Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

فهم التعديلات تشكيل وممكن المينا يتطلب دراسة النشاط أميلوبلاست. وهنا يصف لنا طريقة موثوقة ومتسقة للصغير-تشريح المينا الأجهزة التي تحتوي على أميلوبلاستس إفراز ومرحلة النضج التي يمكن استخدامها لمزيد من الإجراءات التجريبية الكمية والنوعية.

Abstract

المينا العيوب الناتجة عن الظروف البيئية وسبل الحياة من شواغل الصحة العامة بسبب انتشارها عالية. هذه العيوب نتيجة لتغير نشاط الخلايا المسؤولة عن توليف المينا المسمى أميلوبلاستس، الذي يقدم في هيئة المينا. أثناء أميلوجينيسيس، اتبع أميلوبلاستس تسلسل محددة ودقيقة للأحداث من الانتشار، والتمايز، والموت. فأر باستمرار تزايد القواطع نموذج تجريبي مناسب لدراسة مراحل النشاط والتمايز أميلوبلاست في الظروف الفسيولوجية والمرضية. وهنا يصف لنا طريقة موثوقة ومتسقة للصغير-تشريح الجهاز المينا في الفئران المعرضة إلى سميات البيئية. Epithelia الأسنان تشريح الصغيرة تحتوي على أميلوبلاستس إفراز ومرحلة النضج التي يمكن استخدامها للتجارب النوعية، مثل فحوصات إيمونوهيستوتشيميستري والتهجين في الموقع ، فضلا عن التحليلات الكمية مثل RT-قبكر، وتسلسل الحمض النووي الريبي، والنشاف الغربية.

Introduction

عيوب المينا إنمائية كثيرة قد تنجم عن التعرض للسموم البيئية و/أو نمط الحياة غير مناسبة1،2،،من34. توصيف لإفساد الأحداث وجزيئات من أميلوجينيسيس استخدام الإجراء الموصوفة حاليا سيتم الترويج لاستخدام الناتج المينا العيوب كعلامات مبكرة للتعرض سميات عدة، وقد يساعد على إعادة تشكيل تاريخ الصحة من كل مريض خلال فترة ما حول الولادة عند المينا سينثيتيزيد1،2. ويمكن تقسيم توليف المينا أربع مراحل رئيسية اعتماداً على أميلوبلاست النشاط5. الخطوة الأولى تجمع السلائف الخلية وأميلوبلاست ما قبل الانتشار. أثناء الخطوة الثانية، تفرز ameloblasts المتباينة المينا مصفوفة البروتينات (EMPs)، أساسا أميلوجينين واناميلين وأميلوبلاستين، التي تحدد سماكة المينا النهائي. وهكذا، وأي تعطيل لتوليف EMP يؤدي إلى عيوب الكمية من المينا. بعد ترسب سماكة المينا كاملة، تبدأ مرحلة النضج. وخلال هذه المرحلة، يسمح الاباتيت كريستاليتي النمو في العرض وسمك المينا للوصول إلى أعلى نسبة التمعدن، وجدت في أنسجة بيولوجية، مع يصل إلى 96% بالوزن. المينا تحريف الأحداث التي تحدث أثناء مرحلة النضج يؤدي إلى نوعية العيوب. وأخيراً، أميلوبلاستس الدخول في مرحلة نضج بعد، كما دعا تصبغ في القوارض، والخضوع للمبرمج أثناء اندلاع الأسنان مما يجعل عيوب المينا (أن وجدت) لا يمكن إصلاحه ولا رجعة فيها، وبالتالي توفير العيوب المحتملة تسجيل أثر رجعي من وتشدد على أميلوبلاست. في القوارض، يتبع amelogenesis تسلسل الأحداث مع خصوصية التي تنمو بشكل مستمر على القواطع، مما يجعلها نموذجا مناسباً لدراسة العملية العامة ل amelogenesis مماثلة. وهكذا، ينتج أي اضطراب amelogenesis التعديلات المينا النوعية و/أو الكمية، اعتماداً على الإطار الزمني لهذا الحدث تحريف. وبهذا المعني، أظهرت التعرض إلى الديوكسين والرصاص، والصماء المواد الكيميائية (EDCs) مثل جينيستين، bisphenol A (BPA) والفينكلوزولين، توليد المينا هيبومينيراليزيشنز1،2،3 6، ،،من78. وحددت بقع معتمة بيضاء غير متماثلة في القواطع الفئران المعرضة إلى جرعة BPA جرعة منخفضة خلال الفترة الجنينية والشهر الأول بعد الولادة1. هذه العيوب المينا في الفئران، وتلك التي هيبومينيراليزيشن البشرية القاطعة المولى (تفيد)، لها نفس الخصائص السريرية والهيكلية، والكيمياء الحيوية. تفيد علم أمراض مؤخرا وصف مينا أسنان، للذي المسببات لا يزال غير واضح9،10 على الرغم من العديد من العوامل السببية وقد تم الافتراض9،10،11 ،12.

المينا هام آخر هيبومينيراليزيشن أمراض بسبب العوامل البيئية هو طب الأسنان بالفلور (مدافع)، الذي هو نتيجة لامتصاص فلوريد المفرط (> 0.1 مغ/كغ/يوم)13،14. المصدر الرئيسي للفلوريد من مياه الشرب التي يتم استكمالها أو اليورانيوم الطبيعي مع فلوريد. فلوريد هو المنصوص عليها أيضا في كثير من الأحيان لمنع تسوس الأسنان، ولكن جرعة وقائية فقط 50% أقل من واحد السامة (≤0.05 مغ/كغ/يوم). تفيد ومدافع، اثنين من الأمراض المتكررة الناجمة عن التعرض للعوامل البيئية، قد يقدم السمات المشتركة التي تحتاج إلى أن توصف نظراً للتقوية آثار هيبومينيراليزينج من فلوريد جنبا إلى جنب مع سائر سميات مثل يشكل2 أو أموكسيسيلين15.

الصغرى-تشريح فأر المينا الجهاز الذي يحتوي على أميلوبلاستس في التمييز بين مختلف مراحل سوف يساعد على فهم إليه العمل من جزيئات قادرة على تعطيل نشاط أميلوبلاست ويسبب تشوهات المينا تشخيص بعد اندلاع الأسنان. وبعبارة أخرى، وصف التغييرات من المينا الجينات التعبير المينا مصفوفة التكوين وسبب سميات البيئية يسمح إعادة تشكيل تاريخ التعرض للسموم، ويسهل رصد السلامة البيئية للجمهور الصحة.

Protocol

وأبقى على جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من الوزارة الفرنسية للزراعة (ألف-75-06-12).

1-الحيوان التعرض إلى سميات

  1. قبل تنفيذ هذا البروتوكول، الحصول على موافقة المؤسسية اللازمة والتأكد من الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان.
  2. تطبيق تصميم بروتوكول البحث يسمح الدستور لمختلف المجموعات التجريبية من أجل اختبار تأثير molecule(s) للتحقيق في مرحلة إفراز أميلوبلاست ومرحلة النضج أميلوبلاست. هنا، تم تشكيل أربع مجموعات من ذكور الفئران ويستار تبعاً لتعرضها للفلوريد (NaF) في تركيبة أو لا مع منهاج عمل بيجين (الشكل 1A)2. لاحظ جميع الحيوانات وتشريح اليوم 65 (الشكل 1B).

2-تشريح هيمي-Mandibles من الفئران الكبار

  1. Euthanize الفئران CO2 خنقاً، اختيارياً تليها قطع الرأس في الرأس منفصلة عن بقية الجسم ب. تعريض الفئران إلى CO2 لمدة 5 دقائق في مربع مخصص16.
  2. إزالة كل الجلد من الشفاه السفلي باستخدام مشرط #11 من أجل الحصول على الوصول بسهولة إلى القواطع السفلي.
  3. مع مشرط نفسه، جعل شق بين القواطع السفلي اثنين مع ضغط طفيف والفك السفلي سوف تقسم إلى نصفين.
  4. قص الزمنية المشتركة الفك السفلي مع مشرط لفصل الفك، وعقد هيمي-الفك السفلي مع ملاقط غرامة.
  5. قطع الأنسجة الرخوة المحيطة مشرط وإزالة جميع العضلات والاوتار والأربطة باستخدام مكشطة حتى العظم نظيفة تماما.

3-عزل17،القاطعة18

  1. يحلق بعناية قبالة العظام بوضع الشفرة موازية للمحور الطولاني الرئيسية القاطعة. ابدأ في ريدج عظمى قرب نصائح القاطعة (نهاية الدانية) حتى نهاية القاطعة القرب من حلقة عنق الرحم. وعائدات الحركة شق الدانية باتجاه الأعلى.
  2. جعل قطع أولى ديستالي إلى حلقة عنق الرحم مع مشرط إزالة جونايون من هيمي-الفك السفلي والسماح باقلاع القاطعة سهولة دون إلحاق الضرر بحلقة عنق الرحم أو في المرحلة الافرازية من أميلوبلاستس (الخط الأحمر في الشكل 2).
  3. جعل قطع ثاني أدناه الثاني المولى، وإدراج مشرط بين العظم والسطح الآنسي القاطعة. عندما يتم رفع جميع العظام القاعدية، استدارة إلى الخارج القاطعة وخلعه بعناية لتجنب المينا الأنسجة الجهاز تعوق استخدام الملقط غرامة.

4-مايكرو-تشريح الجهاز المينا تحت عدسة مجهر

  1. قطره 200 ميليلتر العازلة الفوسفات المالحة (PBS 1 X) على القاطعة استخدام ماصة. تأخذ القاطعة مع غرامة ملاقط مع السطح الشفوية التي تواجه. جعل مشرط مارك بين عديم اللون وأجزاء البرتقال من الأنسجة. ويناظر هذا علامة بقعة بيضاء الكامنة التي يمكن ملاحظته بعد ذلك (الشكل 2).
  2. كشط، مع حفارة أو أداة مماثلة، سطح الخلية من علامة مشرط لنهاية قمي المقابلة لإفراز أميلوبلاستس المرحلة (عديم اللون)، ومن علامة مشرط للحافة القاطعة أميلوبلاستس (برتقالي) مرحلة النضج.
  3. إزالة الأنسجة 2 مم المقابلة لمرحلة الانتقال، وفي وقت سابق وصف19. لا تقم بفتح القاطعة في أثناء تشريح الجهاز المينا لتفادي التلوث قبل ميسينتشيمي.
  4. قطع حلقة عنق الرحم يقع فورا في الجزء قمي من القاطعة (الشكل 2) كما هو موضح سابقا20.
  5. أنه جمع في 10% محلول الفورمالين أو تحلل لإجراء مزيد من التحقيقات (انظر الجدول للمواد).

5-جمع الأنسجة الجهاز المينا المنفصلين عن ذويهم لإجراء مزيد من التحقيقات

  1. قطره 200 ميليلتر PBS 1 X المخزن المؤقت على القاطعة.
  2. مع شفرة المبضع #11، بعناية فصل الخلايا الظهارية الأسنان تدريجيا في المخزن المؤقت، كل على حدة لكل مرحلة من المراحل بمساعدة علامة مشرط المقدمة سابقا.
  3. لخلية الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات المستخرجة، وضع الأنسجة في حل تحلل يسمح استخراج البروتينات والكشف (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: إعداد الكشف عالية الجودة بتحول الأنسجة-الحفارة في الأنبوب ومن ثم طحن الخلايا حتى الحصول على خليط متجانس. الخليط جاهز للجيش الملكي النيبالي والبروتين الاستخراج وفقا للإجراء الخاص بالشركة المصنعة، الذي تم وصفه سابقا2،،من817. عادة، نحو 5-10 ميكروغرام المجموع تم الحصول على الكشف و 150 ميكروغرام مجموع البروتينات لكل إعداد.
  4. للتحليل النسيجي، إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، و في الموقع التهجين (العش)، وضع طبقة الخلية في الفورمالين 10% لح 2، ثم مخزن في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني 1 X. الأنسجة يمكن ثم تضمينها في الشمع/البارافين أو الأنسجة OCT للمقاطع المجمدة.
  5. للاستخراج الشراكة الأورو-متوسطية، تأخذ القاطعة مع ملاقط غرامة. بعد تعرض لفترة قصيرة للهواء (جفاف طفيف)، ستكون بقعة بيضاء مرئية حول الجزء الأوسط من سطح القاطعة، التي تمثل بدء تمعدن المينا الشفوية. يقابل هذا بقعة بيضاء للانتقال/أوائل مرحلة النضج من أميلوبلاستس، حتى استخدامه كمؤشر لاستخراج EMPs21.

النتائج

المينا العديد من العيوب، مثل طب الأسنان بالفلور12،13، قد تنجم عن الظروف البيئية بسبب امتصاص فلوريد المفرط أو المينا مشابهة لتفيد بسبب التعرض لبعض يشكل1، هيبومينيراليزيشن 7،22. قد تكون هذه ا?...

Discussion

أميلوبلاست تغيير النشاط و/أو انتشار أميلوبلاست تعطلت، والتمايز، ونضج العمليات تؤدي إلى عيوب المينا لا رجعة فيه، وفي المقابل، وصف العيوب المينا قد تساعد في تطوير فهم لتغيير النشاط أميلوبلاست أثناء أميلوجينيسيس. وهكذا، الدراسات المتعلقة بالجهاز المينا معزولة عاملاً محدداً توضيح الأحداث ...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من جامعة باريس-ديدرو والمعهد الوطني الفرنسي للصحة والبحوث الطبية (INSERM)، والمعهد الفرنسي لبحوث طب (المحزونات).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bisphenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formalin 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FranceTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, France74126RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibodySanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816rabbit polyclonal antibody
PBS 10xEUOMEDEXET330.A
Sodium fluoride (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast regularLeica microsystems, Nanterre cedex, France39601006called was/parafin in the text
tissue OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, France411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cmPHYMEP , Paris, France14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cmPHYMEP, Paris, France10035-12
Curved Scalpel BladePHYMEP , Paris, France10035-20
Dissecting Knife - Fine/Straight TipPHYMEP , Paris, France10055-12
Circle KnifePHYMEP, Paris, France10059-15
scalpel blades n°11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, France233-0024
binocular lensLeica biosystems, Nanterre cedex, FranceMZFLIII

References

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S., Gibert, Y. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. , 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species?. Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343 (2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1 (2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503 (2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425 (2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. . Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64) Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 Amelogenesis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved