JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

Abstract

היכולת של חרקים כדי לנווט כלפי מקורות ריח מבוסס על הפעילות של הנוירונים שלהם קולטני ריח מסדר ראשון (ORNs). בעוד כמות ניכרת של מידע נוצרה בנוגע ולהתמכר התגובות odorants, תפקיד ספציפי ORNs נהיגה תגובות התנהגותיות נשאר ממעטים להבין. להתעורר סיבוכים בניתוח התנהגות עקב volatilities שונים של odorants להפעיל ORNs בודדים, ORNs מרובים מופעל על ידי יחיד odorants, ואת הקושי באופן טבעי שנצפה טמפורלית בווריאציות גירויים חוש הריח באמצעות שכפול שיטות קונבנציונאלי ריח-מסירה במעבדה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מנתח התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של ORNs שלה. הטכנולוגיה optogenetic המשמש כאן מאפשר ירידה לפרטים של הפעלת ולהתמכר שליטה מדויקת של דפוסי הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר. תנועת הזחל המתאימה מתבצע מעקב אחר רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות כתב תוכנה מותאמת אישית. על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת יותר של הפעלת ולהתמכר בודדים ללימוד השפעתה על התנהגות זחל. השיטה שלנו יכול ניתן להרחיב הלאה לחקור את ההשפעה של נוירונים מסדר שני הקרנה (מערכת העצבים ההיקפית) כמו גם המקומי נוירונים (ההגירה) על התנהגות זחל. שיטה זו ובכך יאפשר ניתוח מקיף של פונקציה מעגל חוש הריח, המשלים מחקרים על פעילויות נוירון איך הריח לתרגם להתנהגות תגובות.

Introduction

חוש הריח מידע בסביבה של זחל דרוזופילה הוא חש מאת רק 21 ORNs נפרדים פונקציונלית, הפעילויות אשר בסופו של דבר לקבוע את התנהגות זחל1,2,3,4. ובכל זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על ההיגיון שלפיו מקודד מידע חושי בפעילויות של אלה ORNs 21. לכן יש צורך למדוד השפעול תרומות פונקציונלי של כל ולהתמכר זחל להתנהגות.

למרות הפרופיל תגובה חושית של רפרטואר שלם של ORNs הזחל דרוזופילה נחקרה פרט1,4,5, התרומות של בודדים ORNs המעגל חוש הריח, ובכך התנהגות ניווט נשאר ברובו לא ידוע. קשיים במחקרים התנהגות זחל, עולות עד כה, עקב חוסר יכולת להפעיל במרחב של חנותם ORNs יחיד. פאנל של odorants במיוחד להפעיל 19 של דרוזופילה 21 הזחל ORNs היה תיאר לאחרונה1. כל odorant בחלונית ', בריכוזים נמוכים, מעורר תגובה פיזיולוגית בלבד ולהתמכר cognate שלה. עם זאת, בריכוזים גבוהים המשמשים בדרך כלל עבור מבחני התנהגות המקובלת, כל odorant מעורר תגובות פיזיולוגיות מרובים ORNs1,5,6. עוד יותר, odorants בחלונית זו יש מגוון volatilities זה יסבך את הפרשנות של לימודי התנהגות תלויים היווצרות ריח יציב מעברי צבע7,8. לבסוף, באופן טבעי המתרחשים גירויים ריח יש רכיב טמפורלית שקשה לשחזר בתנאי מעבדה. לכן חשוב לפתח שיטה שיכול למדוד התנהגות זחל כאשר בו זמנית הפעלתי ORNs בודדים באופן מרחבי טמפורלית.

. הנה, נדגים שיטה בעלת יתרונות על פני מעקב זחל שתואר לעיל מבחני1,8. וזמינותו מעקב המתוארים Gershow. et al. משתמש שסתומים מבוקר אלקטרונית כדי לשמור על מעבר צבע יציב של ריח ארנה התנהגות8. עם זאת, בשל רמת מעורב לבנות הגדרת גירוי ריח מורכבים הנדסה, שיטה זו קשה לשכפל במעבדות אחרות. יתרה מזאת, הנושאים הקשורים לשימוש odorants להפעלת במיוחד ORNs יחיד נותרו בלתי פתורות. וזמינותו מעקב שמתואר מתיו. ואח משתמש במערכת המסירה ריח פשוט יותר, אך מעבר הצבע ריח וכתוצאה מכך תלויה התנודתיות של מבחן odorant יציב עבור משך זמן של assay1. לפיכך, על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, השיטה שלנו יש את היתרונות של ירידה לפרטים, שליטה מדויקת הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר ואינה תלויה היווצרות ריח מעברי צבע בעלי חוזק שונה.

השיטה שלנו היא קל להגדיר, והוא מתאים מהחוקרים המעוניינים מדידה היבטים של ניווט זחל דרוזופילה . טכניקה זו יכולה להתאים למערכות אחרות דגם ובלבד החוקר הוא מסוגל לנהוג הביטוי של CsChrimson ב neuron(s) של המערכת האהוב שלהם להתמקד. CsChrimson היא גרסה אדום-העביר של אופסין # רודופסין ערוץ. . זה הופעל באורכי גל כי הם בלתי נראים למערכת phototaxis של הזחל . אנחנו ולכן יכולים לתמרן את פעילות הנוירונים עם ירידה לפרטים, אמינות וצריכת הפארמצבטית9... על-ידי שינוי המנהג לכתוב תוכנה לקחת בחשבון שינויים בגודל של הנושאים, שיטה זו יכול בקלות להיות מותאם עבור הזחלים סריקה של מינים חרקים אחרים.

Protocol

1. בנייה של ארנה התנהגות והכנת חומרה כדי לאפשר Optogenetic גירוי בזירה התנהגות

  1. כדי לבנות של ארנה התנהגות הפרעות-אור, לבנות תיבה עם ממד של 89 x 61 x 66 ס מ3 (35" L x 24" W x 26" H) עשוי פלקסיגלס בצבע שחור גליונות אקרילי (בעובי 3 מ מ) (ראה טבלה של חומרים). חומרים כדי לבנות תיבה כזו צריכה להיות זמינה בחנויות חומרה מקומיים. מקם תיבה זו על גבי שולחן בחדר התנהגות (איור 1א').
  2. מאונט מצלמה USB 3.0 CCD בשחור-לבן מצויד של IR לונג-830 ננומטר מסנן של העדשה F1.4 C-mount של 8 מ מ (ראה טבלה של חומרים) ממרכז התקרה של הקופסה השחורה. המקום LED אינפרא אדום שתי רצועות (ראה טבלה של חומרים) על השולחן-על מנת להאיר את הזחלים בזירה כהה (איור 1א').
  3. כדי לבנות את פלטפורמת LED, להשיג 22 ס"מ × 22 ס"מ מרובע אלומיניום צלחת (עדיף בספריי עם גימור שחור מט לחסל כל השתקפויות). במרכז הצלחת, שימוש בחותך מתכת, לחתוך חור גדול מספיק כדי להתאים סביב מצלמת CCD.
  4. מכסים את לוחית המתכת עם אדום נורות LED (ראה טבלה של חומרים). הלחמה חוטים רצועת אור LED בסדרה ולהאכיל את החוטים רצועת לתוך ממסר optocoupler נשלט על ידי מיקרו מעבד 2B פאי פטל (ראה טבלה של חומרים) (איור 1B ו- 2).
  5. להתקין ולקבוע את תצורת מערכת ההפעלה אובונטו חבר/Raspian ג'סי \ לינוקס מבוסס על מעבד פאי פטל לפני התחברות השליחים optocoupler רצועות LED. לצרף ספק כוח לשלטון את רצועות LED, את optocoupler (איור 2) (ראה טבלה של חומרים). הר פלטפורמת LED מסביב למצלמה CCD (איור 1B).
    הערה: מערכת ההפעלה אובונטו חבר v16.04 זמינה בחופשיות. קבוצת פקודות פיתון מבוסס פשוטות ניתן בקלות להתאים לתבניות תוכנית של גירויים אור LED (ראה קובץ של תחביר).
  6. ודא irradiance הומוגנית בנקודות שונות בזירה התנהגות. למדוד את irradiance מוחלט על פני השטח של הזירה בעזרת ספקטרומטר וקבע שזה יהיה ~1.3 W/m2 לאורך כל השטח של הזירה.
    הערה: בעוצמה זו, ללא שינויים משמעותיים נצפו הטמפרטורה במהלך הניסויים. המחקר עוד10 בקרינה גבוהה יותר של ~1.9 W/m2 והוא ציין אין שינויי טמפרטורה במהלך הניסויים.

2. הכנה של הזחלים דרוזופילה ניתוח התנהגות

  1. לשמור על הזבובים על תקן מזון לעוף (ראה טבלה של חומרים) 25 ° C, 50-60% לחות יחסית, ואת מחזור/כהה 12 h/12 שעות.
  2. על מנת להביע את CsChrimson עם זוג יחיד ORNs, לחצות נקבות בתולה משורת UAS-עירויים-CsChrimson זכרים מ קו OrX-Gal4 ('X' מקביל אחד של קולטן ריח זחל 21 (או) הגנים באים לידי ביטוי באופן ייחודי בכל אחד 21 זוגות של ORNs)9,11.
    1. . לסירוגין, כדי להביע את CsChrimson של כל ORNs הזחל 21, צלב נקבות בתולה מן UAS-עירויים-CsChrimson קו זכרים מ קו Orco-Gal4 ('Orco' הוא הקולטן שיתוף מתבטאת כל ORNs 21).
    2. להשתמש UAS-עירויים-CsChrimson קו בפני עצמו כפקד בניסויים אלה.
      הערה: המניות לטוס המפורטים להלן הינם כולם זמינים במרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (ראה טבלה של חומרים).
  3. ברגע זבובים זכרים ונקבות צלב מותרים להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העברה מבוגרים בקבוקון טריים.
    1. אל פני השטח של הבקבוקון מזון המכילים ביצים, להוסיף µL 400 של תערובת המכילה 400 מיקרומטר כל טרנס רשתית (ATR) מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) וסוכרוז 89 מ מ מומס במים מזוקקים.
      הערה: כמות קטנה של סוכרוז מקדם האכלה זחל של הפתרון ATR. ATR היא קופקטור הדרושים עבור upregulating קולטני CsChrimson ביטוי9,10. ATR הוא רגיש אור.
    2. ברגע ATR מתווסף הבקבוקונים מזון המכילים ביצים, דגירה הבקבוקונים בחושך h 72 נוספים.
      הערה: כאשר מחקר זה ומחקרים שני הנ ל יש לא נצפו השפעות על התנהגות זחל עקב ATR האכלה, היא מומלצת שליטה על ההשפעות של ATR האכלה במינים בדיקת קווים על אותה כמות של התערובת הנ ל שאינו מכיל ATR.
  4. לחלץ הזחלים השלישי-לחלל (h ~ 120 אחרי הנחת הביצה) מפני השטח של אוכל לעוף על-ידי צף אותם באמצעות פתרון סוכרוז צפיפות גבוהה (15%). שימוש של P1000 micropipette להפריד את הזחלים צף על פני השטח של הפתרון סוכרוז לתוך גביע זכוכית 1000 מ.
  5. לשטוף את הזחלים 3 – 4 פעמים על ידי החלפת טריים 800 מ ל מים מזוקקים במיכל זכוכית בכל פעם. לאפשר הזחלים לנוח 10 דקות לפני העמדת אותם וזמינותו התנהגות.

3. התנהגות Assay

  1. לשמור על טמפרטורה עקבית (בין 22 – 25 ° C) ולחות (בין 50 ל 60% RH) בחדר התנהגות.
  2. הכן זחל בינוני סריקה על ידי שפיכת 150 מ ל agarose נמס (1.5%) למרובע 22 ס"מ, 22 ס"מ פטרי. צלחת פטרי אחת ויוצקים על כל ניסיון של וזמינותו, 8-10 ניסויים לכל ניסוי. לאפשר agarose לחזק להתקרר למשך 1-2 ש ח בחודש צלחות פטרי לפני השימוש בהם התנהגות וזמינותו.
    1. העברה לא יותר מ 20 הזחל השלישית-לחלל שומר. על פרופיל מרכז של פטרי (איור 1C). מכסים את צלחת פטרי עם המכסה. הצב הפטרי בזירה התנהגות תחת מצלמת CCD.
      הערה: בהתאם הניסוי, מבחני התנהגות בדרך כלל מתבצעות למשך 3-5 דקות. אם odorant משמש וזמינותו לספק הדרכה רמזים, זה נצפתה כי מעבר הצבע ריח וכתוצאה מכך נשאר יציב במשך כ 5 דקות1. עוד פעמים assay אינם מומלצים. לא נצפו השפעות מזיקות על הזחלים עקב התייבשות או מחשיפה ממושכת 630 ננומטר האורות האדומים בתוך נקודות זמן אלה.
  3. להפוך ON 850 ננומטר אינפרא אדום מקור אור LED להמחיש הזחלים וידאו. הפעל את מצלמת CCD להקליט תנועת הזחל.
  4. באמצעות התוכנה המשויכים המעבד פאי פטל, תוכנית ההליך לניהול תבניות המתאימות של גירוי אור אדום.
    הערה: קבוצת פקודות פיתון מבוסס פשוטות ניתן בקלות להתאים לתבניות תוכנית של גירויים אור LED (ראה קובץ של תחביר).

4. עיבוד נתונים וניתוח

  1. לייבא את הווידאו המוקלט בכל ניסוי כל תוכנה תכנות זמינים כמו Matlab.
  2. לקבל קואורדינטות XY של כל זחל בסרט כפונקציה של הזמן. בהתבסס על הגבולות של תוכנת מעקב, 15-20 ג'-לחלל הזחלים ניתן לעקוב ב1,יברמה8.
    הערה: מערכת פשוטה קודים Matlab ('Tracklarva') כי ניתן להתאים בקלות בהתאם לתנאים המתאימים (ראה קובץ של תחביר) מסופק. תוכנית זו משלבת את כל המבחנים בניסוי והתפוקות של קואורדינטות XY של זחל בכל משך כל זמן וזמינותו (ראה לתחביר קוד להלן). לסירוגין, אחד יכול להשתמש במספר תוכניות מבוססות קוד פתוח זמינים לכול לחוקרים. למשל JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. השתמש את קואורדינטות XY שנוצר כדי להתוות מסלולים זחל נוספת לנתח ומכניקה זחל.
    1. ניתוח התנהגות, להשתמש הסטטיסטיקה ניווט כגון מהירות, עקמומיות נתיב, זווית כותרת, כדי לחלק מסלולים זחל בודדים לתוך לסירוגין רצפים של פועל, והופך.
    2. מסלולים מוגדרים תקופות מתמשך של תנועה קדימה. תורים נפרדים עוקבות. מסתבר מסומנות בדגל כאשר שינויים מסלול כיוון זוויות היו > 45 מעלות (ראה קובץ של תחביר).
  4. חישוב ממוצע הערכים עבור מהירות ריצה, ריצה באורך, כיוון הריצה ופרמטרים אחרים כנדרש.
    הערה: ערכה של תחביר פשוט לחלץ 'פועל' ואת 'עוצר' מ מסלולים זחל מסופק (ראה קובץ של תחביר). פשוט Matlab או Excel פונקציות בסיס ניתן ליישם את הנתונים שחולצו להפעלת לחשב ערכים עבור 'מהירות ריצה', ' אורך ' ועוד.
  5. לייצג את הנתונים עבור כל מדד התנהגותית אומר ± ב- SEM...

תוצאות

כדי להדגים יחודיות של הפעלת ולהתמכר, השיטה שלנו הוחלה בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של שני ולהתמכר שונים (ORN::7a & ORN::42a) הפעלה (ORNs או Or7a או Or42a) על התנהגות זחל (איור 3). בקנה אחד עם מחקרים שנעשו לאחרונה אדם הזה ORNs הזחל הם נפרדים פונקציונלית1,

Discussion

כאן, אנחנו תיאר שיטה המאפשרת לשקילת דרוזופילה התנהגות זחל בתגובה optogenetic בו זמנית ההפעלה של נוירונים חוש הריח. שתואר קודם לכן זחל מעקב אחר שיטות1,8 להשתמש בטכנולוגיה משלוח ריח שונה כדי להפעיל את ORNs. עם זאת, שיטות אלה לא יכולים לשלוט על ירידה לפרטים או דפוס?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי אתחול בכספי האוניברסיטה של נבאדה, רינו ועל ידי NIGMS של המכון הלאומי לבריאות תחת גרנט מספר P20 GM103650.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera Edmund Optics106215
M52 to M55 Filter Thread AdapterEdmund Optics59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass FilterEdmund Optics46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supplynewegg.com9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relayamazon.com6454319
630nm Quad-row LED strip lightsenvironmentallights.comred3528-450-reel
850nm LED stripsenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylicHome DepotMC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly foodGenesee Scientific66-112
Agarose powderGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm square petri-dishVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SucroseSigma-Aldrich84097
All trans-retinalSigma-AldrichR2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

References

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133Optogenetics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved