매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

요약

팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법¹에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)²도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.

꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis^3,방법⁴ 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) ^{5 , 6}, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경⁷이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)⁸를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.

여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술⁹ 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.

이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트^10,11,12,13 모스 protonemata¹⁴ 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.

프로토콜

1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼

참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은⁹ 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

1. 11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.
2. 형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드
3. 비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치.
   참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다.
4. PDMS 층 및 유리 하단 접시 (지름에서 3.5-5 c m) 50 플라즈마 공기 노출 s.
5. 미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 동안 유리 바닥 접시와 65 ° C에서 열 PDMS 레이어를 누릅니다.

2. 루트 머리카락에 대 한 PDMS Microdevice의 제조

1. 1.1-1.3 루트 및 루트 머리 렌에 대 한 두 개의 PDMS 레이어를 준비 하는 금형을 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
   참고: 루트 microdevice에서 액체 중간 저수지에 2mm 구멍을 사용.
2. 노출 50 플라즈마 공기 PDMS 레이어 모두 s.
3. 맞춤 바탕 화면 동기 기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 2 개의 PDMS 층을 조립.
   참고: 이러한 PDMS 레이어에 microchannels 서로 직면해 야 합니다. 조립, 전에 두 레이어에 정렬 마크 일치 하는지 확인 하십시오.
4. 미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 65 ° C에서 열.
5. 생성 된 microdevice에서 커버 슬립을 제거 하 고 장치는 직경 5 cm 유리 하단 접시에 놓습니다.

3. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 꽃가루 관 (Torenia fournieri)에 대 한

1. 20 분에 대 한 수정된 니 매체 앞에서 설명한¹⁵ 및 고압 121 ° C에서 매체를 준비 합니다.
   참고: 수정 니 매체의 조성은 NH₄₃ (80 mg/L), 알 것₃ (125 mg/L), Ca (₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂포₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0.5 mg/L), H₃보₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0.025 mg/L), 총₂MoO₄‧2H₂O (0.025 mg/L), 자당 (50000 mg/L), 그리고 카 세 인 (500 mg/L). 준비 된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 4 개월 동안 적어도.
2. 26% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 압력가 이온된 수를 사용 하 여 준비 하 고 0.3 µ m 기 공 필터 솔루션을 필터링.
   참고: 준비 중간 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월.
3. 3.1 및 3.2 1:1 (v/v) 비율에 단계에서 준비 하는 시 약을 혼합.
   참고:이 매체 준비 되어야 한다 신선한 각 사용에 대 한.

4. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 루트 머리카락 (애기 thaliana)에 대 한

1. 0.215% (w/v) 村 重 & Skoog 매체, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) 자당과 이온된 수 한 천 1% (w/v)의 솔루션을 준비 합니다. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션.

5. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 모스 Protonemata (Physcomitrella patens)에 대 한

1. 전 모스 protonemata BCDAT 중간¹⁶ 페 트리 접시에 품 어.
   참고: BCDAT 매체의 조성은 1mm MgSO₄, 10 m m 알 것₃, 45 µ M FeSO₄, 1.8 m m KH₂포₄ (pH 6.5 코와 조정), 추적 요소 솔루션 (0.22 μ M CuSO₄, 0.19 µ M ZnSO₄, 10 µ M H₃보 ₃, 0.1 µ M 총₂MoO₄, 2 µ M MnCl₂, 0.23 µ M CoCl₂및 0.17 µ M 기), 1 m m CaCl₂및 5 밀리미터 diammonium (+)-주석산.
2. 문화는 microdevice에서 BCDATG 매체에 이끼.
   참고: BCDATG 매체는 0.5% (w/v) 포도와 BCDAT 매체. 준비 된 매체는 1 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

6. 생체 외에서 Culturing T. fournieri 는 Microdevice에서 꽃가루 관의

1. 진공 챔버에 꽃가루 관 microdevice을 놓고 20 분 드.
2. 진공 약 실에서 있는 microdevice를 제거 하 고 아주 좋은 팁는 micropipette를 사용 하 여 암 술 입구에 성장 매체를 소개. 같은 매체에 그들의 정상에 남아 있는 우물 채우십시오. 내부는 microchannels 만든 진공에 의해 매체와 모든 microchannels 가득 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
3. 접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 몇 가지 젖은 종이 타월을 놓습니다.
4. 야생-타입에서 꽃가루 곡물을 전송 해 부 바늘을 사용 하 여 그것의 오명에 T. fournieri '파란색과 흰색' 꽃.
   참고: 또한 유전자 변형 T. fournieri 와 함께이 실험 실시 '바이올렛 왕관' 꽃 ( RPS5Ap::H2B-tdTomato ¹⁷선), 붙일 레이블된 정자 세포와 식물 핵을 포함 하는 꽃가루 관.
5. 잘라 좋게 스타일 (1 ㎝ 길이)는 블레이드를 사용합니다.
6. 그림 2와 같이 장치에 컷된 스타일을 삽입 합니다.
7. 접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.
8. 어둠 속에서 5-6 h 28 ° C에 인큐베이터에 장치를 넣습니다.

7. A. thaliana 루트 머리는 Microdevice에서의 생체 외에서 Culturing

참고: 단계 7.1 7.9 (제외 7.3 및 7.5) 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.

1. A. thaliana 컬럼비아 (열-0)에서 종자 소독와 유전자 변형 라인 UBQ10pro::H2B mClover (형광 핵 마커 포함) 5 분에 대 한 살 균 액체 (5% (v/v) 가구 표 백제와 0.02% (v/v) 트라이 톤 X-100)에서 그들을 몸을 담글 하 여.
2. 철저 하 게 린스 압력가 마로 소독 물 살 균된 씨.
3. 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 물에 씻어 서 씨앗 저장 합니다.
4. 밤새 UV 빛에서 microdevice를 소독.
5. 진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.
6. 장치는 micropipette 사용 하 우물에 성장 매체를 소개 합니다. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
7. 접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 압력가 젖은 종이 타월을 놓습니다.
8. 장치의 입구에 소독된 씨앗을 전송 합니다.
9. 접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.
10. 연속 하얀 빛 아래에서 22 ° C에서 인큐베이터에 수직으로 장치를 놓습니다.
11. 외피의 4-10 일 후 루트 머리 성장 확인. 밝은 분야와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.

8. 피. patens (이끼) 미세 장치에서 Protonemata의 생체 외에서 Culturing

참고: 단계 8.2 8.6 (8.3)을 제외 하 고 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.

1. 25 ° c.에 연속 하얀 빛 아래에서 1 주일 동안 배양 접시에 셀로판으로 덮여 BCDAT 매체에 P. patens 스트레인 Gransden 2004¹⁸ preculture
2. UV 광원을 층 류 두건에서 하룻밤 microdevice 소독.
3. 진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.
4. 성장 매체는 micropipette 사용 하 우물에 소개. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
5. 접시는 접시에 습도 유지 하기 위해 microdevice를 주변에 압력가 물을 추가 합니다.
6. microdevice의 입구에 모스 protonemata 조직의 작은 조각을 전송 하 고 연속 하얀 빛 아래에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 조직 문화.
7. 외피의 2-3 주 후 모스 protonemata 성장 확인. 현미경을 사용 하 여 밝은 필드 이미지를 얻을.

9. T. fournieri 꽃가루 관 성장 시간 경과 영상

1. 이미지 수집 하드웨어를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 microdevice를 배치 (예., CCD 카메라) 및 소프트웨어. Microgap 위치를 찾아.
   참고: 이미지 수집 소프트웨어 사용 했습니다 상용 제품 (자료 테이블). µManager와 같은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 사용할 수 온라인 (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) 이기도합니다. 더 높은 해상도 이미지를 현미경에 현미경 콘덴서를 설치 하는 것이 좋습니다.
2. 모든 10 필드 밝은 이미지를 캡처 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 s.
3. 관찰 하기 위해 붙일 레이블된 정자 세포와 RPS5Ap::H2B tdTomato 라인의 꽃가루 관 식물 핵, 561 nm 레이저는 견본을 비추는 및 대역 통과 광 필터를 사용 하 여 (578/105 nm).
   참고: 꽃가루 관 성장의 시간 경과 이미지는 자주 체포 되었다, 비록 이미징 성장에 영향을 미치는 듯 하지 않았다. 그러나, 그것은 항상 레이저 강도, 노출 시간, phototoxicity 및 photobleaching는 fluorophore의 최소화 하기 위해 시간 간격을 최소화 하 고 좋습니다.
4. 이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 비디오 파일을 준비.

결과

그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스

토론

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices