JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويحلل هذا البروتوكول السلوك الملاحية ليرقة المورفولوجية استجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامنة في الخلايا العصبية حاسة الشم. ضوء الطول الموجي نانومتر 630 يستخدم لتنشيط الخلايا العصبية حاسة الشم الفردية معربا عن رودوبسين قناة إزاحة الأحمر. تنقل اليرقات يتم تعقبها في نفس الوقت، سجلت رقمياً، وتحليلها باستخدام برنامج مخصص مكتوب.

Abstract

وتستند قدرة الحشرات على الانتقال نحو مصادر رائحة أنشطة تلك الخلايا العصبية مستقبلات الشم الدرجة الأولى (أورنس). بينما تم إنشاؤها قدرا كبيرا من المعلومات فيما يتعلق بالردود اورن إلى أودورانتس، يظل دور ORNs محددة في قيادة الاستجابات السلوكية غير مفهومة. تنشأ مضاعفات في تحليل السلوك بسبب التقلبات المختلفة من أودورانتس أن تنشيط الفردية أورنس، أورنس متعددة تنشيط أودورانتس واحد، والصعوبة في تكرار الملاحظة بطبيعة الحال التغيرات الزمنية في حاسة الشم المحفزات استخدام طرق الإيصال رائحة التقليدية في المختبر. هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي يحلل السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامن لما أورنس. أوبتوجينيتيك التكنولوجيا المستخدمة هنا يسمح لخصوصية اورن التنشيط ومراقبة دقيقة للأنماط الزمانية للتنشيط اورن. يتم تعقب حركة اليرقات المقابلة والمسجلة رقمياً وتحليلها باستخدام مخصص كتابة البرمجيات. باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، يسمح هذا الأسلوب لعنصر تحكم أكثر دقة من فرادى اورن التنشيط من أجل دراسة تأثيرها على سلوك اليرقات. ويمكن تمديد أسلوبنا كذلك دراسة أثر إسقاط الدرجة الثانية من الخلايا العصبية (السندات الإذنية) فضلا عن الخلايا العصبية المحلية (لنس) في سلوك اليرقات. وبالتالي سيمكن هذا الأسلوب تشريح شاملة لوظيفة دائرة حاسة الشم وتكملة الدراسات المتعلقة بحاسة الشم كيف العصبية أنشطة ترجمة في إلى استجابات السلوك.

Introduction

هو لمست حاسة الشم من المعلومات في بيئة المورفولوجية ليرقة قبل 21 فقط ORNs المتميزة وظيفيا، الأنشطة التي تحدد في نهاية المطاف سلوك اليرقات1،2،،من34. ومع ذلك، المعروف قليل نسبيا عن المنطق الذي يتم ترميز المعلومات الحسية في أنشطة هذه أورنس 21. ومن ثم هناك حاجة تجريبيا قياس المساهمات الفنية لكل اورن اليرقات للسلوك.

ورغم أن درست الشخصية الاستجابة الحسية المورفولوجية اليرقات ORNs مرجع كامل في التفصيل1،4،5، المساهمات المقدمة أورنس الفردية على حلبة حاسة الشم وبالتالي السلوك الملاحية لا تزال مجهولة إلى حد كبير. تنشأ صعوبات في دراسات سلوك اليرقات، حتى الآن، بسبب عدم القدرة على تنشيط مكانياً وزمنياً أورنس واحد. وكان فريق أودورانتس التي تنشط على وجه التحديد 19 21 المورفولوجية اليرقات ORNs مؤخرا وصف1. كل الرائحة في الفريق، في تركيزات منخفضة، يتسبب استجابة فسيولوجية فقط من اورن المشابهة لها. ومع ذلك، يتسبب كل الرائحة في تركيزات أعلى التي تستخدم عادة لفحوصات السلوك التقليدية، الاستجابات الفسيولوجية من عدة أورنس1،،من56. علاوة على ذلك، فقد تنوعت odorants في هذا الفريق التقلبات أن تعقيد التفسير لدراسات السلوك التي تعتمد على تشكيل من رائحة مستقرة التدرجات7،8. أخيرا، وبطبيعة الحال قد تحدث رائحة المحفزات مكون الزمانية التي من الصعب تكرار الظروف المختبرية. ولذلك من المهم وضع طريقة التي يمكن قياس سلوك اليرقات أثناء تنشيط ORNs الفردية في نفس الوقت بطريقة المكانية والزمانية.

هنا، علينا أن نظهر فحوصات أسلوب يحتوي على مزايا أكثر من تعقب اليرقات هو موضح سابقا1،8. والرزن تتبع الموصوفة في جيرشوو et al. تستخدم صمامات التحكم الإلكتروني للمحافظة على تدرج مستقرة من رائحة في الساحة السلوك8. ومع ذلك، نظراً لمستوى الهندسية المعقدة المعنية لبناء برنامج الإعداد التحفيز رائحة، هذا الأسلوب صعبة للنسخ المتماثل في مختبرات أخرى. علاوة على ذلك، لم تحسم المسائل المتصلة باستخدام أودورانتس لتنشيط أورنس واحد على وجه التحديد. مقايسة تتبع الموصوفة في ماثيو et al. يستخدم نظام إيصال رائحة أبسط، ولكن التدرج رائحة الناتجة تعتمد على التقلب في اختبار الرائحة وغير مستقرة لفترات طويلة من الفحص1. وهكذا، باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، لدينا أسلوب مزايا خصوصية ودقة السيطرة الزمنية لتفعيل اورن ولا تعتمد على تشكيل من رائحة التدرجات من مختلف نقاط القوة.

لدينا طريقة سهلة لإعداد والمناسبة للباحثين المهتمين في قياس جوانب الملاحة المورفولوجية اليرقات. هذا الأسلوب يمكن تكييفه للنظم النموذجية الأخرى شريطة أن يكون قادراً على التعبير عن كشريمسون في neuron(s) نظامهم المفضل لاختيار محرك الباحث. كشريمسون صيغة تحول الأحمر من رهودوبسن القناة. يتم تنشيطه عند أطوال موجية التي غير مرئية لنظام فوتوتاكسيس لليرقة. ولذلك نحن قادرة على التلاعب بنشاط الخلايا العصبية مع خصوصية، والموثوقية، وإمكانية تكرار نتائج9. عن طريق تعديل مخصص كتابة البرامج لحساب حجم التغييرات من الموضوعات، هذا الأسلوب يمكن بسهولة تكييف لزحف اليرقات من أنواع الحشرات الأخرى.

Protocol

1-بناء ساحة سلوك وإعداد الأجهزة لتمكين أوبتوجينيتيك في التحفيز على الساحة السلوك

  1. لبناء ساحة سلوك المحرومين من الضوء، إنشاء مربع مع بعدا من 89 × 61 × 66 سم3 (35 "L x 24 بوصة W x 26" ح) مصنوعة من ألواح اﻷكريليك شبكي اللون الأسود (3 مم) (انظر الجدول للمواد). ينبغي أن تكون المواد لبناء مثل مربع المتوفرة في المتاجر المحلية. وضع هذا المربع في أعلى جدول في غرفة السلوك (الشكل 1أ).
  2. جبل كاميرا USB 3.0 CCD أحادية اللون مزودة بمرشح نانومتر طويلة-تمرير 830 الأشعة تحت الحمراء وعدسة F1.4 ج-جبل 8 مم (انظر الجدول للمواد) إلى المركز للحد الأقصى للصندوق الأسود. شرائط مكان اثنين LED الأشعة تحت الحمراء (انظر الجدول للمواد) في أعلى الجدول بغية إلقاء الضوء على اليرقات في الساحة المظلمة (الشكل 1أ).
  3. لبناء منصة الصمام، الحصول على صفيحة ألومنيوم مربع 22 سم × 22 سم (يفضل أن يكون الرش رسمت مع انتهاء من أسود غير لامع للقضاء على أي أفكار). في وسط اللوحة، باستخدام قاطع معدنية، قطع حفرة كبيرة بما يكفي لتناسب حول الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر.
  4. وتغطي اللوحة المعدنية مع أضواء قطاع LED الحمراء (انظر الجدول للمواد). لحام أسلاك قطاع ضوء الصمام في سلسلة وتغذية قطاع الأسلاك إلى ترحيل optocoupler يسيطر عليها المعالج الصغرى 2B Pi التوت (انظر الجدول للمواد) (الشكل 1ب و 2).
  5. تثبيت وتكوين أوبونتو رفيقه/راسبيان جيسي/لينكس على أساس نظام التشغيل على المعالج Pi التوت قبل توصيل ترحيل أوبتوكوبلير إلى الشرائط الصمام. إرفاق إمدادات طاقة السلطة وشرائط LED وأوبتوكوبلير (الشكل 2) (انظر الجدول للمواد). جبل منهاج الصمام حول الكاميرا CCD (الشكل 1ب).
    ملاحظة: نظام التشغيل أوبونتو ماتي v16.04 متاحة بحرية. مجموعة بسيطة بيثون على أساس أوامر يمكن تكييفها بسهولة للبرنامج أنماط المنبهات الخفيفة الصمام (انظر ملف بناء جملة).
  6. ضمان الإشعاع متجانسة في نقاط مختلفة في مجال السلوك. قياس الإشعاع المطلقة على السطح في الساحة بمساعدة مطياف وتحديد أن يكون ~1.3 ث/م2 في جميع أنحاء سطح على الساحة.
    ملاحظة: في هذه الكثافة، كبير لم تلاحظ أي تغييرات في درجة الحرارة خلال التجارب. آخر دراسة10 المستخدمة الإشعاع أعلى من ~1.9 ث/م2 ولاحظ أي تغيير في درجة الحرارة خلال التجارب.

2-إعداد اليرقات المورفولوجية لتحليل السلوك

  1. الحفاظ على الذباب على الطعام يطير القياسية (انظر الجدول للمواد) في 25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 50-60%، ودائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ساعة.
  2. من أجل التعبير عن كشريمسون في زوج واحد من أورنس، عبور الإناث العذراء من خط UAS-الحبس-كشريمسون للذكور من خط أوركس-Gal4 ('X' يناظر واحد من مستقبلات الرائحة اليرقات 21 (أو) الجينات التي يتم التعبير عنها في شكل فريد في كل 21 زوجاً من أورنس)9،11.
    1. بدلاً من ذلك، من أجل التعبير عن كشريمسون في جميع أورنس اليرقات 21، عبر الإناث العذراء من UAS-الحبس-كشريمسون خط للذكور من خط أركو-Gal4 ('أركو' هو مستقبلات المشارك التي يتم التعبير عنها في جميع أورنس 21).
    2. استخدام خط UAS-الحبس-كشريمسون بحد ذاته كعنصر تحكم في هذه التجارب.
      ملاحظة: يطير الأرصدة المذكورة هنا كل ما هو متاح في مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون (انظر الجدول للمواد).
  3. وبمجرد الذباب الذكور والإناث في صليب مسموح لتتزاوج وتضع البيض ح 48، نقل الكبار لقنينة جديدة.
    1. على سطح من القنينة الأغذية المحتوية على البيض، إضافة 400 ميليلتر من خليط يحتوي على السكروز 89 مم المذابة في الماء المقطر وميكرومتر 400 كل-ترانس الشبكية (ATR) الذي حل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
      ملاحظة: كمية صغيرة من السكروز يعزز تغذية اليرقات الحل أية تي آر. ATR مساعد المطلوب أوبريجولاتينج كشريمسون التعبير9،10. ATR حساسة للضوء.
    2. حالما تتم إضافة أية تي آر للقنينات الأغذية المحتوية على البيض، احتضان القنينات في الظلام ح 72 إضافية.
      ملاحظة: في حين لا لاحظت هذه الدراسة والدراسات اثنين أعلاه آثار على سلوك اليرقات بسبب التغذية ATR، ينصح السيطرة لآثار تغذية ATR بإخضاع بنود الاختبار لنفس المقدار من الخليط أعلاه التي لا تحتوي على أية تي آر.
  4. استخراج يرقات الطور الثالث (~ 120 ح بعد وضع البيض) من سطح الغذاء يطير العائمة لهم باستخدام حل سكروز عالية كثافة (15%). استخدام P1000 ميكروبيبيتي فصل اليرقات تطفو على سطح محلول السكروز في كوب زجاج 1000 مل.
  5. أغسل اليرقات 3 – 4 مرات خلال تبادل 800 مل ماء مقطر الطازجة في كوب الزجاج في كل مرة. تسمح اليرقات الراحة لمدة 10 دقائق قبل إخضاعها لتحليل السلوك.

3-السلوك بالانزيم

  1. الحفاظ على درجة الحرارة متسقة (بين 22-25 درجة مئوية) والرطوبة (بين 50 و 60% رطوبة نسبية) في الغرفة السلوك.
  2. إعداد متوسطة زحف اليرقات بصب 150 مل من ذاب [اغروس] (1.5 ٪) في ساحة 22 × 22 سم طبق بيتري. سكب طبق بيتري واحد لكل محاكمة للمقايسة، 8-10 تجارب كل تجربة. يسمح [اغروس] إلى ترسيخ وبارد ح 1 – 2 في أطباق بتري قبل استخدامها في تحليل السلوك.
    1. نقل أي أكثر من 20 يرقات الطور الثالث بريبيد إلى مركز طبق بتري (الشكل 1ج). تغطية صحن بيتري مع غطاء لها. ضع طبق بيتري في الساحة السلوك تحت الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر.
      ملاحظة: اعتماداً على التجربة، فحوصات السلوك عادة ما تنفذ لمدة 3 – 5 دقائق. إذا الرائحة يستخدم في المقايسة لتوفير إشارات التوجيه، قد لوحظ أن التدرج رائحة الناتجة عن ذلك لا تزال مستقرة ل مدة 5 دقائق تقريبا1. لا ينصح بوقت أطول للمقايسة. لا لوحظت آثار ضارة على اليرقات بسبب الجفاف أو التعرض المطول 630 نيوتن متر الضوء الأحمر داخل هذه النقاط الزمنية.
  3. بدوره على 850 الأشعة تحت الحمراء نانومتر الصمام مصدر الضوء لتصور اليرقات في شريط الفيديو. بدء تشغيل الكاميرا CCD لتسجيل حركة اليرقات.
  4. باستخدام البرمجيات المرتبطة بالمعالج Pi التوت، البرنامج الداخلي لإدارة الأنماط الملائمة لتحفيز الضوء الأحمر.
    ملاحظة: مجموعة بسيطة بيثون على أساس أوامر يمكن تكييفها بسهولة ببرنامج أنماط المنبهات الخفيفة الصمام (انظر ملف بناء جملة).

4-تجهيز البيانات وتحليلها

  1. استيراد الفيديو المسجلة لكل محاكمة في أي برنامج البرمجة المتاحة مثل Matlab.
  2. الحصول على إحداثيات س وص لكل يرقة في فيلم كدالة للزمن. استناداً إلى حدود تتبع البرمجيات، يمكن تعقب يرقات الطور الثالث 15 – 20 في1،فيلم واحد8.
    ملاحظة: يتم توفير مجموعة من رموز Matlab بسيطة ('تراكلارفا') التي يمكن تكييفها بسهولة لتناسب الظروف المناسبة (انظر ملف بناء جملة). هذا البرنامج يجمع بين جميع المحاكمات في تجربة ونواتج إحداثيات س وص كل يرقة لكامل مدة المقايسة (انظر بناء الجملة في التعليمات البرمجية أدناه). بشكل بديل، يمكن للمرء استخدام العديد من البرامج المستندة إلى المصدر المفتوح التي متاحة بحرية للباحثين. مثل 12من الجعبة (http://jaaba.sourceforge.net/).
  3. استخدام إحداثيات س وص يتم إنشاؤه لرسم مسارات اليرقات وكذلك تحليل تنقل اليرقات.
    1. لتحليل السلوك، استخدام إحصائيات الملاحية مثل السرعة، انحناء المسار، وعنوان زاوية، لتقسيم المسارات الفردية اليرقات إلى متواليات من يدير ويتحول بالتناوب.
    2. يتم تعريف يعمل كفترات مستمرة للتحرك إلى الأمام. يتحول منفصلة تدير المتعاقبة. يتم وضع علامة على تحول عندما تم إدخال تغييرات على مسار اتجاه زوايا > 45° (انظر ملف بناء جملة).
  4. حساب متوسط القيم لسرعة التشغيل، وتشغيل طول واتجاه التشغيل ومعلمات أخرى كما هو مطلوب.
    ملاحظة: يتم توفير مجموعة من بناء جملة بسيطة لاستخراج 'تشغيل' و 'إيقاف' من مسارات اليرقات (انظر ملف بناء جملة). بسيطة Matlab أو Excel استناداً إلى مهام يمكن تطبيقها على البيانات المستخرجة حساب القيم 'سرعة التشغيل'، 'تشغيل طول' إلخ.
  5. وتمثل البيانات لكل مقياس السلوكية كما يعني ± sem.

النتائج

وللتدليل على الطابع الخاص لتفعيل اورن، لدينا أسلوب كان تطبيقها بنجاح على تحديد الأثر المترتب على اثنين اورن المختلفة (ORN::7a & ORN::42a) التنشيط (ORNs معربا عن Or7a أو Or42a) في سلوك اليرقات (الشكل 3). يتسق مع دراسات حديثة هذا الفرد ORNs اليرقات هي متميزة وظيفيا1

Discussion

هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح لقياس سلوك اليرقات المورفولوجية استجابة للتنشيط أوبتوجينيتيك المتزامنة من الخلايا العصبية حاسة الشم. سبق وصف اليرقات تتبع أساليب1،8 استخدام تكنولوجيا التسليم رائحة مختلفة لتنشيط أورنس. ومع ذلك، يتعذر التحكم هذه الأساليب لخ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل بأموال بدء التشغيل من جامعة نيفادا، رينو، والتي نيجمس من "المعهد الوطني للصحة" تحت رقم المنحة P20 GM103650.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera Edmund Optics106215
M52 to M55 Filter Thread AdapterEdmund Optics59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass FilterEdmund Optics46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supplynewegg.com9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relayamazon.com6454319
630nm Quad-row LED strip lightsenvironmentallights.comred3528-450-reel
850nm LED stripsenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylicHome DepotMC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly foodGenesee Scientific66-112
Agarose powderGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm square petri-dishVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SucroseSigma-Aldrich84097
All trans-retinalSigma-AldrichR2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

References

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved