Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Noções básicas sobre esmalte formação e possíveis alterações requer o estudo da atividade do Ameloblasto. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o esmalte órgãos contendo ameloblastos fase de maturação e de secreção que podem ser utilizados para procedimentos experimentais mais quantitativos e qualitativos.

Resumo

Esmalte defeitos resultantes de condições ambientais e as formas de vida são preocupações de saúde pública por causa de sua alta prevalência. Estes defeitos resultam de actividade alterada das células responsáveis pela síntese de esmalte chamado ameloblastos, que apresentam no órgão do esmalte. Durante a Amelogênese, ameloblastos seguem uma sequência específica e precisa dos acontecimentos de proliferação, diferenciação e morte. Um rato continuamente crescendo incisivos é um modelo experimental adequado para estudar Ameloblasto fases de atividade e diferenciação em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o órgão do esmalte de ratos expostos a tóxicos ambientais. O epitélio dental microdissecado conter secreção e maturação-estágio ameloblastos que podem ser utilizados para experiências qualitativas, tais como ensaios de imuno-histoquímica e hibridação in situ , bem como para análises quantitativas como RT-qPCR, RNA-seq e mancha ocidental.

Introdução

Muitos defeitos de esmalte do desenvolvimento podem resultar da exposição a tóxicos ambientais e/ou estilo de vida inadequado1,2,3,4. Caracterização de perturbar eventos e moléculas de Amelogênese usando o procedimento descrito neste momento irá promover o uso de defeitos de esmalte resultante como primeiros marcadores de exposição à várias substâncias tóxicas e pode ajudar a reconstituir a história da saúde de cada paciente durante o período perinatal, quando o esmalte é synthetized1,2. Síntese de esmalte pode ser dividido em quatro fases principal, dependendo do Ameloblasto atividade5. O primeiro passo reagrupa proliferação de célula e pre-Ameloblasto precursor. Durante a segunda etapa, ameloblastos diferenciados secretam proteínas da matriz esmalte (EMPs), principalmente amelogenina, enamelin e ameloblastin, que determinam a espessura do esmalte final. Assim, qualquer interrupção da síntese de EMP leva a defeitos quantitativos do esmalte. Após a deposição da espessura de esmalte cheia, começa a fase de maturação. Durante este estágio, crescimento de apatita do cristalite em largura e espessura permite que o esmalte alcançar a mais elevada relação de mineralização encontrada em um tecido biológico, com até 96% em peso. Defeitos de esmalte desreguladoras eventos que ocorrem durante a liderança da fase maturação qualitativa. Finalmente, ameloblastos entram numa fase de post-maturação, também chamada de pigmentação em roedores e sofrem apoptose durante a erupção do dente fazendo defeitos de esmalte (se houver) irreparáveis e irreversíveis, assim, defeitos fornecem potencial gravação retrospectiva de Ameloblasto salienta. Em roedores, Amelogênese segue uma sequência semelhante de eventos com a particularidade que os incisivos estão crescendo continuamente, o que os torna um modelo adequado para estudar o processo geral de Amelogênese. Assim, qualquer interrupção da Amelogênese resulta em alterações da qualidade do esmalte e/ou quantidade, dependendo da janela de tempo do evento perturbador. Nesse sentido, a exposição a dioxinas, chumbo e sistema endócrino (CDE) como bisfenol A (BPA), genisteína e vinclozolina, têm sido mostrados para gerar esmalte hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Assimétricos brancos opacos pontos foram identificados sobre os incisivos de ratos expostos a uma dose BPA de baixa dose durante o período fetal e o primeiro mês após o nascimento1. Estes defeitos de esmalte em ratos e aqueles de hipomineralização humana molar incisivo (MIH), possuem características semelhantes de clínicas, estruturais e bioquímicas. MIH é uma patologia de esmalte dental recentemente descrito, para que a etiologia ainda permanece incerto9,10 , apesar de muitos fatores causais tendo sido a hipótese de9,10,11 ,12.

Outra patologia de hipomineralização esmalte importantes devido a fatores ambientais é a fluorose dental (DF), que é a consequência da absorção excessiva de flúor (> 0,1 mg/kg/dia)13,14. A principal fonte de flúor é a água potável que é completada ou naturalmente enriquecida com flúor. Flúor é também muitas vezes prescrito para prevenir a cárie dentária, mas a dose profilática é 50% menor do que a um tóxico (≤0.05 mg/kg/dia). MIH e DF, duas patologias frequentes resultantes da exposição a fatores ambientais, podem apresentar características comuns que precisam ser caracterizados devido a potencialização dos efeitos hypomineralizing de flúor combinado com outras substâncias tóxicas como CDE2 ou amoxicilina15.

Microdissecação do órgão do esmalte rato contendo ameloblastos em fases diferentes de diferenciação vai ajudar a entender o mecanismo de ação das moléculas capazes de interromper a atividade Ameloblasto e causar defeitos de esmalte ser diagnosticada após a erupção do dente. Em outras palavras, a caracterização das alterações do esmalte gene expressão e esmalte matriz composição devido a tóxicos ambientais permite a reconstituição da história de exposição a substâncias tóxicas e facilita o monitoramento de segurança ambiental para o público saúde.

Protocolo

Todos os animais utilizados neste estudo foram mantidos de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da agricultura (A-75-06-12).

1. animal exposição a substâncias tóxicas

  1. Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessária e certifique-se de cumprir todas as orientações de cuidados com animais.
  2. Aplica o design do protocolo de pesquisa que permite a constituição de diferentes grupos experimentais para testar o impacto do molecule(s) investigado na fase de secreção de Ameloblasto e o estágio de maturação do Ameloblasto. Aqui, quatro grupos de ratos Wistar machos foram constituídos dependendo de sua exposição ao fluoreto (NaF) em combinação ou não com a ABP (figura 1A)2. Todos os animais foram observados e dissecados em dia 65 (figura 1B).

2. dissecação de Hemi-mandíbulas de ratos adultos

  1. Eutanásia em ratos por asfixia de CO2 , opcionalmente seguida por decapitação na cabeça separada do resto do corpo. Expor os ratos de CO2 por 5 min em uma caixa dedicada16.
  2. Remova toda a pele dos lábios inferiores usando um bisturi #11 a fim de obter acesso fácil aos incisivos inferiores.
  3. Com o bisturi mesmo, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores com uma ligeira pressão e mandíbula será dividida em duas metades.
  4. Cortar a articulação mandibular temporal com um bisturi para desanexar o maxilar e segurar a hemi-mandíbula com uma pinça fina.
  5. Corte os tecidos moles circundantes com um bisturi e retire todos os músculos, tendões e ligamentos, com uma espátula até que o osso está completamente limpo.

3. isolamento do incisivo17,18

  1. Cuidadosamente raspe o osso, colocando a lâmina paralela ao eixo longitudinal principal do incisivo. Começa a crista óssea perto as dicas do incisivo (extremidade proximal) até o final do incisivo perto do loop do colo do útero. O movimento de incisão procede de proximal para distal direção.
  2. Fazer um primeiro corte distalmente ao lacete cervical com o bisturi para remover o Gônio da hemi-mandíbula e permitir tirar o incisivo facilmente sem danificar a ansa cervical ou fase secretora de ameloblastos (linha vermelha na Figura 2).
  3. Faça um segundo corte abaixo o segundo molar e inserir o bisturi entre o osso e a superfície medial do incisivo. Quando todo o osso basal é levantado, girar para fora o incisivo e tirar com cuidado para evitar esmalte tecido órgão prejudicar usando uma pinça fina.

4. microdissecação do órgão do esmalte sob lente Binocular

  1. Largue a 200 µ l de tampão fosfato salino (PBS 1x) sobre o incisivo usando uma pipeta. Leve o incisivo com uma pinça fina com a superfície labial voltada para cima. Deixar um bisturi marca entre o incolor e as laranja partes do tecido. Esta marca corresponde a mancha branca subjacente que está sendo observado mais tarde (Figura 2).
  2. Raspe, com uma escavadeira ou ferramenta equivalente, superfície celular das marcas de bisturi para o correspondente da extremidade apical de ameloblastos (incolor) fase de secreção e para a marca de bisturi para a ponta do incisivo para os ameloblastos de palco (laranja) de maturação.
  3. Remova o tecido de 2mm, correspondente à fase de transição, como anteriormente descrito,19. Não abra o incisivo durante a dissecção de órgão do esmalte para evitar contaminação pela mesênquima.
  4. Cortar o laço cervical situado imediatamente na parte apical do incisivo (Figura 2) conforme descrito anteriormente20.
  5. Cobrá-lo em solução de formalina ou lise de 10% para mais investigações (ver Tabela de materiais).

5. coleção de tecidos de órgãos separados esmalte para investigações

  1. Queda de 200 µ l PBS 1 X tampão sobre o incisivo.
  2. Com uma lâmina de bisturi #11, cuidadosamente separe as células epiteliais dentais gradualmente no buffer, separadamente para cada estágio com a ajuda da marca bisturi feita anteriormente.
  3. Para a célula do RNA e extrações de proteína, coloque o tecido em uma solução de Lise que permite a extração de proteínas e RNAs (ver Tabela de materiais).
    Nota: Prepare RNAs de alta qualidade, transformando o tecido-escavadeira no tubo e em seguida moer as células até obter uma mistura homogénea. A mistura está pronta para extração de RNA e proteína de acordo com o procedimento do fabricante, o que foi descrito anteriormente,2,8,17. Geralmente, aproximadamente 5-10 µ g total RNAs e 150 µ g proteínas totais foram obtidas para cada preparação.
  4. Para análise histológica, imuno-histoquímica (IHC) e a hibridação in situ (ISH), colocam a camada de células em formol a 10% por 2 h e, em seguida, loja a 4 ° C em PBS 1x. O tecido pode então ser incorporado em cera/parafina ou tecido OCT para seções congeladas.
  5. Para extrações de EMP, leve o incisivo com pinça fina. Após uma curta exposição ao ar (desidratação ligeira), uma mancha branca será visível em torno da parte média da superfície vestibular do incisivo, que representa o início da mineralização do esmalte. Esta mancha branca corresponde a transição- / cedo maturação-estágio de ameloblastos, então usá-lo como um indicador para a extração de EMPs21.

Resultados

Muitos esmalte defeitos, tais como fluorose dentária12,13, pode resultar de condições ambientais devido à absorção excessiva de flúor ou esmalte hipomineralização semelhante a MIH devido à exposição a alguns CDE1, 7,22. Esses defeitos no desenvolvimento do esmalte podem ser reproduzidos experimentalmente em ratos (

Discussão

Atividade Ameloblasto alterado e/ou interrompidos Ameloblasto proliferação, diferenciação e liderança de processos de maturação a defeitos de esmalte irreversível e, por sua vez, a caracterização de defeitos de esmalte pode ajudar a desenvolver a compreensão de que a alteração Ameloblasto atividade durante a Amelogênese. Assim, os estudos sobre o órgão do esmalte isoladas são determinantes para elucidar os eventos patológicos levando a esmalte defeitos seja qual for a sua origem, ambiental ou genética....

Divulgações

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Universidade Paris-Diderot, o Instituto Nacional francês de saúde e pesquisa médica (INSERM) e o Instituto Francês de pesquisa odontológica (IFRO).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bisphenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formalin 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FranceTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, France74126RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibodySanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816rabbit polyclonal antibody
PBS 10xEUOMEDEXET330.A
Sodium fluoride (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast regularLeica microsystems, Nanterre cedex, France39601006called was/parafin in the text
tissue OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, France411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cmPHYMEP , Paris, France14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cmPHYMEP, Paris, France10035-12
Curved Scalpel BladePHYMEP , Paris, France10035-20
Dissecting Knife - Fine/Straight TipPHYMEP , Paris, France10055-12
Circle KnifePHYMEP, Paris, France10059-15
scalpel blades n°11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, France233-0024
binocular lensLeica biosystems, Nanterre cedex, FranceMZFLIII

Referências

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S., Gibert, Y. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. , 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species?. Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343 (2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1 (2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503 (2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425 (2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. . Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64) Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017)

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Retra oedi o 133rato incisivorg o do esmalteAmelog neseMineralesmalte hipomineraliza odesreguladores end crinosfl or

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados