JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Abstract

La capacità degli insetti di navigare verso le fonti di odore si basa sulle attività del loro primo ordine neuroni olfattivi (ORNs). Mentre una notevole quantità di informazioni è stata generata per quanto riguarda ORN risposte a odoranti, il ruolo di specifici ORNs in risposte comportamentali di guida rimane capito male. Complicanze nelle analisi di comportamento derivano a causa della diversa volatilità di odorizzazione che attivano ORNs singole, multiple ORNs attivato dal singolo odoranti e la difficoltà nella replica naturalmente osservate variazioni temporali in stimoli olfattivi utilizzando metodi convenzionali odore-consegna in laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo che analizza il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica di sua ORNs. La tecnologia optogenetica qui permette per la specificità di attivazione ORN e un controllo preciso del pattern temporale di attivazione ORN. Corrispondente movimento larvale viene tenuta traccia, digitalmente registrati e analizzati utilizzando scritta software personalizzata. Sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, questo metodo consente un controllo più preciso di attivazione ORN individuale al fine di studiare il suo impatto sul comportamento larvale. Il nostro metodo potrebbe essere esteso a studiare l'impatto dei neuroni di proiezione di secondo ordine (PNs) così come i neuroni locali (LNs) sul comportamento larvale. Questo metodo permetterà dunque una dissezione completa della funzione olfattiva circuito e complemento studi sulle attività del neurone olfattivo come traducono risposte di comportamento.

Introduzione

Informazioni olfattive in ambiente di una larva di Drosophila sono percepite dal solo 21 ORNs funzionalmente distinte, le attività di cui in definitiva determinare comportamento larvale1,2,3,4. Ancora, relativamente piccolo è conosciuto circa la logica con cui informazioni sensoriali sono codificate nelle attività di questi 21 ORNs. C'è quindi la necessità di misurare sperimentalmente i contributi funzionali di ogni ORN larvale di comportamento.

Anche se il profilo di risposta sensoriale di tutto il repertorio di Drosophila larvale ORNs è stato studiato in dettaglio1,4,5, i contributi dei singoli ORNs al circuito olfattivo e quindi a comportamento di navigazione rimangono in gran parte sconosciuti. Difficoltà negli studi di comportamento larvale, finora, a causa dell'incapacità spazialmente e temporalmente attivare singole ORNs. Un pannello di odorizzazione che specificamente attivare 19 del 21 ORNs larvale di Drosophila è stata recentemente descritta1. Ogni odorant nel pannello, a basse concentrazioni, suscita una risposta fisiologica solo da sue cognate ORN. Tuttavia, a concentrazioni più elevate che sono normalmente utilizzati per le analisi di comportamento convenzionale, ogni odorant suscita risposte fisiologiche da più ORNs1,5,6. Ulteriormente, odoranti in questo pannello hanno variato le volatilità che complicano l'interpretazione degli studi di comportamento che dipendono dalla formazione di odore stabile pendenze7,8. Infine, gli stimoli d'avvenimento di odore hanno naturalmente un componente temporale che è difficile da replicare in condizioni di laboratorio. Pertanto è importante sviluppare un metodo che può misurare il comportamento larvale durante l'attivazione simultanea di ORNs individuali in modo spaziale e temporale.

Qui, dimostriamo che un metodo che presenta i vantaggi sopra precedentemente descritto rilevamento larvale dosaggi1,8. L'analisi di rilevamento descritto in Gershow et al. utilizza valvole controllate elettronicamente per mantenere un gradiente stabile di odore nel comportamento arena8. Tuttavia, a causa del livello di ingegneria complesso coinvolto costruire il setup di stimolo di odore, questo metodo è difficile da replicare in altri laboratori. Ulteriormente, i problemi relazionati all'utilizzo odoranti specificamente attivare singole ORNs rimangono irrisolti. L'analisi di rilevamento descritto in Mathew et al. utilizza un sistema di consegna di odore più semplice, ma la pendenza risultante di odore è dipenda dalla volatilità dei test odorant ed è instabile per lunghi periodi di analisi1. Così, sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, il nostro metodo ha i vantaggi della specificità e preciso controllo temporale di attivazione ORN e non è dipendente da formazione di gradienti di odore di diversi punti di forza.

Il nostro metodo è facile da configurare ed è adatto per i ricercatori interessati a misurare gli aspetti della navigazione larvale della drosofila . Questa tecnica potrebbe essere adattata ad altri sistemi di modello purché il ricercatore è in grado di guidare l'espressione di CsChrimson in neuron(s) del loro sistema preferito di scelta. CsChrimson è una versione del rhodopsin canale rosso-spostato. Si attiva a lunghezze d'onda che è invisibili al sistema fototassi di larva. Siamo quindi in grado di manipolare l'attività dei neuroni con specificità, affidabilità e riproducibilità9. Modificando l'usanza scritto software per tenere conto di modifiche delle dimensioni degli oggetti, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la ricerca per indicizzazione larve di altre specie di insetti.

Protocollo

1. costruire un Arena di comportamento e preparazione Hardware per abilitare optogenetica stimolazione in ambito di comportamento

  1. Per costruire un arena di comportamento luce-sfavoriti, costruire una scatola con una dimensione di 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) fatta di lastre acriliche in plexiglass colorato nero (3 mm di spessore) (Vedi Tabella materiali). Materiali per costruire tale scatola dovrebbero essere disponibile presso negozi di ferramenta locale. Posizionare la scatola su un tavolo nella sala comportamento (Figura 1A).
  2. Montare una telecamera monocromatica USB 3.0 CCD dotata di un filtro di IR lungo-passa 830 nm e una lente f 1.4 C-mount di 8 mm (Vedi Tabella materiali) al centro del soffitto della scatola nera. Posto due infrarossi LED strisce (Vedi Tabella materiali) sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena scuro (Figura 1A).
  3. Per creare la piattaforma di LED, ottenere una lastra di alluminio quadrata 22 cm × 22 cm (preferibilmente spruzzo verniciato con una finitura nera opaca per eliminare eventuali riflessi). Al centro del piatto, utilizzando un coltello di metallo, tagliare un buco abbastanza grande per adattarsi intorno la telecamera CCD.
  4. Coprire la piastra metallica con luci di striscia di LED rosso (Vedi Tabella materiali). Saldare fili di luce di striscia di LED in serie e passare i cavi di striscia in un fotoaccoppiatore relè controllato da un microprocessore di 2B Raspberry Pi (Vedi Tabella materiali) (Figura 1B e 2).
  5. Installare e configurare il sistema operativo Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basato sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè opto per le strisce di LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce di LED e l'optoisolatore (Figura 2) (Vedi Tabella materiali). Montare la piattaforma LED intorno alla telecamera CCD (Figura 1B).
    Nota: Ubuntu Mate v16.04 sistema operativo è liberamente disponibile. Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).
  6. Garantire irraggiamento omogeneo nei vari punti all'arena di comportamento. Misurare l'irradianza assoluta presso la superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinare che sia ~1.3 W/m2 su tutta la superficie dell'arena.
    Nota: A questa intensità, senza i cambiamenti significativi sono stati osservati di temperatura nel corso degli esperimenti. Un altro studio10 utilizzato un maggiore irraggiamento di ~1.9 W/m2 e non osservato nessun cambiamento nella temperatura nel corso degli esperimenti.

2. preparazione di larve di Drosophila per analisi di comportamento

  1. Mantenere le mosche sul cibo vola standard (Vedi Tabella materiali) a 25 ° C, 50-60% RH e un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.
  2. Al fine di esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORNs, attraversare le femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson ai maschi da una linea di OrX-Gal4 ('X' corrisponde a uno dei 21 del ricevitore di odore larvale (o) geni che sono espressi in modo univoco in ogni 21 paia di ORNs)9,11.
    1. In alternativa, per esprimere CsChrimson in tutti i 21 ORNs larvale, attraversare le femmine vergini da un UAS-IVS-CsChrimson linea ai maschi da una linea di Orco-Gal4 ('Orco' è il co-recettore che si esprime in tutti i 21 ORNs).
    2. Utilizzare UAS-IVS-CsChrimson linea di per sé come un controllo in questi esperimenti.
      Nota: Le scorte volare qui elencate sono tutti disponibili presso il centro di Stock di Drosophila Bloomington (Vedi Tabella materiali).
  3. Una volta mosche maschii e femminili in una croce sono ammessi per accoppiarsi e deporre le uova per 48 h, trasferire gli adulti ad un flacone di fresco.
    1. Alla superficie del flaconcino cibo contenente le uova, aggiungere 400 µ l di una miscela contenente 400 µM all-trans retinico (ATR) dissolto in dimetilsolfossido (DMSO) e saccarosio 89mm disciolto in acqua distillata.
      Nota: La piccola quantità di saccarosio promuove alimentazione larvale della soluzione ATR. ATR è un cofattore necessario per aumentare di CsChrimson espressione9,10. ATR è sensibile alla luce.
    2. Una volta ATR è aggiunto le fiale di alimenti contenenti uova, incubare i flaconi al buio per 72 h.
      Nota: Mentre questo studio e sopra due studi non hanno osservato gli effetti sul comportamento larvale dovuta ATR alimentazione, si consiglia di controllare per gli effetti dell'ATR alimentazione sottoponendo le linee di test per la stessa quantità di miscela di cui sopra che non contengono ATR.
  4. Estrarre le larve di terza-instar (~ 120 h dopo la deposizione delle uova) dalla superficie dell'alimento facendo galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio ad alta densità (15%). Utilizzando un P1000 micropipetta separare le larve galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1000 mL.
  5. Lavare le larve 3 – 4 volte scambiando 800 mL di acqua distillata di fresco in bicchiere di vetro ogni volta. Consentire le larve di riposare per 10 min prima di sottoporli a test comportamento.

