JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن من هيستونيس المعدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي بعد ذلك تستخدم ل PCR الكمي لاستجواب بوفرة والتعريب من التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال في جميع أنحاء الجينوم.

Abstract

التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال (بتمس)، مثل أسيتيليشن ومثلايشن الفسفرة، بشكل حيوي ينظم سلسلة من الإنزيمات إضافة أو إزالة هذه العلامات في استجابة لإشارات تتلقاها الخلية. هذه بتمس مساهم رئيسي في تنظيم عمليات مثل التحكم في التعبير الجيني وإصلاح الحمض النووي. وقد إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهجاً مفيداً لتشريح وفرة وتوطين العديد من هيستون بتمس في جميع أنحاء الجينوم ردا على الاضطرابات المتنوعة للخلية. هنا، يتم وصف أسلوب متعدد الاستخدامات لأداء رقاقة هيستونيس بوستترانسلاتيونالي معدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (س. سيريفيسيا) . يعتمد هذا الأسلوب على كروسلينكينج من البروتينات والحمض النووي باستخدام العلاج فورمالدهايد الخميرة الثقافات، جيل من الخميرة ليساتيس بحبه الضرب، solubilization الشظايا الكروماتين نوكلاس ميكروكوككال، وإيمونوبريسيبيتيشن من الحمض النووي هيستون المجمعات. هو تنقية الحمض النووي المرتبطة بعلامة هستون من الفائدة وإخضاعها لتحليل PCR الكمي لتقييم تخصيبها في مواقع متعددة في جميع أنحاء الجينوم. وتناقش تجارب تمثيلية السبر إضفاء الطابع المحلي على علامات هيستون H3K4me2 و H4K16ac في wildtype والخميرة متحولة لإثبات تحليل البيانات وتفسيرها. هذا الأسلوب هو مناسبة لمجموعة متنوعة من هيستون بتمس ويمكن أن يؤديها مع سلالات متحولة مختلفة أو حضور الضغوط البيئية المتنوعة، يجعلها أداة ممتازة للتحقيق في التغيرات في ديناميات الكروماتين تحت ظروف مختلفة.

Introduction

تعديل دينامية بوستترانسلاشونال (PTM) هيستونيس إليه تنظيمية رئيسية لكثير من العمليات موجودة في قالب الحمض النووي، بما في ذلك النسخ والنسخ المتماثل وإصلاح الحمض النووي1،2. القدرة على تحديد وفرة والترجمة الدقيقة لتعديل histones المتزامن مع هذه العمليات ذا أهمية حاسمة لفهم تنظيمها تحت ظروف مختلفة في الخلية. تطوير إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) كطريقة إلى حد كبير نابع من الدراسات البيوكيميائية لتفاعلات البروتينات مع الحمض النووي، ولا سيما في المختبر طرق استخدام كروسلينكيرس الكيميائية، إلى جانب الحاجة إلى تقييم الطبيعة الديناميكية للبروتين-الحمض النووي التفاعلات في الجسم الحي ، وفي مناطق محددة من الجينوم3،،من45. كما وسعت النهوض PCR الكمي (qPCR) وتقنيات التسلسل القدرة على القيام بتجارب رقاقة مع المقارنات الكمية وعبر جينومات كاملة، يجعلها أداة قوية لتشريح التفاعلات الحمض النووي من البروتين في مستويات متعددة.

حاليا، رقاقة أسلوب مطلوبة لأي فريق الأبحاث المهتمة في تنظيم الكروماتين بوساطة الجينوم كما توجد أية أساليب مماثلة لمباشرة استجواب الصلة المادية بين من هستون تعديل وموضع محدد المجينية في فيفو. على الرغم من الاختلافات في هذا الأسلوب باستخدام تسلسل الجيل القادم لخريطة التعديلات هيستون طوال ال6،الجينوم7 المتاحة، هذه النهج قد معالجة المسائل العلمية المختلفة والحجم، والتكلفة وقد حصر الموارد التقنية لبعض المجموعات البحثية. بالإضافة إلى ذلك، qPCR الشريحة المستهدفة اللازمة لتكملة هذه النهج بتوفير أساليب السواء تحسين البروتوكول رقاقة قبل التسلسل والتحقق من صحة النتائج من مجموعات البيانات ابيجينوميك. الكتلي على أساس نهج لتحديد المجموعة الكاملة من هستون علامات المرتبطة بمناطق الجينوم لها أيضا ظهر8،،من910،11، ولكن هذه وقد نهج بعض القيود التي يمكن سبر مناطق الجينوم وأنها تتطلب الخبرة التقنية والأجهزة التي لن تكون متاحة لجميع المجموعات البحثية. ولذلك، يظل رقاقة أسلوب تأسيسية لتحليل في وفرة وتوزيع تعديلات هيستون تحت ظروف متنوعة لجميع المجموعات البحثية المهتمة بالتخلق والكروماتين وتنظيم وظائف الجينوم.

هنا، نحن تصف طريقة لنموذج شريحة باستخدام الخميرة مهدها Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) للتحقيق في توزيع بتمس هستون في الكروماتين. ويعتمد هذا النهج على عدد من العناصر الأساسية للبروتوكولات رقاقة نمواً في الخميرة وتنطبق أيضا على نموذج مختلف نظم12،13. التفاعلات بين histones المعدلة والحمض النووي في الخلية هي الحفاظ crosslinking مع فورمالدهايد. بعد إعداد ليستي، هي solubilized الكروماتين الشظايا إلى شظايا الحجم موحد بالهضم مع نوكلاس ميكروكوككال. تتم إيمونوبريسيبيتيشن هيستونيس المعدلة مع الأجسام المضادة أما تجارية أو إنشاء مختبر وعزل أي الحمض النووي المرتبطة بها وتحليلها لتخصيب اليورانيوم في مناطق الجينوم معينة باستخدام قبكر (الشكل 1). لإدخال تعديلات كثيرة على هستون، الكمية من الحمض النووي التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول كافية لاختبار المكاني الجينوم مختلفة أكثر من 25 من قبكر.

يعد هذا الأسلوب رقاقة تنوعاً عاليا لمراقبة توزيع التعديل هيستون واحد عبر العديد من سلالات متحولة أو الظروف البيئية، أو لاختبار العديد من التعديلات هستون في الخلايا wildtype في عدد من مواضع الجينوم. وعلاوة على ذلك، العديد من مكونات بروتوكول قابلة للتعديل بسهولة لتحسين الكشف عن أما علامات عالية أو المتواضع-وفرة هيستون. وأخيراً، أداء رقاقة histones المعدلة في مهدها الخميرة يتيح الفرصة لاستخدام الضوابط الأساسية لخصوصية جسم متوفرة إلى حد كبير في النظم الأخرى. هما يمكن توليد سلالات الخميرة التي تحمل الطفرات في المخلفات هيستون المستهدفة للتعديل، وفي بعض الحالات، هناك فقط إنزيم واحد أن يحفز التعديل على بقايا هيستون خاصة (على سبيل المثال-يسين هيستون ميثيلترانسفيراسيس). لذلك، يمكن إجراء رقاقة في أما هيستون المسخ أو إنزيم الحذف السلالات الاعتداء مدى التي قد تحدث ملزمة غير محددة من الجسم وتوليد نتائج إيجابية كاذبة. عنصر التحكم هذا هو قيمة خاصة للأجسام المضادة التي وضعت حديثا، وحتى يمكن استخدامها للتحقق من صحة جسم خصوصية للتعديلات هيستون حفظت قبل استخدامها في أنظمة أخرى. ويكمل هذا النهج أساليب أخرى لاختبار الأجسام المضادة النوعية التي تميز بين الدول تعديل مختلفة (مثل مونو-دي-وثلاثي-مثلايشن)، بما في ذلك التدقيق صفائف الببتيدات المعدلة وأداء البقع الغربية من هيستونيس أو نوكليوسوميس مع تعديلات محددة. عموما، رقاقة في مهدها الخميرة طريقة قوية لتقييم ديناميات هيستون بتمس في جميع أنحاء الجينوم وتشريح الآليات التي تحكم تنظيمها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-مرحلة ما قبل ربط جسم مضاد الخرز المغناطيسي

  1. مزيج الخرز المغناطيسي A/G بروتين جيد ونقل 20 ميليلتر من حبات مغناطيسية كل عينة واحدة إيمونوبريسيبيتيشن (IP) إلى أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: عندما بيبيتينج الخرز، استخدم التلميحات تحمل على نطاق، والاحتفاظ بها منخفضة.
  2. ضع الأنبوب مع الخرز في موقف مغناطيسية وتسمح الخرز جمع على الجانب من الأنبوب. إزالة المادة طافية.
  3. أغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من المحلول الملحي الباردة مخزنة تريس (تبس) (50 مم تريس-HCl pH 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم).
  4. إضافة 200 ميليلتر من TBS الخرز والمقدار المناسب من الأجسام المضادة. استدارة لفة في الدقيقة 8 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للعديد من الأجسام المضادة هيستون PTM، 1-3 ميكروغرام لجسم في مجال الملكية الفكرية كافية. ومع ذلك، يوصي بتجارب المعايرة لتحديد التركيزات المناسبة. التركيزات الموصى بها لأجسام PTM هيستون التجارية تتسم جيدا، وغالباً ما تكون دقيقة ويمكن الاطلاع على التقارير المنشورة أو الأدب المنتج.
  5. ضع الخرز في موقف مغناطيسية وإزالة المادة طافية. أغسل لهم مع 1 مل من tbs.
  6. ريسوسبيند الخرز في 20 ميليلتر من تبس كل عينة الملكية الفكرية بالإضافة إلى ميليلتر 5 إضافية (في حالة حدوث خطأ بيبيتينج) من tbs.
    ملاحظة: الخرز يمكن تخزين قصيرة الأجل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2-تنمو خلايا الخميرة

  1. تطعيم 10 مل YPD (استخراج الخميرة 10%، ببتون 20% و 20% سكر العنب) مع مستعمرة واحدة من السلالة المناسبة وأنها تنمو في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة تهز 220 لفة في الدقيقة.
  2. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) ثقافة الخميرة باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تمييع الثقافة ل التطوير التنظيمي600 = 0.2 في 100 مل YPD في قارورة جديدة.
  3. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 220 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى مرحلة منتصف سجل (OD600 = 0.6-0.8).

3. في فيفو كروسلينكينج للبروتينات للحمض النووي

  1. عندما تصل الثقافات إلى سجل منتصف المرحلة، إضافة 2.7 مل من 37% فورمالدهيد مباشرة إلى المتوسط، لتركيز نهائي من 1% فورمالدهايد. نقل قارورة شاكر في 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) واهتز 50 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
  2. إضافة 5 مل من 2.5 م جليكاين إلى المتوسط ويستمر الهز لفة في الدقيقة 50 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إخماد والفورمالديهايد.
  3. نقل الخلايا للطرد المركزي الزجاجات وتدور الخلايا في 5800 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب المادة طافية.
    1. تغسل الخلايا التي ريسوسبيندينج لهم في 45 مل TBS الباردة ونقل التعليق في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تدور الأنبوب في 2800 غ س لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
    2. أغسل الخلايا في 10 مل البرد رقاقة "تحلل المخزن المؤقت" (pH 50 مم تريس-HCl 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا)، نونيديت 1% أوكتيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول (NP-40)، المخزنة في 4 درجات مئوية).
    3. تدور الخلايا في 2800 غ س لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن تجميدها بالنيتروجين السائل الخلايا وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

4-جعل ليساتيس الخميرة

  1. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من "المخزن المؤقت لتحلل رقاقة" الباردة مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف)، وتمييع 1:1,000 مثبط البروتياز الخميرة كوكتيل. نقل التعليق إلى أنبوب ملولبة مل 2.0 التي تحتوي على 200 ميليلتر من الزجاج الخرز.
  2. نقل الخلايا إلى حبة ضرب جهاز للإثارة عالية السرعة في 4 درجات مئوية وحبه للفوز 6 مرات لمدة 30 ثانية كل. تبقى الخلايا على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل بين كل حبة الضرب.
  3. نقل إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام هلام تحميل نصائح. الطرد المركزي في 15,500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر من "المخزن المؤقت الهضم منسى" (10 ملم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم مجكل2، كاكل 21 مم2، 1% التي أرستها-40، المخزنة في 4 درجات مئوية) بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  5. إضافة 2.5 ميليلتر من منسى إلى ردود الفعل. مزجها بلطف بعكس 4-6 مرات واحتضان ذلك فورا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل هضم الظروف عندما يتم استخدام مخزون جديد من منسى. راجع الخطوة 10 للبروتوكول.
  6. فورا بوضع الأنابيب على الجليد لوقف رد الفعل وإضافة 5 ميليلتر يدتا 0.5 M لتركيز نهائي 10 مم يدتا. مزجها بلطف بانعكاس.
  7. الطرد المركزي أن رد الفعل في 15,500 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
    ملاحظة: سوف يكون الكروماتين (هضم) القابلة للذوبان في المادة طافية. بيليه يحتوي على الحطام خلية أي شيء من عسر الهضم وغير قابلة للذوبان.

5-إيمونوبريسيبيتاتي (IP) تعديل هيستونيس

  1. تحديد تركيز البروتين في كسر الكروماتين منسى--الإفراج عن كل استخدام مقايسة برادفورد. أضف 1 مل كاشف برادفورد لكل من الترعة المتاح 8 زائد 1 ومبومو إضافية لكل عينة البروتين لفحصها.
    1. إعداد حل أسهم من 2 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA).
    2. إضافة وحدة التخزين المناسبة لتحقيق تركيزات التالية لجيش صرب البوسنة في 1 مل كاشف برادفورد: 0 ميكروغرام/مل, 0.5 ميكروغرام/ملليلتر، 1 ميكروغرام/مل، 2 ميكروغرام/مل، 4 ميكروغرام/مل، 6 ميكروغرام/مل، 8 ميكروغرام/مل و 10 ميكروغرام/مل. إضافة 2 ميكروليتر الكسر صدر منسى الكروماتين إلى الترعة إضافية.
    3. يغطي الجزء العلوي من كل ومبومو مع قطعة صغيرة من بارافيلم، وعكس الترعة 4-6 مرات لخلط الحل جيدا. احتضان الترعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    4. استخدام جهاز المطياف الضوئي ضوء مرئي، قياس امتصاص في 595 نانومتر للمنحنى المعياري والعينات التجريبية.
      ملاحظة: استخدم ومبومو دون جيش صرب البوسنة (0 ميكروغرام/مل) جهاز المطياف الضوئي قبل أخذ القياس الأولى فارغة.
    5. رسم منحنى قياسي باستخدام قيم امتصاص لتركيزات مختلفة من جيش صرب البوسنة على البرامج المرتبطة جهاز المطياف الضوئي أو برنامج جدول بيانات. استناداً إلى المنحنى المعياري ومعامل التخفيف المستخدمة (1: 500)، استخدم القيم امتصاص لحساب تركيز البروتين لكل من العينات كسر الكروماتين.
  2. للملكية الفكرية، وكل إضافة 50 ميكروغرام من البروتين الكلي من الكسر صدر مناسى الكروماتين على "رقاقة تحلل العازلة" للوصول إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل.
    ملاحظة: إذا كان إعداد IP واحد أو أكثر في ليساتي، وجعل مزيج رئيسي من ليساتي ورقاقة تحلل المخزن المؤقت واليكووت 1 مل لأنابيب الفردية للملكية الفكرية.
  3. إزالة 100 ميليلتر من مزيج الملكية الفكرية للعملية كنموذج الإدخال. تجميد العينة الإدخال في-20 درجة مئوية حتى الخطوة 7، 1.
    ملاحظة: أي عينة الكروماتين المتبقية يمكن أيضا تجميد في-20 درجة مئوية وتستخدم لعنوان IP لاحقة إذا رغبت في ذلك.
  4. إضافة 20 ميليلتر من البروتين المغناطيسي A/G الخرز منضم مسبقاً مع الأجسام المضادة لكل عينة الملكية الفكرية.
تدوير العينة 8 لفة في الدقيقة ح 3 (قياسي)، أو بين ليلة وضحاها (إذا تفضل) في 4 درجات مئوية.

6-يغسل IPs والوتي مجمعات هيستون-الحمض النووي

  1. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسية واسمحوا الخرز جمع إلى جانب الأنبوب. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة. أغسل حبات تباعا مع 1 مل من كل من المخازن المؤقتة أدناه.
    1. أداء كل غسل بتناوب 8 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ووضع الخرز في موقف مغناطيسي، وإزالة المادة طافية، وإضافة المخزن المؤقت التالي: x 2-"رقاقة تحلل المخزن المؤقت", 2 س-"عالية الملح يغسل المخزن المؤقت" (50 مم تريس-HCl pH 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا ، 1% التي أرستها-40، المخزنة في 4 درجات مئوية)، س 1 ليكل/منظفات "الغسيل المخزن المؤقت" (10 ملم تريس-HCl pH 8.0، 250 ملم ليكل، 1 مم يدتا، 1% التي أرستها-40، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 1%، المخزنة في 4 درجات مئوية)، 1 x-الشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl pH 8.0، 1 مم يدتا، المخزنة في 4 درجة مئوية)، و 1 x-الشركة المصرية للاتصالات.
    2. مع الماضي TE الغسيل، نقل الخرز إلى أنبوب جديد باستخدام 0.5 مل من الشركة المصرية للاتصالات لنقل معظم الخرز، ثم آخر مل 0.5 من الشركة المصرية للاتصالات لغسل الأنبوب ونقل حبات المتبقية.
  2. إضافة 250 ميليلتر لتقدم طازجة "شرائح شطف العازلة" (الحزب الديمقراطي الصربي 1%, 1 مم ناكو3). دوامة الحل بإيجاز. قم بتدوير العينات 8 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع الأنبوبة في موقف مغناطيسية وجمع الخرز. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وتجنب الخرز بعناية.
    ملاحظة: يتضمن النذرة البروتينات إيمونوبريسيبيتاتيد والحمض النووي المرتبطة بها.
  4. إضافة ميليلتر 250 آخر رقاقة شطف المخزن المؤقت الخرز. قم بتدوير العينات 8 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب يحتوي على شطف الأولى. إذا لزم الأمر، إزالة وحدة تخزين أصغر (240 ميليلتر) لكل من البرامج المتكاملة لتجنب الإخلال بالخرز.

7-عكس Crosslinks البروتين-الحمض النووي

  1. ذوبان الجليد في نماذج الإدخال وإضافة 400 ميليلتر من "شرائح شطف المخزن المؤقت" لكل إدخال.
  2. لكل من الإدخال ونماذج الملكية الفكرية، إضافة 20 ميليلتر من كلوريد الصوديوم و 5 ميليلتر من الجليكوجين 20 ملغ/مل ميليلتر 12.5 من 20 ملغ/مل مزيج بروتيناز ك. م 5 جيدا بعكس أو التحريك أنابيب. احتضان هذه العينات في حمام مائي 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

8-تنقية وتركيز الحمض النووي

  1. إضافة 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل رناسي A إلى المدخلات ونماذج الملكية الفكرية. احتضان هذه العينات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 600 ميليلتر من الفينول: chlorofrom:isoamyl الكحول (25:24:1 PCI) إلى محلول مائي ومزجها جيدا. تدور لهم في 15,500 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة الطبقة المائية إلى أنبوب جديد. إضافة 600 ميليلتر من PCI ومزجها جيدا. تدور الأنبوب في 15,500 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل الطبقة المائية إلى أنبوب جديد.
      تنبيه: العمل في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع المشروع. التخلص من النفايات السائلة والصلبة حسب تعليمات المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  3. إضافة وحدة التخزين x 0.1 من خلات الصوديوم م 3 و 1 مل من البرد الإيثانول 100% يعجل بالحمض النووي. عكس الأنبوب 4-6 مرات لخلط الحل جيدا. احتضان في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    1. تدور الأنبوب في 15,500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية مع ماصة.
    2. أغسل بيليه في 1 مل من البرد 70% إيثانول. أنها تدور في 15,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية مع ماصة.
    3. أيردري الكريات في غطاء محرك السيارة لحوالي 20 دقيقة (حتى يجف تماما). ريسوسبيند نماذج الملكية الفكرية في 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي وريسوسبيند نماذج الإدخال في 100 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي. تخزين عينات الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى أداء qPCR.

9-الكمي PCR (qPCR) "اكتشاف أثري مناطق الجينوم"

  1. جعل مزيج رئيسي qPCR لكل مجموعة من الإشعال. رد فعل واحد يحتوي على 5 ميليلتر من 2 x qPCR ميكس و 0.25 ميليلتر من 20 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام ميليلتر 0.25 من 20 ميكرومتر عكس التمهيدي.
    ملاحظة: التصميم التمهيدي السليم واختبار لتجارب qPCR الموصوفة في أماكن أخرى14،،من1516.
  2. جعل يمزج الحمض النووي الرئيسي لكل عينة من الحمض النووي. رد فعل واحد يحتوي على 0.5 ميليلتر من الحمض النووي وميليلتر 4.0 من المياه خالية من نوكلياسي.
  3. إضافة 5.5 ميليلتر من مزيج الرئيسي التمهيدي المناسبة و 4.5 ميليلتر من الحمض النووي الرئيسي المزيج المناسب لكل بئر على لوحة qPCR 384-جيدا.
    ملاحظة: ابدأ بإضافة 5.5 ميليلتر من التمهيدي مزيج لكل بئر. تدور اللوحة في 200 غ س ل 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 4.5 ميليلتر من مزيج الحمض النووي.
  4. الالتزام الختم للوحة وتدور في 200 غ س ل 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. أداء قبكر باستخدام نظام قبكر في الوقت الحقيقي مع الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ انصهار منحنى 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية، مع زيادات 0.5 درجة مئوية، 5 ق.
  6. لكل زوج التمهيدي، حساب مدخلات نموذج الملكية الفكرية بالنسبة إلى 5% الإدخال العينة المستخدمة في قبكر المئة. استخدام وسائل تريبليكاتيس بكر التقنية لإجراء العمليات الحسابية.
    ملاحظة: إذا لوحظ اختلاف كبير في تريبليكاتيس بكر، فمن الأفضل أن تكرار qPCR مع إيلاء اهتمام لتكوين مزيج الرئيسي، بيبيتينج الأخطاء والتلوث المتبادل بين الآبار في لوحة 384-جيدا.
    1. قم بضبط القيم الاستبيان المفاهيمي للمدخلات إلى 100% عن طريق طرح عدد الدورات يمثل عامل التخفيف من قيم Cq الخام.
      ملاحظة: إدخال خمسة في المئة يمثل عاملاً من عوامل تخفيف من ضعفا، مما يساوي دورات 4.32 (تسجيل2 20 = 4.32).
    2. حساب نسبة المدخلات ك 2 ^ (الاستبيان المفاهيميالإدخال -الاستبيان المفاهيميIP) مضروباً في 100.

10-تحديد "مناسى خلاصة الشروط" (أوصى المسبقة لشريحة "كاملة أول" تجربة)

  1. اتبع الخطوات 2.1 من خلال 4.4 البروتوكول السابق. توسيع نطاق البروتوكول لتوليد ليساتي ما يكفي لعينات متعددة من الهضم مناسى بيليه المحتوية على الكروماتين. في الخطوة 4، 4، ريسوسبيند الكريات في 1.25 مل مناسى الهضم المخزن المؤقت. قاسمة أنابيب العينات إلى 5 حتى أن بعضها يحتوي على 250 ميليلتر من الكروماتين بيليه حراكه في "المخزن المؤقت الهضم مناسى".
  2. أضف 0، 1، 5، 2، 5 أو 5 ميليلتر مناسى لكل أنبوبة. مزجها بلطف بعكس 4-6 مرات واحتضان فورا هذه الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. وقف ردود الفعل فورا وضع أنابيب على الجليد وإضافة 5 ميليلتر يدتا 0.5 M لتركيز نهائي 10 ملم.
مزيج الحل بلطف بانعكاس.
  • الطرد المركزي هذه الأنابيب في 15,500 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
  • إضافة الحزب الديمقراطي الصربي إلى التركيز النهائي 1% (25 ميليلتر من حل الأسهم 10%) و NaHCO3 إلى التركيز النهائي (25 ميليلتر من حل الأسهم م 1) 0.1 M للعينات في أنابيب 1.5 مل.
  • إضافة 20 ميليلتر من كلوريد الصوديوم و 5 ميليلتر من الجليكوجين 12.5 ميليلتر من البروتيناز 20 ملغ/مل ك م 5 للعينات في أنابيب 1.5 مل. احتضان لهم عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  • إضافة 10 ميليلتر من رناسيا 10 ملغ/مل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  • إضافة 300 ميليلتر من PCI إلى محلول مائي ومزجها جيدا. تدور في 15,500 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة الطبقة المائية إلى أنبوب جديد. إضافة 300 ميليلتر من PCI ومزيج جيد. تدور في 15,500 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل الطبقة المائية إلى أنبوب جديد.
  • إضافة وحدة التخزين x 0.1 من خلات الصوديوم 3 م (عادة ~ 30 ميليلتر) و 1 مل من البرد الإيثانول 100% يعجل بالحمض النووي. عكس الأنبوب 4-6 مرات مزيج جيد. احتضان الأنبوب في-80 درجة مئوية ح 1 أو-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    1. تدور الأنبوب في 15,500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية مع ماصة.
    2. تغسل الكريات في 1 مل من البرد 70% إيثانول. تدور في 15,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. الكريات أيردري في غطاء محرك السيارة حوالي 20 دقيقة (أو حتى يجف تماما). ريسوسبيند الكريات في 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي.
  • إضافة الحمض النووي تحميل صبغ وتشغيل 20 ميليلتر 2% [اغروس] هلام لتصور هضم الحمض النووي.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    النتائج

    أحد المكونات الرئيسية لهذا البروتوكول هو تحسين تركيز نوكلاس ميكروكوككال (منسى) تستخدم لهضم في الكروماتين في الأجزاء القابلة للذوبان، كما هو موضح في الخطوة 10. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الدقة فيما يتعلق بتوزيع تعديلات هستون في مناطق الجينوم للفائدة. يجب...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    يسمح الإجراء الموضح هنا لاستعادة كفاءة من الحمض النووي المرتبطة بتعديل هيستونيس في خلايا الخميرة التي إيمونوبريسيبيتيشن. ويعقب هذا qPCR استخدام كبسولة تفجير وتضخيم المناطق ذات الاهتمام لتحديد تخصيب محلي أو نضوب تعديلات محددة هيستون. على الرغم من يجري تطويرها كأسلوب قبل 20 عاماً تقريبا، يظ?...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر الخضراء لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح المعاهد الوطنية للصحة R03AG052018 و R01GM124342 إلى E.M.G.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Yeast ExtractResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma-Aldrich74385Equivalent to NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Sodium Dodecyl SulfateAmrescoM107-1KG
    Sodium DeoxycholateSigma-Aldrich30970-100G
    Sodium AcetateSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Yeast protease inhibitor cocktailVWR10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl AlcoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nuclease-Free WaterVWR100720-992
    Micrococcal NucleaseWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
     Bradford Assay ReagentThermoScientific23238
     BSA Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Active Motif39142
     High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic BeadsThermoScientific88803
    magnetic stand for 1.5mL tubesFisher ScientificPI-21359
    Acid-Washed Glass BeadsSigma-AldrichG8772
     Microtube HomogenizerBenchmarkD1030
    2.0 mL screw-cap tubes with sealing ringsSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel loading tipsFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL conical tubesFisher Scientific14-432-22
    384-Well PCR PlateFisher ScientificAB-1384W
     Gyratory Floor ShakerNew Brunswick ScientificModel G10
    SpectrophotometerThermoScientificND-2000c
     Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855485

    References

    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved