Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode pour étudier la capacité de pointe de plus en plus des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, à s’allonger à travers des ouvertures très étroites (~ 1 µm) dans un dispositif microfluidique.

Résumé

In vivo, astuce-culture de cellules végétales doivent surmonter une série d’obstacles physiques ; Toutefois, les chercheurs n’ont pas la méthodologie afin de visualiser le comportement cellulaire dans de telles conditions restrictives. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des chambres de croissance pour pointe-croissance des cellules végétales qui contiennent une série de lacunes étroits, fabriqués en micro (~ 1 µm) dans un substrat de poly-diméthylsiloxane (PDMS). Ce matériau transparent permet à l’utilisateur de surveiller les processus d’élongation Astuce dans des cellules individuelles lors de la faible pénétration par imagerie de Time-lapse. En utilisant cette plate-forme expérimentale, nous avons observé des changements morphologiques dans les tubes polliniques comme ils ont violé le faible. Nous avons capturé les changements dynamiques sous la forme d’un noyau végétatif fluorescent étiqueté et les spermatozoïdes dans un tube de pollen au cours de ce processus. En outre, nous avons démontré la capacité des poils absorbants et mousse protonéma de pénétrer l’écart de 1 µm. Cette plate-forme in vitro peut être utilisée pour étudier comment les cellules répondent aux espaces physiquement contraints et peut apporter un éclairage sur les mécanismes de croissance apicale.

Introduction

Après que les grains de pollen germent sur un stigmate, chaque grain produit un seul tube pollinique qui transporte les spermatozoïdes à l’oosphère et la cellule centrale de l’ovule pour la double fécondation. Les tubes polliniques s’allongent à travers le style et finissent par atteindre l’ovule en détectant des repères d’orientation multiples le long de leurs voies¹. Au cours de l’élongation, tubes polliniques rencontrent une série d’obstacles physiques ; la voie de transmission est remplie de cellules, et les tubes polliniques doit entrer la minute ouverture micropylaire de l’ovule pour atteindre leur cible (Figure 1 a)². Par conséquent, les tubes polliniques doit avoir la capacité de pénétrer les obstacles physiques, tout en tolérant la contrainte de compression de leur environnement. Les poils sont un autre type de cellule végétale productrices de pointe qui doit résister à des obstacles physiques dans l’environnement, sous forme de particules de terre battue (Figure 1 b).

Différentes propriétés mécaniques du tube pollinique ont été étudiées, y compris la pression de turgescence et la rigidité de la région apicale de la cellule, qui peut être mesurée au moyen du début de la plasmolyse méthode^3,4 et microscopie à force cellulaire (CFM) ^{5 , 6}, respectivement. Cependant, ces méthodes seuls ne révèlent pas si les tubes polliniques sont capables d’allonger à travers des barrières physiques le long de leur parcours de croissance. Une autre technique qui permet l’allongement du tube pollinique d’être surveillé en vivo est deux photons microscopie⁷. Cependant, avec cette méthode, il est difficile d’observer les changements morphologiques dans les tubes polliniques individuels à l’intérieur du tissu de l’ovule. En outre, la croissance des cheveux de la racine dans le sol peut être visualisée à l’aide de la radiographie calculée par tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)⁸, mais avec une résolution faible. Nous présentons ici une méthode qui permet d’acquérir des images à haute résolution du processus de déformation de la cellule sur un microscope conventionnel.

L’objectif global de la méthode décrite ici consiste à visualiser la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, dans des espaces très réduits. Comme les micro-dispositifs poly-diméthylsiloxane (PDMS) présentées dans ce manuscrit sont optiquement transparents et air perméable, nous pouvons la culture de cellules vivantes à l’intérieur de l’appareil et observer leurs comportements de croissance sous un microscope. Il est également possible de créer des micro ~ espaces échelle nanométrique par la technique de lithographie douce⁹ avec l’utilisation de moules. Ces caractéristiques nous permettent d’étudier la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales en milieu confiné physiquement.

Dans ce travail, nous construit 1 µm et grandes lacunes (4 µm de hauteur) dans des dispositifs microfluidiques et examiné la capacité des tubes polliniques de pénétrer ces obstacles artificiels qui sont beaucoup plus petits que le diamètre du tube pollinique cylindrique (environ 8 µm). Cette plate-forme expérimentale nous permet de visualiser la réponse du tube pollinique de microgaps et de capturer des images de la réponse, Time-lapse qui suivre les processus de déformation de la cellule. Nous avons également élaboré les micro-dispositifs qui peut être utilisé pour étudier la capacité de pénétration des poils absorbants et protonéma de mousse. Plusieurs microdevices ont été signalés à ce jour permettant la visualisation de la racine^10,11,12,13 et moss protonéma¹⁴ croissance végétale à haute résolution. Dans notre dispositif, une série de canaux de croissance de cheveux de la racine sont connectés perpendiculairement à une chambre de croissance des racines et radicelles individuels (environ 7 µm de diamètre) sont guidés vers les canaux fluidiques avec un grand écart de 1 µm. Nous avons cultivé aussi mousse protonéma (environ 20 µm de diamètre) dans un MICRODISPOSITIF contenant microgaps afin d’examiner leurs réponses à ces barrières physiques. L’approche proposée par microfluidique permet d’explorer la capacité des différentes cellules végétales astuce-de plus en plus à s’allonger dans des espaces extrêmement faibles, qui ne peuvent être examinées par toute autre méthode actuellement disponible.

Protocole

1. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour étudier la croissance des Tubes polliniques et point de riz protonéma

NOTE : Nous avons utilisé un instrument sans masque photolithographie pour préparer des moules PDMS sur des plaquettes de silicium. Les détails concernant le fonctionnement du système sont omises dans ce manuscrit. Une technique de photolithographie standard⁹ à l’aide d’un photomasque peut également être utilisé pour créer les moules PDMS décrits dans ce manuscrit.

1. Verser 11 g de mélange PDMS prépolymère (élastomère de base : polymérisation agent à un ratio de 10:1) dans chaque moule de 4 pouces.
2. Dégazer le moule préparé à l’étape 1.1 pendant 20 min dans une chambre à vide.
3. Après durcissement à 65 ° C pendant 90 min dans un four sans convection, éplucher la couche PDMS hors du moule et percer des trous d’accès dans les circuits fluidiques à l’aide de poinçons de biopsie.
   Remarque : Pour le dispositif du tube pollinique, la taille du trou doit être ajustée pour tenir compte du diamètre du pistil. Cette valeur va donc varier par espèce. Dans cette expérience, nous avons perforé un trou de 1 mm pour les entrées de pistil et trous de 1,5 mm pour les réservoirs moyens liquides. Pour le dispositif de protonéma moss, un trou de 4 mm a été utilisé pour le réservoir de l’échantillon.
4. Exposer la couche PDMS et un plat en verre bas (3,5 à 5 cm de diamètre) dans le pour atmosphère de plasma pour 50 s.
5. Appuyez sur la couche PDMS dans le plat en verre bas et chauffer à 65 ° C pendant 30 min dans un four sans convection d’isoler complètement le réseau microfluidique.

2. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour poils absorbants

1. Répétez les étapes 1.1 à 1.3, en utilisant les moules pour préparer deux couches PDMS à la racine et les poils absorbants microdevices.
   NOTE : Nous avons utilisé un trou de 2 mm pour les réservoirs liquides moyens dans le MICRODISPOSITIF de racine.
2. Exposer les deux couches PDMS air plasma pour 50 s.
3. Assembler les deux couches PDMS sous un stéréomicroscope utilisant un aligneur de bureau sur mesure.
   Remarque : Les microcanaux sur ces couches PDMS doivent faire face à l’autre. Avant le montage, s’assurer que les repères sur les deux couches s’alignent.
4. Chauffer à 65 ° C pendant 30 min dans un four sans convection d’isoler complètement le réseau microfluidique.
5. Retirer la lamelle couvre-objet de la MICRODISPOSITIF construite et placez l’appareil sur un plat de fond de verre qui est de 5 cm de diamètre.

3. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour les Tubes polliniques (Torenia fournieri)

1. Préparer le milieu de Nitsch modifiée comme décrit plus haut¹⁵ et stériliser le milieu à 121 ° C pendant 20 min.
   Remarque : La composition du milieu de la Nitsch modifed est NH₄NO₃ (80 mg/L), le KNO₃ (125 mg/L), le Ca (NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0,5 mg/L), H₃BO₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0,025 mg/L), Na₂MoO₄‧2H₂O (0,025 mg/L), saccharose (50 000 mg/L) et la caséine (500 mg/L). Le prêt moyen peut être stocké à 4 ° C pendant 4 mois au moins.
2. Préparer le polyéthylèneglycol de 26 % (p/v) à l’aide de l’eau désionisée autoclavé et filtrer la solution avec un filtre de porosité de 0,3 µm.
   Remarque : Le support préparé peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.
3. Mélanger les réactifs préparés à l’étape 3.1 et 3.2 dans un ratio de 1:1 (v/v).
   NOTE : Ce support doit être préparé fraîche pour chaque utilisation.

4. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour les poils absorbants (Arabidopsis thaliana)

1. Préparer une solution de saccharose de 0,215 % (p/v) milieu de Murashige et Skoog moyenne, 0,05 % (p/v) MES, de 1 % (p/v) et 1 % (p/v) d’agar dans de l’eau désionisée. Autoclave la solution à 121 ° C pendant 20 min.

5. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour Moss protonéma (Physcomitrella patens)

1. Les incuber le protonéma de mousse en BCDAT moyenne¹⁶ dans une boîte de Pétri.
   Remarque : La composition du milieu BCDAT est 1 mM MgSO₄, 10 mM KNO₃, 45 µM FeSO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH ajusté à 6.5 avec KOH), solution d’oligo-éléments (0,22 µM CuSO₄, 0,19 µM ZnSO₄, 10 µM H₃BO ₃, 0,1 µM Na₂MoO₄, 2 µM MnCl₂, 0,23 µM CoCl₂et 0,17 µM KI), 1 mM CaCl₂et 5 mM diammonium (+)-tartrate.
2. Culture de la mousse dans le milieu BCDATG dans le MICRODISPOSITIF.
   NOTE : Le support BCDATG est BCDAT moyenne de 0,5 % (p/v) de glucose. Le prêt moyen peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.

6. in Vitro Culturing des Tubes polliniques fournieri T. dans la MICRODISPOSITIF

1. Placer le tube pollinique MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
2. Enlever le MICRODISPOSITIF de la chambre à vide et d’introduire le milieu de croissance à l’entrée du pistil à l’aide d’une micropipette avec une pointe très fine. Remplir les puits restants à leur partie supérieure avec le même milieu. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que tous les microcanaux sont remplis avec le milieu grâce à la dépression créée à l’intérieur les microcanaux.
3. Placer une serviette de papier humide dans le plat de fond de verre pour maintenir l’humidité dans le plat.
4. Transférer les grains de pollen d’un sauvage fournieri T. fleur « bleu et blanc » à ses stigmates à l’aide d’une aiguille de dissection.
   NOTE : Nous avons également effectué cette expérience avec un transgénique fournieri T. « Couronne violet » fleur (le RPS5Ap::H2B-tdTomato ligne¹⁷), avec des tubes polliniques contenant les spermatozoïdes fluorescent étiquetés et noyaux végétatifs.
5. Couper le style pollinisée (1 cm de long) à l’aide d’une lame.
6. Insérer le style coupé dans l’entrée de l’appareil, tel qu’illustré à la Figure 2.
7. Mettez un couvercle sur le plat et scellez-la avec du ruban adhésif.
8. Placez l’appareil dans un incubateur à 28 ° C pendant 5-6 h dans l’obscurité.

7. in Vitro Culturing des poils absorbants Arabidopsis dans le MICRODISPOSITIF

Remarque : Les étapes 7.1-7,9 (à l’exception de 7.3 et 7.5) devraient être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

1. Stériliser les graines de la Colombie a. thaliana (Col-0) et les transgéniques ligne UBQ10pro::H2B-mClover (contenant le marqueur fluorescent nucléaire) en les trempant dans un liquide stérile (eau de Javel domestique 5 % (v/v) et 0,02 % (v/v) X-100 Triton) pendant 5 min.
2. Bien rincer les graines stérilisés avec de l’eau stérilisés à l’autoclave.
3. Stocker les graines rincés dans l’eau pendant 2 jours à 4 ° C dans l’obscurité.
4. Stériliser le MICRODISPOSITIF sous la lumière ultraviolette du jour au lendemain.
5. Placer le MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
6. Introduire le substrat de croissance pour les puits dans l’appareil à l’aide d’une micropipette. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le vide remplit tous les microcanaux avec le milieu.
7. Placez un essuie-tout humide autoclavés dans le plat de fond de verre pour maintenir l’humidité dans le plat.
8. Transférer une graine stérilisée dans l’entrée de l’appareil.
9. Mettez un couvercle sur le plat et scellez-la avec du ruban adhésif.
10. Placez l’appareil verticalement dans un incubateur à 22 ° C sous un éclairage blanc continu.
11. Contrôler la croissance des cheveux de la racine après 4 à 10 jours d’incubation. Obtenir le champ lumineux et fluorescents images à l’aide d’un microscope inversé.

8. in Vitro Culturing du P. patens (moss) protonéma dans le dispositif microfluidique

Remarque : Les étapes 8.2-8,6 (à l’exception de 8,3) devraient être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

1. Préculture P. patens souche Gransden 2004¹⁸ sur milieu BCDAT recouvert de cellophane dans une boîte de Pétri pendant une semaine sous une lumière blanche continue à 25 ° C.
2. Stériliser le MICRODISPOSITIF sous la lumière UV du jour au lendemain dans une hotte à flux laminaire.
3. Placer le MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
4. Introduire le substrat de croissance pour les puits à l’aide d’une micropipette. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le vide remplit tous les microcanaux avec le milieu.
5. Ajouter l’eau stérilisés à l’autoclave dans la capsule qui entoure la MICRODISPOSITIF pour maintenir l’humidité dans le plat.
6. Transférer un petit morceau de tissu de protonéma de mousse à l’entrée de la MICRODISPOSITIF et la culture du tissu dans un incubateur à 25 ° C sous un éclairage blanc continu.
7. Vérifier la croissance de protonéma de mousse après 2-3 semaines d’incubation. Obtenir des images de champ lumineux à l’aide d’un microscope.

9. Time-lapse imagerie de la croissance du Tube pollinique fournieri T.

1. Placez le MICRODISPOSITIF sur un microscope à fluorescence inversé équipé du matériel d’acquisition image (e.g., une caméra CCD) et de logiciels. Trouver les endroits de faible.
   Remarque : Pour le logiciel d’acquisition image, nous avons utilisé un produit disponible dans le commerce (Table des matières). Logiciel de microscopie Open source tels que µManager est également disponible en ligne (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Nous vous recommandons d’installer un condenseur de microscope sur la loupe pour obtenir des images de résolution supérieure.
2. Capturer des images de champ lumineux toutes les 10 s en utilisant le logiciel d’acquisition image microscope.
3. Pour observer les cellules du sperme fluorescent étiquetés et noyau végétatif dans le tube pollinique de la ligne de RPS5Ap::H2B-tdTomato , irradier l’échantillon avec 561 laser nm et utiliser un filtre optique passe-bande (578/105 nm).
   Remarque : Bien que les images de Time-lapse de la croissance du tube pollinique ont été capturés fréquemment, l’imagerie ne semble pas affecter la croissance. Toutefois, il est toujours recommandé pour réduire l’intensité du laser, durée d’exposition et l’intervalle Time-lapse, de minimiser la phototoxicité et photoblanchiment du fluorophore.
4. Ajuster la luminosité et le contraste des images et de préparer un fichier vidéo à l’aide de logiciels ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Résultats

Tel qu’illustré à la Figure 1, pointe-culture de cellules végétales rencontrent une série de barrières le long de leurs voies de croissance in vivo. L’in vitro cell culture plateformes microfluidiques présentés dans cette étude a permis l’examen le de la culture pointe de process en trois types de cellules végétales (tubes polliniques, poils absorbants et mousse protonéma) par des fentes artificielle de 1 µm (

Discussion

Plusieurs étapes cruciales dans le protocole doivent être suivies avec précision afin d’obtenir les résultats présentés ci-dessus. Tout d’abord, les PDMS couche verre fond plat des surfaces et doivent tous deux être traités avec plasma pendant une durée suffisante avant collage. Dans le cas contraire, la couche PDMS peut se détacher localement de la surface du verre, tandis que les cellules productrices de pointe traversent le microgaps. Une autre étape cruciale dans le protocole de protonéma de poils abs...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices