 5 s.
   13. Храните чип в темноте до готовности для загрузки в тепловая велосипедист.
       Примечание: Подготовленные фишки должны быть использованы в течение 2 ч.
3. dPCR реакция
   1. Откройте крышку и установите адаптеры для обоих блоков, даже когда используется единый блок.
   2. Разместите фишки на блоке образца в правильном положении.
      Примечание: Порт заполнения должны быть сориентированы на передней части тепловой циклователь на возвышенности разрешить любые воздушные пузыри плыть к верхней не нарушая окна чипа. Используйте пустой фишек баланс двух блоков.
   3. Положите термальная пусковая площадка на блок образца, чтобы полностью покрыть фишки.
   4. Закройте крышку и начать ПЦР запуска, применяя следующие условия: держать на 96 ° C в течение 10 минут; 45 циклов 60 ° C на 2 мин и 98 ° C за 30 сек; Держите на 60 ° C на 2 мин; Держите на 4 ° C. Выключить тепловая велосипедист и размораживать фишки при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 минут.
      Примечание: Чип анализ должны быть выполнены в течение одного часа.
4. Анализ чип
   1. Откройте крышку прибора и Снимите термоохлаждающие накладки, а затем удалите фишки из адаптеров.
      Примечание: Храните фишки в темный, чистый до анализа.
   2. Очистите поверхность чип с изопропанол и стерильные протирают.
      Примечание: Проверьте каждый чип для утечки или потенциальные проблемы.
   3. Вставьте USB в системе детектора для сохранения данных.
   4. Открыть лоток детектор системы, загрузить чип лицом вверх в правильном положении и затем закройте лоток.
   5. Подождите 30 s для обработки, затем удалите чип и вставьте следующий.
   6. Подождите, для анализа для всех обработанных чипов будет завершено, а затем вставьте USB в компьютер для передачи файлов.
      Примечание: Общее время для анализа составляет около 2-3 мин/чип.

4. анализ данных и интерпретации

1. Подключиться к облачной программного обеспечения платформы, необходимые для выполнения всех вниз по течению анализов.
2. Создайте проект и импортировать все файлы данных чипов интерес.
3. Введите имя образца; Выберите красителя и анализа, используемые в закладке «Определить фишки».
4. Определите, приемлемо ли чип, мысленно представляя ее в закладке «Обзор данных», проверка как тщательно образца была погружена чипа и сколько точек данных из доступных.
   Примечание: Отклонить фишки с менее чем 13.000 анализу данных точек.
5. Перейти к точечной выбранной микросхемы на правой стороне экрана; применить порог 6000 флуоресцеин amidite (FAM) репортер краситель сигналов (ось y) все фишки.
   Примечание: Настройка порога может меняться на основе анализов используется.
6. Удалите любые сомнительные позитивные сигналы для предотвращения ложных положительных результатов, выбрав относительной пятно на разброс участок с помощью инструмента «Лассо» и нажав на «не определено». Все остальные положительные пятна указывают на наличие cDNA копий редких целевого анализа.

Результаты

С помощью процедуры, представленные здесь, мы проверили для выражения редких Стенограмма вариант CDH1a в тканях желудка свежемороженые. Был проведен анализ на dPCR, на 21-паре образцов нормальных и злокачественных тканей и 11 дополнительных опухоли образцов. CDH1a бы...

Обсуждение

dPCR был первоначально разработан для ДНК молекулярные измерения^10,11,12,13 и время, когда эта технология была адаптирована для количественной оценки микроРНК и РНК стенограммы^{5, 14,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084