تطوير أجهزة موائع جزيئية لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في المساحات الصغيرة للغاية

Summary

يمكننا وصف أسلوب التحقيق في القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، تمديد عبر الفجوات ضيقة للغاية (~ 1 ميكرومتر) في جهاز موائع جزيئية.

Abstract

في فيفو، نصيحة زراعة الخلايا النباتية تحتاج إلى التغلب على سلسلة من الحواجز المادية؛ بيد أن الباحثين تفتقر إلى منهجية لتصور السلوك الخلوية في هذه الشروط التقييدية. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعنا دوائر النمو لنصيحة زراعة الخلايا النباتية التي تحتوي على سلسلة من الفجوات الضيقة، مايكرو ملفق (~ 1 ميكرومتر) في ركيزة بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS). هذه مادة شفافة تسمح للمستخدم بمراقبة العمليات استطالة نصيحة في الخلايا الفردية أثناء الاختراق ميكروجاب بالوقت الفاصل بين التصوير. باستخدام هذا البرنامج التجريبي، لاحظنا التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح كما أنهم توغلوا في ميكروجاب. ألقينا القبض على خلايا الحيوانات المنوية في أنبوب اللقاح والتغيرات الدينامية في شكل نواة النباتي المسمى فلوريسسينتلي خلال هذه العملية. وعلاوة على ذلك، أثبتنا قدرة جذر الشعر وبروتونيماتا موس على اختراق الفجوة 1 ميكرومتر. يمكن استخدامها لدراسة كيف الفردية الخلايا تستجيب لمسافات مقيدة فعلياً هذا المنهاج في المختبر ويمكن أن يوفر رؤى آليات النمو تلميح.

Introduction

بعد أن تنبت حبوب اللقاح على وصمة عار، تنتج كل الحبوب أنبوب اللقاح واحد يحمل الخلايا المنوية لخلية البويضة والخلية المركزية في أبل للتسميد مزدوجة. تمديد من خلال النمط أنابيب اللقاح وفي نهاية المطاف التوصل إلى ovule واسطة الاستشعار إشارات التوجيه متعددة على طول هذه الطريق¹. أثناء الاستطالة، أنابيب اللقاح تواجه سلسلة من الحواجز المادية؛ المسار يحيل مليء بالخلايا، ويجب إدخال اللقاح أنابيب دقيقة فتح ميكروبيلار أبل للوصول إلى تلك المستهدفة (الشكل 1A)². ولذلك، يجب أن يكون لديك أنابيب اللقاح القدرة على اختراق الحواجز المادية، مع التغاضي عن إجهاد ضاغطة من البيئة المحيطة بهم. الشعر الجذر هي نوع آخر من تلميح زراعة الخلايا النباتية التي يجب أن تحمل العقبات المادية في البيئة، وفي شكل جسيمات التربة معبأة (الشكل 1B).

وقد درست مختلف الخصائص الميكانيكية للأنبوب حبوب اللقاح، بما في ذلك ضغط تورم وتصلب المنطقة قمي للخلية، والتي يمكن قياسها باستخدام^3،بلاسموليسيس وليدة الأسلوب⁴ ومجهر القوة الخلوية (CFM) ^{5 , 6}، على التوالي. ومع ذلك، هذه الأساليب وحدها لا تكشف عما إذا كانت أنابيب اللقاح قادرون على التمطيط من خلال الحواجز المادية على طول مسارات النمو. هو أسلوب بديل يتيح استطالة أنبوب اللقاح المرصودة في فيفو مجهرية فوتون اثنين⁷. ومع ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، من الصعب مراقبة التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح الفردية العميقة داخل الأنسجة أبل. بالإضافة إلى ذلك، نمو الشعر الجذر في التربة يمكن تصور استخدام الأشعة السينية حسبت التصوير المقطعي (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)⁸، أن كان ذلك مع دقة منخفضة. نقدم هنا، طريقة التي يمكن استخدامها للحصول على صور عالية الاستبانة لعملية تشوه لإحدى الخلايا في مجهر التقليدي.

والهدف العام للأسلوب الموصوفة هنا هو تصور قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، في مساحات صغيرة للغاية. كما ميكروديفيسيس بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS) قدم في هذه المخطوطة شفافة بصريا، والهواء نفاذية، يمكننا الثقافة الخلايا الحية داخل الجهاز ومراقبة سلوكهم النمو تحت مجهر. من الممكن أيضا لإنشاء الصغير ~ ممنوع مقياس نانومتر ب تقنية الطباعة الحجرية الناعمة⁹ باستخدام قوالب. هذه الميزات السماح لنا لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في بيئة محصورة فعلياً.

في هذا العمل، نحن شيدت 1 ميكرومتر فجوات واسعة (4 ميكرومتر في الطول) في أجهزة موائع جزيئية وفحص قدرة أنابيب اللقاح على اختراق هذه العقبات المصطنعة التي أصغر بكثير من قطر أنبوب أسطواني حبوب اللقاح (حوالي 8 ميكرومتر). هذا منصة تجريبية تمكننا من تصور ردا على أنبوب اللقاح إلى ميكروجابس والتقاط الصور الوقت الفاصل بين الاستجابة، التي تتبع عملية التشوه للخلية. كما وضعنا أيضا ميكروديفيسيس التي يمكن استخدامها للتحقيق في القدرة على اختراق جذر الشعر وبروتونيماتا موس. ميكروديفيسيس عدة وردت حتى الآن تمكن من التصور من الجذر^10،11،،من¹²¹³ وموس بروتونيماتا¹⁴ نمو النبات بدقة عالية. لدينا جهاز، سلسلة من القنوات نمو الشعر الجذر عمودياً متصلاً بدائرة نمو الجذري، وتسترشد كل جذر الشعر (حوالي 7 ميكرومتر في القطر) إلى قنوات فلويديك مع وجود فجوة واسعة 1 ميكرومتر. ونحن أيضا مثقف موس بروتونيماتا (حوالي 20 ميكرومتر في القطر) في ميكروديفيسي التي تحتوي على ميكروجابس للنظر في ردودهم على هذه الحواجز المادية. النهج القائم على موائع جزيئية المقترح الذي يسمح لنا باستكشاف قدرة مختلف نصيحة زراعة الخلايا النباتية على تمديد من خلال المساحات الصغيرة للغاية، لا يمكن دراستها بأي طريقة أخرى متاحة حاليا.

Protocol

1-تلفيق ميكروديفيسي PDMS لدراسة نمو أنابيب اللقاح وموس بروتونيماتا

ملاحظة: استخدمنا أداة التصويرية مسكلس لإعداد قوالب PDMS على رقائق السليكون. يتم حذف التفاصيل المتعلقة بتشغيل النظام في هذه المخطوطة. قد تستعمل أيضا تقنية الطباعة التصويرية قياسي⁹ استخدام النبائط لإنشاء قوالب PDMS الموصوفة في هذه المخطوطة.

1. من أجل 11 غ خليط البوليمر قبل PDMS (الاستومر قاعدة: علاج عامل بنسبة 10:1) إلى كل العفن 4 بوصة.
2. ديغا العفن إعدادها في الخطوة 1، 1 لمدة 20 دقيقة في فراغ غرفة.
3. وبعد علاج عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في فرن غير الحراري، قشر الطبقة PDMS قبالة العفن ولكمه ثقوب الوصول إلى القنوات فلويديك استخدام اللكمات خزعة.
   ملاحظة: للجهاز أنبوب اللقاح، يجب ضبط حجم الحفرة تعكس قطر المدقة. ولذلك سوف تختلف هذه القيمة حسب الأنواع. في هذه التجربة، نحن لكمه ثقب 1 مم لمداخل المدقة وثقوب 1.5 مم للخزانات المتوسطة السائل. الجهاز بروتونيماتا موس، استخدمت ثقب 4 ملم للخزان عينة.
4. تعرض طبقة PDMS وطبق أسفل زجاج (3.5-5 سم في القطر) إلى الهواء البلازما لمدة 50 ثانية.
5. اضغط طبقة PDMS في صحن أسفل الزجاج والحرارة عند 65 درجة مئوية مدة 30 دقيقة في فرن غير الحراري تماما إغلاق الشبكة موائع جزيئية.

2-تلفيق ميكروديفيسي PDMS لجذر الشعر

1. كرر الخطوات من 1.1-1.3 باستخدام قوالب إعداد طبقتين PDMS للجذر وجذور الشعر ميكروديفيسيس.
   ملاحظة: كنا ثقب 2 مم للخزانات المتوسطة السائل في ميكروديفيسي الجذر.
2. فضح كل طبقات PDMS الجوي البلازما لمدة 50 ثانية.
3. تجميع طبقتين PDMS تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام راصفة سطح مكتب حسب الطلب.
   ملاحظة: يجب أن تواجه بعضها البعض ميكروتشانيلس على هذه الطبقات PDMS. قبل تجميع، تأكد من تطابق علامات محاذاة على حد سواء طبقات.
4. الحرارة عند 65 درجة مئوية مدة 30 دقيقة في فرن غير الحراري تماما إغلاق الشبكة موائع جزيئية.
5. إزالة بكشف الغطاء عن ميكروديفيسي المشيدة ووضع الجهاز على طبق أسفل زجاج الذي 5 سم في القطر.

3-إعداد من "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" لأنابيب لقاح (فورنيري تورينيا)

1. إعداد المتوسطة تعديل نيتش كما هو موضح مسبقاً¹⁵ والاوتوكلاف المتوسطة في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: يتم تكوين المتوسطة في نيتش موديفيد NH₄لا₃ (80 مغ/لتر)، كنو₃ (125 مغ/لتر)، كاليفورنيا (لا₃)₂‧4H₂س (500 مغ/لتر)، مجسو₄‧7H₂س (125 مغ/لتر)، خ₂ص₄ (125 مغ/لتر )، منسو₄‧4H₂س (3 مغ/لتر)، زنسو₄‧7H₂س (0.5 مغ/لتر)، ح₃بو₃ (10 مغ/لتر)، وخصصت₄‧5H₂س (0.025 ميلغرام/لتر)، غ₂مو₄‧2H₂س (0.025 ميلغرام/لتر)، السكروز (50,000 مغ/لتر)، والكازين (500 مغ/لتر). ويمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 أشهر على الأقل.
2. إعداد 26% (w/v) البولي إيثيلين غليكول استخدام المياه يعقم وتصفية الحل مع عامل تصفية مسام 0.3 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
3. مزيج من الكواشف إعدادها في الخطوة 3.1 و 3.2 في نسبة 1:1 (v/v).
   ملاحظة: هذا المتوسط ينبغي إعداد جديدة لكل استخدام.

4-الإعداد "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" لجذر الشعر (نبات التمويل)

1. إعداد حل السكروز 1% (w/v) Murashige & سكوغ المتوسطة، 0.05% (w/v) مس، 0.215% (w/v)، واجار 1% (w/v) في المياه. اﻷوتوكﻻف الحل في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

5-إعداد من "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" "المعايير الأمنية التنفيذية الدنيا بروتونيماتا" (فيسكوميتريلا مفتوحة)

1. قبل احتضانها بروتونيماتا موس في المتوسط¹⁶ بكدات في طبق بتري.
   ملاحظة: يتم تكوين المتوسطة بكدات 1 مم MgSO₄، 10 مم كنو₃, 45 ميكرومتر FeSO₄، 1.8 مم خ₂ص₄ (الرقم الهيدروجيني تعديلها إلى 6.5 مع كوه)، حل العناصر النزرة (0.22 ميكرومتر CuSO₄، ميكرومتر 0.19 زنسو₄، 10 ميكرون ح₃بو ₃و 0.1 ميكرومتر Na₂مو₄، 2 ميكرومتر الحركة₂، 0.23 ميكرومتر كوكل₂و 0.17 ميكرون كي)، كاكل 1 مم₂، و 5 مم ثنائي الأمونيوم (+)-طرطرات.
2. الثقافة موس في المتوسط بكداتج في ميكروديفيسي.
   ملاحظة: هو المتوسط بكداتج المتوسطة بكدات مع جلوكوز 0.5% (w/v). يمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.

6-كولتورينج في المختبر من أنابيب اللقاح ت. فورنيري في ميكروديفيسي

1. ضع ميكروديفيسي أنبوب اللقاح في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
2. إزالة ميكروديفيسي من فراغ الغرفة وإدخال المتوسطة النمو إلى مدخل المدقة باستخدام ميكروبيبيتي مع تلميح جيد جداً. ملء الآبار المتبقية إلى قمم بهم مع المتوسط نفسها. انتظر لبضع دقائق حتى تمتلئ جميع ميكروتشانيلس المتوسطة بالفراغ الناشئ داخل ميكروتشانيلس.
3. ضع بعض منشفة ورقية رطبة في الطبق أسفل الزجاج للمحافظة على درجة الرطوبة في الطبق.
4. نقل حبوب اللقاح من نوع البرية زهرة فورنيري ت. 'الأزرق والأبيض' للوصم استخدام إبرة تشريح.
   ملاحظة: نحن أيضا إجراء هذه التجربة مع المعدلة وراثيا فورنيري ت. 'ولي العهد البنفسجي' زهرة ( RPS5Ap::H2B-تدتوماتو خط¹⁷)، مع أنابيب اللقاح الذي يحتوي على الخلايا المنوية المسماة فلوريسسينتلي ونوى الخضري.
5. قص نمط بوليناتيد (1 سم) باستخدام شفرة.
6. إدراج نمط قطع في المدخل للجهاز كما هو موضح في الشكل 2.
7. وضع غطاء على الطبق وختم ذلك بالشريط.
8. ضع الجهاز في حاضنة في 28 درجة مئوية ح 5-6 في الظلام.

7-كولتورينج في المختبر التمويل (أ) جذر الشعر في ميكروديفيسي

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات 7.1-7.9 (باستثناء 7.3 و 7.5) في غطاء الاندفاق الصفحي.

1. تعقيم البذور من التمويل (أ) كولومبيا (Col-0) والمعدلة وراثيا خط UBQ10pro::H2B-مكلوفير (التي تحتوي على العلامة النووي الفلورسنت) التي نقع عليها في سائل معقم (التبييض المنزلي 5% (v/v) و 0.02% (v/v) Triton X-100) لمدة 5 دقائق.
2. دقة شطف بذور معقمة مع يعقم ماء.
3. تخزين البذور مشطوف في الماء لمدة يومين في 4 درجات مئوية في الظلام.
4. تعقيم ميكروديفيسي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
5. وضع في ميكروديفيسي في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
6. أعرض المتوسطة النمو للآبار في الجهاز باستخدام ميكروبيبيتي. انتظر لبضع دقائق حتى يملأ الفراغ جميع ميكروتشانيلس مع المتوسط.
7. يعقم مكان الرطب منشفة ورقية في الطبق أسفل الزجاج للمحافظة على درجة الرطوبة في الطبق.
8. نقل بذور معقمة في مدخل الجهاز.
9. وضع غطاء على الطبق وختم ذلك بالشريط.
10. وضع الجهاز رأسياً في حاضنة عند 22 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض مستمر.
11. تحقق نمو الشعر الجذر بعد 4-10 أيام حضانة. الحصول على حقل مشرق والفلورسنت الصور باستخدام مجهر مقلوب.

8-كولتورينج في المختبر البراءات P. (موس) بروتونيماتا في الجهاز موائع جزيئية

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات 8.2 8.6 (باستثناء 8.3) في غطاء الاندفاق الصفحي.

1. بريكولتوري P. مفتوحة سلالة جرانسدين 2004¹⁸ في المتوسط بكدات مغطاة السيلوفان في طبق بتري لمدة أسبوع تحت الضوء الأبيض مستمر عند 25 درجة مئوية.
2. تعقيم ميكروديفيسي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها في غطاء الاندفاق الصفحي.
3. وضع في ميكروديفيسي في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
4. أعرض المتوسطة النمو للآبار باستخدام ميكروبيبيتي. انتظر لبضع دقائق حتى يملأ الفراغ جميع ميكروتشانيلس مع المتوسط.
5. إضافة يعقم المياه إلى الطبق المحيطة ميكروديفيسي للحفاظ على نسبة الرطوبة في الطبق.
6. نقل قطعة صغيرة من الأنسجة بروتونيماتا موس إلى المدخل ميكروديفيسي والثقافة الأنسجة في حاضنة عند 25 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض مستمر.
7. تحقق نمو بروتونيماتا موس بعد 2-3 أسابيع حضانة. الحصول على الصور الميدانية مشرقة باستخدام مجهر.

9-الوقت الفاصل بين التصوير من "نمو أنبوب اللقاح" فورنيري ت.

1. وضع في ميكروديفيسي على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة بصورة اقتناء الأجهزة (على سبيل المثال.، كاميرا CCD) والبرمجيات. العثور على المواقع ميكروجاب.
   ملاحظة: للبرنامج الحصول على الصور، استخدمنا منتج متوفرة تجارياً (جدول المواد). برمجيات المصدر المفتوح مجهرية مثل µManager هي أيضا متاحة على الإنترنت (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). نوصي بتثبيت مكثف مجهر على المجهر للحصول على الصور دقة أعلى.
2. التقاط الصور الميدانية مشرق كل 10 s باستخدام مجهر صورة اقتناء البرمجيات.
3. أن تلتزم بالخلايا المنوية المسماة فلوريسسينتلي ونواة الخضري في أنبوب اللقاح من خط RPS5Ap::H2B-تدتوماتو ، يتهددها العينة مع 561 نانومتر الليزر واستخدام عامل تصفية ممر الموجه ضوئية (578/105 nm).
   ملاحظة: على الرغم من أن تم القبض على الصور الوقت الفاصل بين نمو أنبوب اللقاح مرارا، لا يبدو التصوير تؤثر على النمو. ومع ذلك، ينصح دائماً التقليل من كثافة الليزر، ووقت التعرض، والفاصل الزمني للوقت الفاصل، للتقليل من الضيائية وفوتوبليتشينج من فلوروفوري.
4. ضبط السطوع والتباين من الصور وإعداد ملف فيديو باستخدام برنامج إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/).

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1، نصيحة زراعة الخلايا النباتية تواجه سلسلة من الحواجز المادية على طول على مسارات النمو في فيفو. تمكين موائع جزيئية في المختبر خلية ثقافة الأنظمة الأساسية المقدمة في هذه الدراسة الدراسة تنامي نصيحة عملية في ثلاثة أنواع من ال...

Discussion

العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول يلزم اتباعها الضبط للحصول على النتائج المعروضة أعلاه. أولاً، السطوح PDMS الطبق أسفل طبقة والزجاج كلاهما يتعين علاجها بالبلازما لمدة كافية من الوقت قبل الربط. خلاف ذلك، قد فصل طبقة PDMS محلياً من سطح الزجاج بينما تعبر نصيحة زراعة الخلايا في ميكروجابس. آخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices