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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione della cromatina degli istoni modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae. DNA immunoprecipitato viene successivamente utilizzato per PCR quantitativa per interrogare l'abbondanza e la localizzazione di modifiche post-traduzionali degli istoni in tutto il genoma.

Abstract

Modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM), quali acetilazione, metilazione e fosforilazione, sono regolate dinamicamente da una serie di enzimi che aggiungono o rimuovono questi segni in risposta ai segnali ricevuti dalla cellula. Questi PTMS sono contributori chiave per la regolazione di processi come controllo di espressione genica e di riparazione del DNA. Immunoprecipitazione della cromatina (chIP) è stato un approccio strumentale per l'abbondanza e la localizzazione di molti istone PTMs in tutto il genoma in risposta alle diverse perturbazioni alla cella di dissezione. Qui, un metodo versatile per l'esecuzione di chIP degli istoni traduzionalmente modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è descritto. Questo metodo si basa sulla reticolazione delle proteine e del DNA tramite trattamento di formaldeide delle colture di lievito, generazione di lisati di lievito da perlina battendo, solubilizzazione dei frammenti di cromatina di nucleasi di micrococcal e l'immunoprecipitazione di istone-DNA complessi. DNA associato con il contrassegno dell'istone di interesse è purificato e sottoposti ad analisi quantitativa di PCR per valutare il suo arricchimento a più luoghi in tutto il genoma. Rappresentante esperimenti sondando la localizzazione dei contrassegni dell'istone H3K4me2 e H4K16ac nel wildtype e lievito mutante sono discussi per dimostrare l'interpretazione e l'analisi dei dati. Questo metodo è adatto per una varietà di istone PTMs e può essere eseguito con diversi ceppi mutanti o in presenza di diversi stress ambientali, che lo rende un ottimo strumento per indagare i cambiamenti nella dinamica della cromatina in condizioni diverse.

Introduzione

La modificazione post-traduzionale dinamico (PTM) degli istoni è un meccanismo normativo fondamentale per molti processi basati su modelli del DNA, compreso trascrizione, replicazione e riparazione del DNA1,2. La capacità di determinare l'abbondanza e la localizzazione precisa degli istoni modificati concomitanti con questi processi è quindi fondamentale per comprendere la loro regolazione in condizioni diverse nella cella. Lo sviluppo di immunoprecipitazione della cromatina (chIP) come metodo derivavano in gran parte da studi biochimici delle interazioni delle proteine con DNA, particolarmente in vitro metodi utilizzando reticolanti chimici, accoppiato con la necessità di valutare la natura dinamica delle interazioni proteina-DNA in vivo e in regioni specifiche del genoma3,4,5. L'avanzamento della PCR quantitativa (qPCR) e tecnologie di sequenziamento ha inoltre ampliato la possibilità di eseguire esperimenti di chIP con confronti quantitativi e attraverso interi genomi, che lo rende un potente strumento per dissezione interazioni della DNA-proteina a livelli multipli.

Attualmente, il chIP è un metodo richiesto per qualsiasi gruppo di ricerca interessato a regolazione della cromatina-mediata del genoma come non esistono metodi comparabili per interrogare direttamente il collegamento fisico tra un istone modificato e un locus genomico specifico in vivo. Anche se le varianti di questo metodo utilizzando il sequenziamento di nuova generazione per mappare le modifiche dell'istone in tutto il genoma6,7 sono disponibili, questi approcci possono riguardare diversi quesiti scientifici e loro scala, costo e risorse tecniche possono essere limitante per alcuni gruppi di ricerca. Inoltre, è necessario completare questi mirati chIP-qPCR approcci fornendo metodi ad entrambi ottimizzano il protocollo chIP prima del sequenziamento e per convalidare i risultati dei set di dati epigenomic. Spettrometria di massa basato su approcci per identificare la serie completa di istone marchi associati a regioni genomiche hanno anche emerso8,9,10,11, tuttavia, questi gli approcci hanno alcune limitazioni per quanto riguarda cui regioni del genoma possono essere sondate e richiedono competenze tecniche e la strumentazione che non sarà disponibile per tutti i gruppi di ricerca. Di conseguenza, chIP rimane un metodo fondamentale per analizzare l'abbondanza e la distribuzione delle modifiche dell'istone in condizioni diverse per tutti i gruppi di ricerca interessati a epigenetics, cromatina e regolazione delle funzioni genomiche.

Qui, descriviamo un metodo per modello chIP usando il lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) per studiare la distribuzione delle istone PTMs a cromatina. Questo approccio si basa su una serie di componenti di base dei protocolli di chIP sviluppato in lievito e applicato anche al modello diversi sistemi12,13. Interazioni tra modificate gli istoni e il DNA nella cella sono conservate di reticolazione con formaldeide. Dopo la preparazione del lysate, frammenti di cromatina sono solubilizzati in frammenti di dimensioni medie uniformemente tramite digestione con nucleasi di micrococcal. Immunoprecipitazione degli istoni modificati è effettuato con gli anticorpi commerciali o laboratorio-generato e qualsiasi DNA associato è isolato e analizzato per arricchimento alle regioni genomiche particolare utilizzando qPCR (Figura 1). Per molte modificazioni istoniche, la quantità di DNA ottenuto da questo protocollo è sufficiente per il test più di 25 differenti loci genomici qPCR.

Questo metodo di chIP è altamente versatile per monitorare la distribuzione di una modifica dell'istone singolo attraverso diversi ceppi mutanti o condizioni ambientali, o per le prove multiple modificazioni istoniche in wildtype cellule in un certo numero di loci genomici. Inoltre, numerosi componenti del protocollo sono facilmente regolabili per ottimizzare il rilevamento di entrambi altamente - o umili-abbondante contrassegni dell'istone. Infine, esecuzione di chIP degli istoni modificati nel lievito gemmante offre l'opportunità di utilizzare controlli essenziali per la specificità dell'anticorpo in gran parte non disponibili in altri sistemi. Vale a dire, ceppi di lievito possono essere generati che portano mutazioni puntiformi nei residui di istone che sono mirati per la modifica, e, in alcuni casi, c'è solo un singolo enzima che catalizza la seguente modifica su un residuo di istone particolare (ad es. lisina dell'istone methyltransferases). Di conseguenza, chIP può essere eseguita in entrambi l'istone mutante o enzima eliminazione ceppi di saggiare la misura in cui legame non specifico dell'anticorpo può essere che si verificano e generare falsi positivi. Questo controllo è particolarmente prezioso per gli anticorpi di nuova concezione e può anche essere utilizzato per convalidare la specificità dell'anticorpo per le modifiche dell'istone conservati prima del loro utilizzo in altri sistemi. Questo approccio si integra con altri metodi per verificare la specificità dell'anticorpo che distinguono tra Stati di diverse modifiche (ad esempio mono-, di - e tri-metilazione), tra cui matrici di peptidi modificati di sondaggio e l'esecuzione di western blot degli istoni o nucleosomi con modifiche definite. Nel complesso, il chIP nel lievito gemmante è un potente metodo per valutare le dinamiche dell'istone PTMs in tutto il genoma e meccanismi che governano il loro regolamento di dissezione.

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Protocollo

1. pre-legano anticorpi biglie magnetiche

  1. Mescolare bene i branelli magnetici di proteina A/G e trasferire 20 µ l di biglie magnetiche per una immunoprecipitazione (IP) campione in una provetta da 1,5 mL.
    Nota: Quando si pipetta perline, utilizzare wide-bore, bassa ritenzione suggerimenti.
  2. Collocare la provetta con perline in un supporto magnetico e consentire perline raccogliere sul lato del tubo. Eliminare il surnatante.
  3. Lavare le perle 3 volte con 1 mL di soluzione fisiologica tamponata freddo (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl).
  4. Aggiungere 200 µ l di TBS a perline e appropriata quantità di anticorpo. Ruotare a 8 giri durante la notte a 4 ° C.
    Nota: Per molti anticorpi PTM istone, 1-3 µ g di anticorpo a IP è sufficiente. Tuttavia, esperimenti di titolazione sono raccomandati per determinare concentrazioni appropriate. Le concentrazioni consigliate per anticorpi anti-istone ben caratterizzati, commerciale PTM sono spesso accurate e possono essere trovate in rapporti pubblicati o documentazione del prodotto.
  5. Posizionare le perline in un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Lavare con 1 mL di TBS.
  6. Risospendere le sfere in 20 µ l di TBS per campione IP più un ulteriore 5 µ l (in caso di errore di pipettaggio) di TBS.
    Nota: Le perle possono essere memorizzate a breve termine a 4 ° C fino all'utilizzo.

2. crescere cellule di lievito

  1. Inoculare 10 mL di YPD (Estratto di lievito 10%, 20% peptone e 20% destrosio) con una singola Colonia del ceppo appropriato e crescere a 30 ° C durante la notte in un incubatore d'agitazione a 220 giri/min.
  2. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura lievito utilizzando uno spettrofotometro. Diluire la cultura a un OD600 = 0.2 in 100 mL di YPD in un fiasco di nuovo.
  3. Crescere le cellule a 30 ° C in un incubatore d'agitazione a 220 giri/min fino a quando non raggiungono la fase di Mid-registro (OD600 = 0.6-0.8).

3. in Vivo reticolazione delle proteine a DNA

  1. Quando culture raggiungono la fase di Mid-registro, aggiungere 2,7 mL di formaldeide al 37% direttamente al mezzo, per una concentrazione finale di 1% di formaldeide. Trasferire il pallone a un agitatore a 25 ° C (o a temperatura ambiente) e scuoterlo a 50 rpm per 15 min.
  2. Aggiungere 5 mL di 2,5 M glicina al medium e continuare ad agitare a 50 giri/min a temperatura ambiente per 5 min placare la formaldeide.
  3. Trasferire le cellule per centrifugare bottiglie e far girare le cellule a 5800 x g per 5 min a 4 ° C. Decantare il supernatante.
    1. Lavare le cellule da loro risospendere in 45 mL di TBS freddo e trasferire la sospensione in una provetta conica da 50 mL. Girare il tubo a 2800 x g per 3 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
    2. Lavare che le cellule in 10 mL di freddo chIP di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), conservato a 4 ° C).
    3. Girare le cellule a 2800 x g per 3 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
      Nota: Le cellule possono essere congelate con azoto liquido e conservate a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione.

4. rendere lisati di lievito

  1. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi ChIP freddo con fluoruro di 1 mM phenylmethylsulfonyl (PMSF) e 1:1,000 diluizione dell'inibitore di proteasi di lievito cocktail. Trasferire la sospensione in una provetta di 2,0 mL tappo a vite contenente 200 µ l di perline di vetro.
  2. Trasferire le cellule una perlina battendo apparato per agitazione ad alta velocità a 4 ° C e tallone battere 6 volte per 30 s ciascuno. Mantenere le cellule sul ghiaccio per almeno 1 minuto tra ogni branello battendo.
  3. Trasferire il lisato una provetta da 1,5 mL utilizzando punte di caricamento del gel. Centrifugare il lisato a 15.500 x g per 20 min a 4 ° C.
  4. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 µ l di tampone di digestione di MNase (10 mM Tris-HCl a pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, conservato a 4 ° C) pipettando delicatamente su e giù.
  5. Aggiungere 2,5 µ l di MNase per le reazioni. Mescolarle delicatamente capovolgendo 4 - 6 volte e immediatamente viene quindi incubato in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.
    Nota: Condizioni di Digest dovrebbero essere ottimizzate quando viene utilizzato un nuovo stock di MNase. Vedere il passaggio 10 per il protocollo.
  6. Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio per fermare la reazione e aggiungere 5 µ l di EDTA 0.5 M per una concentrazione finale di 10 mM EDTA. Mescolare delicatamente per inversione.
  7. Centrifugare la reazione a 15.500 x g per 15 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
    Nota: Solubile della cromatina (digerita) sarà nel surnatante. Il pellet contiene detriti cellulari nulla non digerito e insolubile.

5. Immunoprecipitate (IP) per volta istoni

  1. Determinare la concentrazione di proteina di ogni frazione di cromatina MNase-rilasciato utilizzando un'analisi di Bradford. Aggiungere 1 mL di reattivo di Bradford a ciascuno dei 8 cuvette monouso più ulteriore 1 provetta per ciascun campione di proteina per essere testato.
    1. Preparare una soluzione stock di 2 mg/mL albumina di siero bovino (BSA).
    2. Aggiungere il volume appropriato per ottenere le seguenti concentrazioni di BSA in 1 mL di reagente di Bradford: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 µ g/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL e 10 μg/mL. Aggiungere 2 μL della frazione della cromatina MNase-rilasciato la cuvette aggiuntive.
    3. Coprire la parte superiore di ogni provetta con un piccolo pezzo di parafilm e invertire la cuvette 4 - 6 volte per mescolare bene la soluzione. Incubare le provette a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Utilizzando uno spettrofotometro visibile luce, misurare l'assorbanza a 595 nm per la curva standard ed i campioni sperimentali.
      Nota: Utilizzare la cuvetta senza BSA (0 μg/mL) a vuoto lo spettrofotometro prima di prendere la prima misurazione.
    5. Tracciare una curva standard utilizzando i valori di assorbanza per le diverse concentrazioni di BSA su software foglio di calcolo o software associato con lo spettrofotometro. Sulla base della curva standard e il fattore di diluizione utilizzato (1: 500), utilizzare i valori di assorbanza per calcolare la concentrazione di proteina per ciascuno dei campioni di frazione della cromatina.
  2. Per ogni IP, aggiungere 50 µ g di proteina totale dalla frazione della cromatina MNase-rilasciato al Buffer di lisi di ChIP per raggiungere un volume finale di 1 mL.
    Nota: Se si imposta più di un indirizzo IP al lisato, fare un mix master del lisato e ChIP Buffer di lisi e aliquota 1 mL provette individuali per l'IP.
  3. Rimuovere 100 µ l dal mix IP da elaborare come l'esempio di input. Congelare il campione a-20 ° C fino al punto 7.1.
    Nota: Qualsiasi campione di cromatina rimanente può anche essere congelato a-20 ° C e se si desidera utilizzare per un IP successivo.
  4. Aggiungere 20 µ l di biglie magnetiche A/G di proteine pre-legato con anticorpo per ogni campione IP.
Ruotare il campione a 8 giri per 3 h (standard) o durante la notte (se si preferisce) a 4 ° C.

6. lavare IPs ed eluire complessi DNA-istone

  1. Disporre le provette in un supporto magnetico e lasciate perline raccogliere sul lato del tubo. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Lavare le perle successivamente con 1 mL di ciascuno dei buffer sottostante.
    1. Eseguire ogni lavaggio rotante a 8 rpm per 5 min a 4 ° C, posizionando perline in un supporto magnetico, rimuovere il surnatante e aggiunta di buffer successivo: 2x - tampone di lisi di ChIP, 2x - sale alta di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1% NP-40, conservato a 4 ° C), 1 x - LiCl/detergente Wash Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, conservato a 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 1 mM EDTA, conservato a 4 ° C) e 1 x - TE.
    2. Con ultimo lavaggio TE, trasferire perline ad un nuovo tubo con 0,5 mL di TE per trasferire la maggior parte delle perle, poi un altro 0,5 mL di TE per lavare il tubo e il trasferimento di perline restanti.
  2. Aggiungere 250 µ l di tampone di eluizione di ChIP appena fatte (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vortice brevemente la soluzione. Ruotare i campioni a 8 giri per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Collocare la provetta in un supporto magnetico e raccogliere le perle. Attentamente trasferire il surnatante in una provetta nuova ed evitare le perline.
    Nota: L'eluato contiene immunoprecipitati proteine e DNA associato.
  4. Aggiungere un altro 250 µ l di tampone di eluizione di ChIP a perline. Ruotare i campioni a 8 giri per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Trasferire con cautela il surnatante nella provetta contenente il primo eluizione. Se necessario, è possibile rimuovere un volume più piccolo (240 µ l) per tutti gli indirizzi IP per non disturbare le perline.

7. invertire le reticolazioni proteina-DNA

  1. Scongelare i campioni di input e aggiungere 400 µ l di tampone di eluizione di ChIP per ogni ingresso.
  2. Input sia campioni IP, aggiungere 20 µ l di 5 M NaCl, 5 µ l di glicogeno 20 mg/mL e 12,5 µ l di proteinasi K. Mix 20 mg/mL bene tramite inversione oppure sfogliando i tubi. Incubare i campioni in un bagno di acqua di 65 ° C per una notte.

8. purificare e concentrare il DNA

  1. Aggiungere 10 µ l di 10mg/mL RNasi A ingresso e ai campioni IP. Incubare i campioni in bagnomaria a 37 ° C per 30 min.
  2. Aggiungere 600 µ l di fenolo: chlorofrom:isoamyl alcol (25:24:1 PCI) nella soluzione acquosa e mescolare bene. Spin loro a 15.500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    1. Rimuovere lo strato acquoso ad un nuovo tubo. Aggiungere 600 µ l di PCI e mescolare bene. Girare il tubo a 15.500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire lo strato acquoso in una nuova provetta.
      Attenzione: Lavorare nella cappa e indossare adeguati dispositivi di protezione personali quando si lavora con PCI. Smaltire i rifiuti liquidi e solidi come indicato dalle linee guida istituzionali.
  3. Aggiungere 0,1 x volume di acetato di sodio 3M e 1 mL di etanolo al 100% freddo per precipitare il DNA. Capovolgere la provetta 4 - 6 volte per mescolare bene la soluzione. Incubare a-20 ° C durante la notte.
    1. Girare il tubo a 15.500 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta.
    2. Lavare il pellet in 1 mL di etanolo 70% freddo. Spin a 15.500 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta.
    3. Asciugare il pellet nella cappa per circa 20 minuti (finché non è completamente asciutto). Risospendere i campioni IP in 50 µ l di acqua priva di nucleasi e risospendere ingresso campioni in 100 µ l di acqua priva di nucleasi. Conservare i campioni di DNA a-20 ° C fino alla esecuzione di qPCR.

9. quantitative PCR (qPCR) per rilevare il arricchita di regioni genomiche

  1. Fare un mix di qPCR master per ogni set di primers. Uno reazione contiene 5 µ l di 2 x qPCR mix, 0,25 µ l di primer in avanti di 20 µM e 0,25 µ l di primer inverso di 20 µM.
    Nota: Primer corretta progettazione e collaudo per qPCR esperimenti sono descritti altrove14,15,16.
  2. Rendere il mix master DNA per ciascun campione di DNA. Uno reazione contiene 0,5 µ l di DNA e 4,0 µ l di acqua priva di nucleasi.
  3. Aggiungere 5,5 µ l di master mix primer appropriato e 4,5 µ l di mix master DNA appropriato a ciascun pozzetto su una piastra 384 pozzetti qPCR.
    Nota: Iniziare con l'aggiunta di 5,5 µ l della miscela primer in ciascun pozzetto. Girare la piastra a 200 x g per 1 min a temperatura ambiente prima di aggiungere 4,5 µ l della miscela del DNA.
  4. Aderire il sigillo alla piastra e rotazione a 200 x g per 1 min a temperatura ambiente.
  5. Eseguire qPCR utilizzando un sistema qPCR in tempo reale con le seguenti condizioni: 95 ° C per 3 min; 40 cicli di 95 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s; curva di fusione 65 ° C a 95 ° C con incrementi di 0,5 ° C, 5 s.
  6. Per ogni coppia di primer, calcolare l'input per cento del campione rispetto al campione di ingresso di 5% utilizzato nella qPCR IP. Utilizzare i mezzi per la tecnica PCR triplici copie per eseguire i calcoli.
    Nota: Se una variazione sostanziale è osservata in triplici copie la PCR, si consiglia di ripetere la qPCR con attenzione alla composizione del mix master, pipettaggio errori e la contaminazione incrociata tra pozzetti della piastra 384 pozzetti.
    1. Regolare i valori di Cq per l'ingresso al 100% sottraendo il numero di cicli che rappresentano il fattore di diluizione dai valori di Cq crudi.
      Nota: Il cinque per cento input rappresenta un fattore di diluizione di 20 volte, che equivale a 4,32 cicli (registro2 20 = 4,32).
    2. Calcolare la percentuale di input come 2 ^ (Cqingresso - CqIP) moltiplicato per 100.

10. determinare le condizioni di Digest MNase (consigliato prima al primo completo chIP esperimento)

  1. Seguire i passaggi 2.1 attraverso 4.4 del protocollo precedente. Scalare il protocollo per generare abbastanza lisato per campioni multipli di MNase digestione del pellet contenenti della cromatina. Al punto 4.4, risospendere il pellet in 1,25 mL di tampone di digestione di MNase. I campioni per 5 tubi in modo che ogni aliquota contiene 250 µ l del pellet cromatina risospesi in MNase digestione Buffer.
  2. Aggiungere 0, 1,5, 2,5 o 5 µ l di MNase in ogni provetta. Mescolarle delicatamente capovolgendo 4 - 6 volte e immediatamente Incubare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.
  3. Interrompere le reazioni immediatamente immissione tubi sul ghiaccio e aggiungendo 5 µ l di EDTA 0.5 M per una concentrazione finale di 10 mM.
Mescolare delicatamente la soluzione di inversione.
  • Centrifugare le provette a 15.500 x g per 15 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
  • Aggiungere SDS 1% di concentrazione finale (25 µ l di soluzione di riserva del 10%) e NaHCO3 a concentrazione finale 0,1 M (25 µ l di soluzione madre 1 M) per i campioni nelle provette da 1,5 mL.
  • Aggiungere 20 µ l di 5M NaCl, 5 µ l di glicogeno e 12,5 µ l di proteinasi K di 20mg/mL per i campioni nelle provette da 1,5 mL. Li Incubare a 65 ° C durante la notte.
  • Aggiungere 10 µ l di 10 mg/mL RNaseA. Incubare a 37 ° C per 30 min.
  • Aggiungere 300 µ l del PCI in soluzione acquosa e mescolare bene. Spin a 15.500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    1. Rimuovere lo strato acquoso ad un nuovo tubo. Aggiungere 300 µ l di PCI e mescolare bene. Spin a 15.500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferimento strato acquoso ad un nuovo tubo.
  • Aggiungere 0,1 x volume di 3M sodio acetato (solitamente ~ 30 µ l) e 1 mL di etanolo 100% freddo per precipitare il DNA. Capovolgere la provetta 4 - 6 volte per mescolare bene. Incubare la provetta a-80 ° C per 1 h o a-20 ° C durante la notte.
    1. Girare il tubo a 15.500 x g per 20 min a 4° C. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta.
    2. Lavare il pellet in 1 mL di etanolo 70% freddo. Spin a 15.500 x g per 10 min a 4 ° C.
    3. Lasciare che il pellet asciugare all'aria nella cappa circa 20 minuti (o fino a quando è completamente asciutto). Risospendere il pellet in 30 µ l di acqua priva di nucleasi.
  • Aggiungere il DNA della tintura di caricamento ed eseguire 20 µ l in un agarosio al 2% gel per visualizzare digerito il DNA.

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    Risultati

    Una componente chiave di questo protocollo è ottimizzare la concentrazione di nucleasi di micrococcal (MNase) usata per digerire la cromatina in frammenti solubili, come descritto nel passaggio 10. Questo è fondamentale per l'ottenimento di dati ad alta risoluzione per quanto riguarda la distribuzione delle modificazioni istoniche alle regioni genomiche di interesse. Una titolazione di MNase deve essere eseguita per determinare la concentrazione più adatta per raggiungere principalment...

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    Discussione

    La procedura qui descritta consente il recupero efficiente di DNA associato a istoni modificati in cellule di lievito mediante immunoprecipitazione. Questa è seguita da qPCR utilizzando primers che amplificare regioni di interesse determinare arricchimento locale o esaurimento delle modificazioni istoniche specifici. Nonostante essere sviluppato come un metodo quasi 20 anni fa, chIP rimane la definizione per indagare lo stato di modifica dell'istone alle differenti regioni genomiche e in condizioni diverse. Anche se il ...

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    Divulgazioni

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Riconoscimenti

    Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio verde per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R03AG052018 e R01GM124342 per E.M.G

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    Materiali

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Yeast ExtractResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma-Aldrich74385Equivalent to NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Sodium Dodecyl SulfateAmrescoM107-1KG
    Sodium DeoxycholateSigma-Aldrich30970-100G
    Sodium AcetateSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Yeast protease inhibitor cocktailVWR10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl AlcoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nuclease-Free WaterVWR100720-992
    Micrococcal NucleaseWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
     Bradford Assay ReagentThermoScientific23238
     BSA Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Active Motif39142
     High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic BeadsThermoScientific88803
    magnetic stand for 1.5mL tubesFisher ScientificPI-21359
    Acid-Washed Glass BeadsSigma-AldrichG8772
     Microtube HomogenizerBenchmarkD1030
    2.0 mL screw-cap tubes with sealing ringsSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel loading tipsFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL conical tubesFisher Scientific14-432-22
    384-Well PCR PlateFisher ScientificAB-1384W
     Gyratory Floor ShakerNew Brunswick ScientificModel G10
    SpectrophotometerThermoScientificND-2000c
     Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855485

    Riferimenti

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