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요약

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

초록

Acetylation, 메 틸 화, 인 산화, 같은 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTMs), 동적으로 추가 하거나 셀에서 수신 하는 신호에 대 한 응답에서 이러한 마크를 제거 하는 효소에 의해 통제 된다. 이러한 PTMS 유전자 식 제어 등 프로세스의 규정을 주요 참여자 이며 DNA 복구. Chromatin immunoprecipitation (칩) 풍요로 움과 응답 셀에 다양 한 섭으로 게놈에 걸쳐 많은 히스톤 PTMs의 지역화 해 부를 위한 경 음악 접근 되었습니다. 여기, 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 에서 post-translationally 수정된 히스톤의 칩을 수행 하기 위한 다양 한 방법을 설명 합니다. 이 방법은 단백질 및 효 모 문화의 포름알데히드 처리를 사용 하 여 DNA의 가교에 의존 구슬 치고, micrococcal nuclease에 의해 chromatin 파편의 가용 화 및 히스톤 DNA의 immunoprecipitation에 의해 효 모 lysates의 세대 단지입니다. DNA의 히스톤 마크와 관련 된 정화는 게놈에 걸쳐 여러 loci에서 그것의 농축을 평가 하기 위해 정량 PCR 분석에 복종 하 고. Wildtype에 돌연변이 효 모 히스톤 부호 H3K4me2와 H4K16ac의 지역화를 조사 하는 대표적인 실험 데이터 분석 및 해석 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 다양 한 히스톤 PTMs 적합 하며 다른 돌연변이 체 긴장 또는 그것에 게 다른 조건 하에서 chromatin 역학에서 변경 내용을 조사 하기 위한 훌륭한 도구를 만드는 다양 한 환경 스트레스의 존재를 수행할 수 있습니다.

서문

히스톤의 동적 포스트 번역 상 수정 (PTM) 녹음 방송, 복제, DNA 수리1,2를 포함 하 여 많은 DNA 템플릿 프로세스에 대 한 주요 규제 메커니즘입니다. 풍부 하 고 이러한 프로세스와 부수적인 수정된 히스톤의 정확한 지 방화를 결정 하는 능력은 따라서 셀에 서로 다른 조건 하에서 그들의 규칙을 이해 중요 합니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)의 개발을 주로 dna, 단백질의 상호 작용의 생 화 확 적인 연구에서 특히 생체 외에서 방법 화학 crosslinkers를 사용 하 여 비롯 된 방법으로 평가 하는 필요와 결합 된 동적 자연 단백질 DNA 상호 작용에서 vivo에서 그리고 게놈3,,45의 특정 지역에서. 정량 PCR (정량) 및 시퀀싱 기술의 발전 또한 양적 비교와 전체 게놈, DNA 단백질 상호 작용에서 해 부를 위한 강력한 도구를 만드는 걸쳐 칩 실험을 수행 하는 기능을 확장 했다 여러 수준입니다.

현재, 칩은 연구 그룹 게놈의 chromatin 중재 규정에 관심이 필요한 메서드 수정된 히스톤과는 특정 genomic 소재 시 에 사이의 물리적 링크를 직접 심문 없습니다 유사한 방법으로 vivo. 다음 세대 시퀀싱 게놈6,7 통해 히스톤 수정 지도를 사용 하 여이 방법의 변이 사용할 수 있지만 이러한 접근 다른 과학적인 질문 및 그들의 규모, 비용을 해결할 수 있습니다. 그리고 기술 리소스 일부 연구 그룹에 대 한 제한 될 수 있습니다. 또한, 대상된 칩-정량은이 보완 하기 위해 필요한 접근 방법을 모두를 제공 하 여 epigenomic 데이터 집합에서 결과 유효성을 검사 하 고 시퀀싱 전에 칩 프로토콜 최적화. 그러나 질량 분석 기반 접근,8,,910,11, 등장 게놈 지역 연관 표시는 또한 히스톤의 완전 한 보완을 식별이 접근 제한이 몇 가지는 게놈의 지구를 탐색할 수 및 그들이 필요한 전문 기술 및 계측을 모든 연구 그룹을 사용할 수 없습니다. 따라서, 칩 풍부 및 히스톤 수정 epigenetics, chromatin의 게놈 기능 규정에 관심이 모든 연구 단체에 대 한 다양 한 조건에서의 배포를 분석 하는 기초 방법에 남아 있다.

여기, 신진 누 룩을 사용 하 여 칩 모델 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 히스톤 PTMs chromatin에서의 분포를 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 다양 한 칩 프로토콜 누 룩 개발 하 고 다양 한 모델 시스템12,13에 적용의 핵심 구성 요소에 의존 합니다. 수정된 히스톤과 DNA는 셀에서 간의 상호 작용은 포름알데히드와 가교에 의해 유지 됩니다. Lysate 준비 다음 염색 질 조각은 micrococcal nuclease와 소화에 의해 균일 하 게 크기의 조각으로 solubilized는. Immunoprecipitation 수정된 히스톤의 상업적 또는 실험실에서 생성 된 항 체와 함께 수행 되 고 모든 관련된 DNA 분리 및 정량 (그림 1)를 사용 하 여 게놈 지역에서 농축에 대 한 분석. 많은 히스톤 수정에 대 한이 프로토콜에서 얻은 DNA의 양을 정량 하 여 25 개 이상의 다른 게놈 loci를 테스트 하기 위해 충분 하다.

이 칩 방법은 매우 다양 한 여러 개의 돌연변이 체 긴장 또는 환경 조건, 단일 히스톤 수정 배포 모니터링을 위한 또는 wildtype 세포 게놈 loci의 숫자에 여러 개의 히스톤 수정 테스트입니다. 또한, 프로토콜의 수많은 구성 요소 중 높은-또는 미 천 한-풍부한 히스톤 부호의 최적화를 쉽게 조정 가능 하다. 마지막으로, 싹 트는 효 모에 수정 된 히스톤의 칩을 수행 크게 다른 시스템에서 사용할 수 있는 항 체 특이성에 대 한 주요 컨트롤을 사용 하 여 기회를 제공 한다. 즉, 효 모 종자 수 수정에 대 한 타겟으로하는 히스톤 잔류물에서 점 돌연변이 생성 되 고, 어떤 경우에는 특정 히스톤 잔류물에 수정 catalyzes만 단일 효소 (예. 히스톤 lysine methyltransferases)입니다. 따라서, 칩 중 히스톤 돌연변이 또는 효소 삭제 긴장 시험의 범위는 비 특정 바인딩 항 체의 발생 그리고 거짓 긍정적인 결과 생성 하에서 수행할 수 있습니다. 이 컨트롤은 새로 개발 된 항 체에 특히 중요 하 고 심지어 다른 시스템에서 사용 하기 전에 보존된 히스톤 수정에 대 한 항 체 특이성을 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 보완 (예: 모노-디-, 트라이-메 틸), 다른 수정 상태 사이에서 구별 하는 항 체 특이성을 테스트 하려면 다른 방법 수정된 펩 티 드의 배열 조사 등 수행 하는 히스톤의 서쪽 오 점 또는 nucleosomes 정의 수정입니다. 전반적으로, 싹 트는 효 모에 칩 게놈 전체 PTMs 히스톤의 역학을 평가 하 고 그들의 규칙을 경 세 하는 메커니즘을 해 부에 대 한 강력한 방법입니다.

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프로토콜

1. 미리 바인딩합니다 자성 구슬에 항 체

  1. 단백질 A/G 자석 구슬을 잘 혼합 하 고 1.5 mL 튜브에의 한 immunoprecipitation (IP) 샘플 당 자석 구슬 20 µ L를 전송.
    참고: pipetting 구슬, 넓은 구멍, 낮은 고정 팁 사용.
  2. 마그네틱 스탠드에 구슬 가진 튜브를 놓고 구슬 튜브에 수집을 허용 합니다. 제거는 상쾌한.
  3. 워시 3 번 감기 Tris 버퍼 염 분 (TBS) (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)의 1 mL와 구슬.
  4. 구슬 및 항 체의 적절 한 금액에 TBS의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 8 rpm에 회전
    참고: 많은 히스톤 PTM 항 체에 대 한 IP 당 항 체의 1-3 µ g은 충분 합니다. 그러나, 적정 실험은 적절 한 농도 결정 하기 위해 권장 됩니다. 잘 특징이, 상업 히스톤 PTM 항 체에 대 한 권장된 농도 정확 하 고 게시 된 보고서 또는 제품 문학에서 찾을 수 있습니다.
  5. 마그네틱 스탠드에 비즈를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. Tbs.의 1 mL와 함께 그들을 씻어합니다
  6. 20 µ L IP 샘플 당 TBS의 플러스는 추가 5 µ L (pipetting 오류)의 경우 tbs.의 구슬 resuspend
    참고: 구슬 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 단기 사용까지.

2. 성장 효 모 세포

  1. 적절 한 긴장에의 한 식민지와 YPD (10% 효 모 추출 물, 펩 20% 및 20% 포도 당)의 10 mL를 접종 하 고 하룻밤 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서에서 30 ° C에서 그것을 성장.
  2. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 효 모 문화는 분 광 광도 계를 사용 하 여. OD600 문화를 희석 100 ml YPD 새로운 플라스 크에서 0.2 =.
  3. 중간 로그 단계를 도달할 때까지 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 세포를 성장 (OD600 = 0.6-0.8).

3. 생체 내에서 dna 단백질의 가교

  1. 문화 중순 로그 단계에 도달, 1% 포름알데히드의 최종 농도 대 한 매체에 직접 37% 포름알데히드의 2.7 mL를 추가 합니다. 25 ° C (또는 상 온)에서 통에 플라스 크를 전송 하 고 15 분 동안 50 rpm에서 그것을 흔들어.
  2. 매체에 2.5 M 글리신의 5 mL을 추가 하 고는 포름알데히드를 풀기 위해 5 분 동안 실 온에서 50 rpm에서 떨고 계속.
  3. 병을 원심 회전 4 ° c.에서 5 분에 대 한 5800 x g에서 셀을 셀 전송 상쾌한을 가만히 따르다.
    1. 차가운 TBS의 45 ml에서 그들을 resuspending에 의해 세포를 세척 하 고 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브로 전송. 4 ° c.에 3 분 동안 2800 x g에서 튜브를 회전 제거는 상쾌한.
    2. 세척 감기 10 mL에 세포 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C에서 저장 된) 칩.
    3. 2800 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 스핀 제거는 상쾌한.
      참고: 셀 액체 질소로 냉동 고 추가 처리까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

4. 효 모 Lysates 확인

  1. 1mm phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 찬 칩 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 효 모 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1:1,000 희석 셀 resuspend 유리 구슬의 200 µ L을 포함 하는 2.0 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송.
  2. 4 ° C에서 고속 교 반 장치를 치고 구슬 셀 전송 및 구슬 30 6 번 이길 각 s. 각 구슬 구타 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 셀을 계속.
  3. 젤 팁을 로드를 사용 하 여 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송. 원심 lysate 15500 x g 4 ° c.에 20 분에서
  4. 삭제는 상쾌한 고 펠 릿 MNase 소화 버퍼의 250 µ L에서 resuspend (10 mM Tris HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 m m MgCl2, 21 m m CaCl2, 1 %NP-40, 4 ° C에서 저장 된) 부드럽게 위아래로 pipetting으로.
  5. 반응에 MNase의 2.5 µ L를 추가 합니다. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 그것을 품 어.
    참고: MNase의 새로운 주식을 사용 하는 경우 다이제스트 조건 최적화 되어야 합니다. 프로토콜에 대 한 10 단계를 참조 하십시오.
  6. 즉시 반응을 중지 10 mM EDTA의 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하는 얼음에 튜브를 놓습니다. 반전에 의해 그들을 부드럽게 혼합.
  7. 원심 15500 x g 4 ° C에서 15 분에 반응 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.
    참고: 수용 성 (소화) chromatin는 상쾌한에 있을 것입니다. 펠 릿에는 아무것도 소화 하 고 불용 성 세포 파편을 포함 되어 있습니다.

5. Immunoprecipitate (IP) 히스톤 수정

  1. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 각 MNase 출시 chromatin 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 8 일회용 큐 벳 플러스 테스트할 각 단백질 샘플 1 추가 베트의 각 하 Bradford 시의 1 mL를 추가 합니다.
    1. 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 재고 솔루션을 준비 합니다.
    2. 브래드 퍼 드 시 약의 1 mL에 BSA의 다음 농도 달성 하기 위해 적절 한 볼륨 추가: 0 μ g/mL, 0.5 μ g/mL, 1 μ g/mL, 2 μ g/mL, 4 μ g/mL, 6 μ g/mL, 8 μ g/mL와 10 μ g/mL. 추가 큐 벳을 MNase 출시 chromatin 분수의 2 μ를 추가 합니다.
    3. Parafilm의 작은 조각으로 각 베트의 상단을 커버 하 고 반전 있는 큐 벳 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 15 분 동안 실 온에서 큐 벳을 품 어.
    4. 595에서 흡 광도 측정 표시 광 분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선과 실험 샘플에 대 한 nm.
      참고: 사용 하지 않고 BSA 베트 (0 μ g/mL) 빈 첫 번째 측정 이전 분 광 광도 계.
    5. BSA의 다른 농도 분 광 광도 계와 관련 된 소프트웨어 또는 스프레드시트 소프트웨어에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선 및 희석 요소 사용 (1: 500)에 따라 각각 chromatin 분수 샘플의 단백질 농도 계산 하 흡 광도 값을 사용 합니다.
  2. 각 IP에 대 한 1 mL의 최종 볼륨을 도달 칩 세포의 용 해 버퍼 사용 MNase 출시 chromatin 분수에서 총 단백질의 50 µ g을 추가 합니다.
    참고: lysate 당 하나 이상의 IP를 설정 하는 경우 만들은 lysate의 마스터 믹스와 칩, 세포의 용 해 버퍼 및 IP에 대 한 개별 튜브에 aliquot 1 mL.
  3. 입력된 샘플으로 처리할 수 있는 IP 믹스에서 100 µ L을 제거 합니다. 7.1 단계까지-20 ° C에서 입력된 샘플을 동결.
    참고: 모든 나머지 chromatin 샘플 수 있습니다-20 ° C에서 냉동 수 있으며 필요한 경우 후속 IP에 대 한 사용.
  4. 미리 바인딩된 각 IP 샘플에 항 체로 자기 단백질 A/G 구슬의 20 µ L를 추가 합니다.
3 h (표준)에 대 한 8 rpm에서 샘플을 회전 또는 (선호) 하는 경우 4 ° c.에 하룻밤

6. 워시 IPs 및 히스톤 DNA 복합 Elute

  1. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 튜브 측에 수집 하자. 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다. 씻어 아래 버퍼의 각각의 1 mL와 연속적으로 구슬.
    1. 4 ° C에서 5 분 동안 8 rpm에 회전 하 고, 마그네틱 스탠드에 비즈를 배치 하 고, 상쾌한, 제거 하 고 다음 버퍼를 추가 하 여 각 세척을 수행: 2 x-칩 세포의 용 해 버퍼, 2 x-높은 소금 워시 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 500 m m NaCl, 1 mM EDTA 1 %NP-40, 4 ° C에 저장), 1 x-LiCl/세제 워시 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 1 mM EDTA, 1 NP-40%, 1% 나트륨 deoxycholate, 4 ° C에 저장), 1 x-테 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C에서 저장 된), 및 1 x-테.
    2. 마지막 테 세척, 구슬 구슬의 대부분 다른 0.5 mL 튜브를 세척 하 고 나머지 구슬 전송 하 테의 전송 테의 0.5 mL를 사용 하 여 새로운 튜브를 전송할.
  2. 갓 만든된 칩 차입 버퍼 (1 %SDS, 1mm NaHCO3)의 250 µ L를 추가 합니다. 짧게 솔루션 소용돌이입니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.
  3. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 수집 합니다. 신중 하 게 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬 피하십시오.
    참고:는 eluate immunoprecipitated 단백질 및 관련된 DNA를 포함 한다.
  4. 구슬에 칩 차입 버퍼의 또 다른 250 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.
  5. 신중 하 게 포함 하는 첫 번째 차입 튜브는 상쾌한 전송. 필요한 경우, 구슬 방해를 피하기 위해 모든 IPs에 대 한 작은 볼륨 (240 µ L)를 제거 합니다.

7. 역 단백질-DNA Crosslinks

  1. 입력된 샘플을 해 동 하 고 각 입력에 칩 차입 버퍼의 400 µ L를 추가 합니다.
  2. 모두 입력 및 IP 샘플, 반전 또는 튜브를 flicking 여 잘 5 M NaCl, 20 mg/mL glycogen의 5 µ L 및 가수분해 K. 믹스 20 mg/mL의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 밤새 65 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.

8. 정화 하 고 DNA를 집중

  1. 입력 및 IP 샘플 10 mg/mL RNase A의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.
  2. 수성 솔루션을 페 놀: chlorofrom:isoamyl 알코올 (25:24:1 PCI)의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 그들을 회전 합니다.
    1. 새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송.
      주의: 증기 두건 및 PCI 작업할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 합니다. 기관 지침에 의해 지시 하는 대로 액체와 고체 폐기물을 처분.
  3. 0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 하룻밤-20 ° C에서 품 어.
    1. 4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.
    2. 차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.
    3. 약 20 분 (때까지 완전히 건조) 후드에서 펠 릿 건조 IP 샘플 nuclease 무료 물 50 µ L에서 resuspend 그리고 nuclease 무료 물 100 µ L 입력된 샘플을 resuspend. 정량 Pcr 수행까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.

9. 양이 많은 PCR (정량) 풍부한 게놈 지역 검색

  1. 뇌관의 각 집합에 대 한 정량 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 2 x qPCR 믹스의 5 µ L, 20 µ M 앞으로 뇌관의 0.25 µ L 및 20 µ M 역 뇌관의 0.25 µ L를 포함 한다.
    참고: 적절 한 뇌관 디자인 및 정량 실험을 위한 테스트 설명 다른14,,1516.
  2. 각 DNA 샘플에 대 한 DNA 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 DNA의 0.5 µ L 및 nuclease 무료 물 4.0 µ L를 포함 한다.
  3. 384 잘 정량 접시에 각 잘을 5.5 µ L의 적절 한 뇌관 마스터 믹스와 적절 한 DNA 마스터 믹스의 4.5 µ L를 추가 합니다.
    참고: 각 음에 뇌관 믹스의 5.5 µ L를 추가 시작 합니다. 4.5 µ L의 DNA 혼합을 추가 하기 전에 실내 온도에 1 분 동안 200 x g에서 접시를 회전 합니다.
  4. 접시와 상 온에서 1 분 동안 200 x g에서 스핀을 인감을 준수 합니다.
  5. 정량 Pcr 실시간 정량 시스템을 사용 하 여 다음 조건 수행: 95 ° C 3 분;에 대 한 10 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s; 녹는 곡선 65 ° C ~ 0.5 ° C 증가, 5와 95 ° C s.
  6. 각 뇌관 쌍 계산는 정량에 사용 하는 5% 입력된 샘플을 기준으로 IP 샘플의 백분율 입력 합니다. 기술 PCR triplicates의 의미를 사용 하 여 계산을 수행 하.
    참고: 경우 상당한 변이에서 관찰 PCR triplicates 마스터 믹스 구성, pipetting 오류 및 384-잘 접시에 우물 사이의 교차 오염에 주의와 정량 Pcr을 반복 하는 것이 좋습니다.
    1. 원시 Cq 값에서 희석 비율을 대표 하는 사이클의 수를 빼서 Cq 100%에 대 한 입력 값을 조정 합니다.
      참고: 5% 입력 20-fold,는 4.32 사이클 (로그2 20 = 4.32)와의 희석 비율을 나타냅니다.
    2. %2로 입력 계산 ^ (Cq입력 -CqIP) 100을 곱한.

10. (권장 하기 전에 첫 번째 전체 칩 실험) MNase 다이제스트 조건 결정

  1. 2.1 이전 프로토콜의 4.4 통해 단계. 충분히 lysate chromatin 포함 된 펠 릿의 MNase 소화의 여러 샘플을 생성 하는 프로토콜을 확장. 4.4 단계에서 MNase 소화 버퍼의 1.25 mL에 산 탄을 resuspend. 5 샘플 튜브는 각 약 수 MNase 소화 버퍼에 resuspended chromatin 펠 릿의 250 µ L를 포함 합니다.
  2. 0, 1.5, 2.5, 5 추가 각 튜브를 MNase의 µ L. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
  3. 즉시 얼음에 튜브를 배치 하 고 10mm 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
반전 하 여 솔루션을 부드럽게 혼합.
  • 4 ° C에서 15 분 동안 15500 x g에서 튜브 원심 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.
  • 1% 최종 농도 (10% 주식 솔루션의 25 µ L)와 NaHCO3 1.5 mL 튜브에 샘플을 0.1 m M 최종 농도 (1 M 재고 솔루션의 25 µ L)에 SDS을 추가 합니다.
  • 1.5 mL 튜브에 샘플 5 M NaCl, 5 µ L의 glycogen, 그리고 20 mg/mL 가수분해 K의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 품 어 그들 65 ° C에서 하룻밤.
  • 10 mg/mL RNaseA의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  • 수성 해결책에 PCI의 300 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다.
    1. 새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송.
  • 0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (보통 ~ 30 µ L)의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회를 잘 섞어. 밤새-80 ° C 1 시간 또는-20 ° C에서 튜브를 품 어.
    1. 4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.
    2. 차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전
    3. 펠 릿 후드 약 20 분에서 (또는 때까지 완전히 건조) 건조 보자. Nuclease 무료 물 30 µ L에 산 탄을 resuspend.
  • 염료를 로드 하는 DNA를 추가 하 고 2 %agarose 20 µ L을 실행 시각화 하 젤 소화 DNA.

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    결과

    이 프로토콜의 한 핵심 구성 요소는 단계 10에서 설명한 녹는 조각으로는 염색 질을 소화 하는 데 사용 된 micrococcal nuclease (MNase)의 농도 최적화입니다. 이것은 관심의 게놈 영역에서 히스톤 수정 배포에 대 한 고해상도 데이터를 얻기 위해 중요입니다. MNase 적정 수용 성 염색 질 분수에 디 nucleosomes의 작은 금액으로 주로 모노 nucleosomes를 달성 하기 위해 가장 적합 한 농도 결...

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    토론

    여기에 설명 된 절차는 immunoprecipitation에 의해 효 모 세포에 수정 된 히스톤과 관련 된 DNA의 효율적인 복구에 대 한 수 있습니다. 이것은 정량 Pcr 증폭 지역 농축 결정 관심 영역 또는 특정 히스톤 수정의 소모는 뇌관을 사용 하 여 옵니다. 개발 되 고 있는 방법으로 거의 20 년 전에 불구 하 칩 히스톤 수정 상태 다른 게놈 영역에 다양 한 조건 하에서 조사 정의 분석 결과 남아 있습니다. 칩 결합 차세...

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    공개

    저자는 공개 없다.

    감사의 말

    저자는 유용한 토론에 대 한 녹색 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 NIH 교부 금 R03AG052018와 E.M.G.에 R01GM124342에 의해 부분적으로 지원

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    자료

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Yeast ExtractResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma-Aldrich74385Equivalent to NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Sodium Dodecyl SulfateAmrescoM107-1KG
    Sodium DeoxycholateSigma-Aldrich30970-100G
    Sodium AcetateSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Yeast protease inhibitor cocktailVWR10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl AlcoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nuclease-Free WaterVWR100720-992
    Micrococcal NucleaseWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
     Bradford Assay ReagentThermoScientific23238
     BSA Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Active Motif39142
     High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic BeadsThermoScientific88803
    magnetic stand for 1.5mL tubesFisher ScientificPI-21359
    Acid-Washed Glass BeadsSigma-AldrichG8772
     Microtube HomogenizerBenchmarkD1030
    2.0 mL screw-cap tubes with sealing ringsSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel loading tipsFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL conical tubesFisher Scientific14-432-22
    384-Well PCR PlateFisher ScientificAB-1384W
     Gyratory Floor ShakerNew Brunswick ScientificModel G10
    SpectrophotometerThermoScientificND-2000c
     Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855485

    참고문헌

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