3. comportamento saggio

  1. Mantenere costante la temperatura (tra 22 – 25 ° C) e umidità (tra 50 e 60% RH) nel comportamento locale.
  2. Preparare larvale supporto strisciante di versare 150 mL di agarosio fuso (1,5%) in un quadrato di 22 x 22 cm di Petri. Una capsula di Petri è versato per ogni prova del test, prove di 8 – 10 per esperimento. Consentire l'agarosio solidificare e raffreddare per 1 – 2 h nei piatti Petri prima del loro utilizzo nell'analisi di comportamento.
    1. Trasferire non più di 20 delle larve di terza-instar preparate per il centro di Petri piatto (Figura 1C). Coprire il piatto di Petri con il suo coperchio. Posizionare la piastra di Petri nell'arena comportamento sotto la telecamera CCD.
      Nota: A seconda dell'esperimento, comportamento analisi vengono effettuate in genere per 3 – 5 min. Se un odorant viene utilizzato nell'analisi per fornire spunti di orientamento, è stato osservato che la pendenza risultante di odore rimane stabile per circa 5 min1. Tempi più lunghi di dosaggio non sono raccomandati. Non sono stati osservati effetti deleteri sulle larve a causa di disidratazione o da una prolungata esposizione di luce rossa 630 nm all'interno di questi intervalli di tempo.
  3. Girare ON the 850 nm infrarossi sorgente luminosa LED per visualizzare le larve nel video. Avviare la fotocamera CCD per registrare il movimento larvale.
  4. Utilizzando il software associato al processore di Raspberry Pi, programma la procedura per l'amministrazione di modelli appropriati di stimolazione di luce rossa.
    Nota: Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).

4. elaborazione dei dati e analisi

  1. Importare i video registrati di ogni prova in qualsiasi software di programmazione disponibile come Matlab.
  2. Ottenere le coordinate XY di ogni larva in un film come funzione del tempo. Basato su limiti del software di monitoraggio, 15 – 20 terza-instar larve possono essere monitorate in un unico filmato1,8.
    Nota: Viene fornito un set di semplici codici Matlab ('Tracklarva') che può essere facilmente adattato per soddisfare le condizioni appropriate (vedere file di sintassi). Questo programma combina tutte le prove in un esperimento e uscite le coordinate XY di ogni larva per tutta la durata del test (Vedi la sintassi del codice qui sotto). In alternativa, uno può usare diversi programmi basati su open source che sono liberamente disponibili per i ricercatori. Ad es. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Utilizzare le coordinate XY generate per tracciare traiettorie larvale e analizzare ulteriormente locomozione larvale.
    1. Per analisi di comportamento, è possibile utilizzare le statistiche navigazione quali velocità, percorso della curvatura, angolo di intestazione, per segmentare individuali larvale traiettorie in alternando sequenze di piste e si trasforma.
    2. Funzionamenti sono definiti come periodi continui di movimento in avanti. Turni separano esecuzioni successive. Giri vengono contrassegnati quando cambiamenti agli angoli di orientamento traiettoria erano > 45° (vedere file di sintassi).
  4. Calcolare i valori medi di velocità di esecuzione, esecuzione lunghezza, direzione e altri parametri come richiesto.
    Nota: Viene fornito un set di sintassi semplice per estrarre 'corre' e 'si ferma' da larvale traiettorie (vedere file di sintassi). Semplice Matlab o Excel funzioni base possono essere applicate ai dati estratti per calcolare valori per 'velocità', 'Esegui lunghezza' ecc.
  5. Rappresentare i dati per ogni metrica comportamentale come media ± SEM

Risultati

Per illustrare la specificità di attivazione ORN, il nostro metodo è stato applicato con successo per determinare l'impatto di due differenti ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs che esprimono Or7a o Or42a) attivazione sul comportamento larvale (Figura 3). Coerente con gli studi recenti di quell'individuo ORNs larvale sono funzionalmente distinte1,10,13, nostri dati rapp...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un metodo che consente la misurazione di Drosophila comportamento larvale in risposta all'attivazione di optogenetica simultanea dei neuroni olfattivi. Precedentemente descritto larvale metodi1,di rilevamento8 utilizzano la tecnologia di consegna di odore diverso per attivare ORNs. Tuttavia, questi metodi non possono controllare per la specificità o un pattern temporale di attivazione ORN. Il nostro metodo supera questi deficit ut...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio dall'Università del Nevada, Reno e da NIGMS del National Institute of Health, sotto concessione numero P20 GM103650.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera Edmund Optics106215
M52 to M55 Filter Thread AdapterEdmund Optics59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass FilterEdmund Optics46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supplynewegg.com9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relayamazon.com6454319
630nm Quad-row LED strip lightsenvironmentallights.comred3528-450-reel
850nm LED stripsenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylicHome DepotMC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly foodGenesee Scientific66-112
Agarose powderGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm square petri-dishVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SucroseSigma-Aldrich84097
All trans-retinalSigma-AldrichR2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

Riferimenti

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Neuroscienzeemissione 133optogeneticacomportamentoDrosophilaolfattoneurone olfattivo del ricevitorericevitore di odore

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati