Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكول يجتذ يتدنى وراثيا مسماة الخلايا العصبية بليزر اثنين-فوتون من اليرقات الزرد.

Abstract

لتحديد دور يتدنى من الخلايا العصبية في السلوك، من الضروري اختبار المترتبة على عرقلة نشاطها في الحيوانات الحية. التذرية الليزر الخلايا العصبية طريقة فعالة لهذا الغرض عندما تتم تسمية الخلايا العصبية بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. ويرد في الدراسة الحالية، والبروتوكولات الخاصة بالليزر أبلاتينج يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر اثنين-فوتون واختبار نتائجه الوظيفية والسلوكية. في هذه الدراسة، يتم استخدام السلوك التقاط الفريسة في اليرقات الزرد كنموذج دراسة. حلبة بريتيكتو طائي المعروف أن تكمن وراء هذا فريسة يحركها بصريا اصطياد السلوك. بريتيكتوم الزرد أبلاتيد الليزر، وجرى النظر في نشاط الخلايا العصبية في الفص السفلي من تحت المهاد (إيله؛ والهدف من الإسقاط بريتيكتال). كما تم اختبار السلوك التقاط فريسة بعد التذرية بريتيكتال.

Introduction

لفهم كيفية السلوك ينشأ عن نشاط الخلايا العصبية في الدماغ، من الضروري تحديد الدوائر العصبية التي تشارك في توليد هذا السلوك. مرحلة اليرقات، يوفر الزرد نموذج حيوان مثالي لدراسة وظيفة المخ المرتبطة بالسلوك لأن ادمغتهم الصغيرة وشفافة تجعل من الممكن للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في دقة خلوية في منطقة واسعة من المخ أثناء مراقبة السلوك1. تصوير نشاط الخلايا العصبية في الخلايا العصبية المحددة أصبح ممكناً من خلال اختراع وراثيا المرمزة الكالسيوم (Ca) المؤشرات (جيسيس) مثل جكامب2. جكامب الزرد المعدلة وراثيا أثبتت أن تكون مفيدة لربط الدارة العصبية الوظيفية بالسلوك عن طريق إجراء تصوير Ca في سلوك الحيوانات3.

بينما يمكن إثبات Ca تصوير العلاقات المتبادلة بين نشاط الخلايا العصبية والسلوك، لإظهار العلاقة السببية، قمع نشاط الخلايا العصبية، واختبار consequence(s) شأن سلوك خطوات هامة. هناك طرق مختلفة تحقيق هذا الهدف: استخدام الطفرات الوراثية أن يغير الدوائر العصبية محددة4، التعبير عن أعصاب في الخلايا العصبية المحددة5،6، استخدام أدوات أوبتوجينيتيك مثل هالورهودوبسين7، و ليزر تذرية من الخلايا العصبية المستهدفة8،9. التذرية الليزر مناسبة خاصة للقضاء على النشاط في عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية المحددة. القضاء الذي لا رجعة فيه من نشاط الخلايا العصبية عن طريق قتل الخلايا العصبية يسهل تقييم الآثار السلوكية.

هو واحد من السلوك المثيرة للاهتمام التي يمكن ملاحظتها في مرحلة اليرقات في الزرد فريسة الاستيلاء (الشكل 1أ). يوفر هذا السلوك الموجهة بشكل مرئي، والموجه بهدف نظام تجريبي مواتية لدراسة البصر10والتحول فيسوموتور11،،من1213، الإدراك البصري والاعتراف كائنات14،،من1516،،من1718، وصنع القرار19. كيف المسلم فريسة من الحيوانات المفترسة وكيف يؤدي الكشف عن فريسة فريسة اصطياد السلوك كانت مسألة مركزية في نيوروثولوجي20. في هذه الورقة، علينا أن نركز على دور الدارة بريتيكتو طائي شكلتها إسقاطات نواة في بريتيكتوم (نواة بريتيكتاليس السطحية فارس ماجنوسيلولاريس، يشار إليها فيما بعد، ببساطة ولوحظ بريتيكتوم) إلى إيله. وأبدى التذرية الليزر بريتيكتوم للحد من نشاط التقاط الفريسة وإلغاء نشاط الخلايا العصبية في إيله الذي يرتبط ب تصور فريسة البصرية21. هنا، بروتوكولات لإجراء الليزر التذرية واختبار أثره استخدام Ca2 + تصوير وتسجيل السلوكية في الزرد يرد اليرقات.

Protocol

1. الاجتثاث يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون

ملاحظة: إذا كان المستخدمين خطة بشأن أداء الاجتثاث Ca التالي التصوير، استخدم خط UAShspzGCaMP6s21. إذا المستخدمين تنوي القيام بتسجيل السلوكية بعد التذرية، استخدام خط UAS:EGFP، كما الاجتثاث الخلايا اجفب-إيجابية أسهل لأداء من التعبير عن GCaMP6s الخلايا.

  1. ابدأ بإعداد التزاوج من خط Gal4 تسميات محددة من الخلايا العصبية دراستها و UAS:EGFP أو UAShspzGCaMP6s. تأكد من استخدام الخلفية الصدف لكلا الوالدين بحيث يمكن الحصول على homozygotes الصدف .
    ملاحظة: وتتضمن homozygotes من الصدف لا ميلانوفوريس على سطح الجسم (الشكل 1ب). في الوقت الحاضر دراسة، gSAIzGFFM119B خط Gal4 (الذي تسمية في بريتيكتوم) وآخر سطر Gal4 hspGFFDMC76A (الذي التسميات ILH) يتم استخدامها21.
  2. في اليوم التالي من الإعداد التزاوج، جمع البيض الزرد، ورفع لهم إلى مرحلة اليرقات عند هذه النقطة عن الخلايا العصبية التي تهم الصحفيين الفلورسنت.
  3. جبل اليرقة الزرد في 2% انخفاض درجة الانصهار-[اغروس] (الشكل 1ب).
    1. البدء بإعداد 2% [اغروس] الأسهم الحل: حل ز 2 مسحوق [اغروس] نقطة انصهار منخفضة في 100 مل مياه نظام (أي، المياه المستخدمة للحفاظ على الزرد الكبار في نظام المياه المتداولة)22 أو E3 الماء23، بجلب الماء إلى نقطة في فرن ميكروويف الغليان، والاختلاط بقوة.
    2. الميكروويف الأسهم منخفضة نقطة انصهار [اغروس] 2% حتى يغلي. صب مل 3.5-4.0 من [اغروس] على غطاء طبق بيتري 6-سم. انتظر حتى يبرد [اغروس] حيث تكون دافئة عند لمسها قبل المتابعة.
    3. ثم، ضع يرقة واحدة (عدم تخديره في هذه الخطوة) في [اغروس]. الحفاظ على ضبط الموقف والتوجه لليرقة حيث أنها تستقيم، باستخدام إبرة تشريح (الشكل 1ج)، حتى يقوي [اغروس] لضمان تحديد المواقع المناسبة لليرقة.
      ملاحظة: وستواصل اليرقة تسبح حول بينما يتصلب [اغروس].
    4. حالما يتم وضع اليرقة، تسمح 5 دقيقة على [اغروس] ترسيخ تماما.
    5. صب 5 مل محلول تريكيني (0.4% 1 × تركيز العمل) على [اغروس].
      ملاحظة: تجنب الحركات باليرقات أثناء التذرية الليزر، يجب أن تظل اليرقات أنيسثيتيزيد طوال إجراءات الاجتثاث.
  4. يجتذ اليرقة باستخدام الدالة تبيض في نظام الفحص المجهري ليزر اثنين-فوتون.
    1. ضع اليرقة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] تحت ليزر اثنين-فوتون المسح مجهر وبدء نظام الفحص المجهري.
    2. بدء تشغيل البرنامج الحصول على الصورة، وانقر فوق الزر "حول" في علامة التبويب "الليزر" لتشغيل الليزر (الشكل 1د). انتظر "حالة" الليزر لتغيير من "مشغول" إلى "الوضع غير الساحلية."
    3. في علامة التبويب "قنوات"، تعيين الطول الموجي الليزر في 880 نانومتر (الحد الأقصى من الطاقة: حوالي 2,300 ميغاواط) للاجتثاث اجفب، أو 800 نانومتر (الحد الأقصى من الطاقة: حوالي 2,600 ميغاواط) للاجتثاث جكامب.
    4. حدد 20 X عدسة الهدف بتحريك المسدس العدسة يدوياً. انقر فوق علامة التبويب "تحديد"، انقر فوق "بروتينات فلورية خضراء" تغيير مسارات بصري، وعرض الأسفار مباشرة بالعين المجردة.
    5. تحديد موقع الدماغ الزرد اليرقات في مركز العرض؛ ثم انقر فوق علامة التبويب "حيازة" العودة إلى الفحص المجهري اثنين-فوتون.
    6. كسجل للشرط 'قبل الاستئصال'، تأخذ صورة z-مكدس مع العدسة الهدف X 20 في سرعة المسح السريع (لتجنب الأضرار الحرارة). وبعد مقارنة الصور التي اتخذت قبل وبعد تجارب التذرية (الشكل 2أ). للحصول على كومة z, انقر فوق "Z-مكدس" تحديد الخيار z-المكدس وتوسيع علامة التبويب تعيين الحد الأدنى (انقر فوق "تعيين أول" الزر ") بعد التركيز على نهاية البطني للدماغ اليرقات، وتعيين الحد الأعلى (انقر فوق الزر" تعيين الأخير ") بعد التركيز على الظهرية معظم سطح الدماغ. ثم، انقر فوق الزر "بدء التجربة" لتشغيل اكتساب صورة z-المكدس.
    7. حدد العدسة الهدف X 63 بتحريك المسدس العدسة يدوياً.
    8. انقر فوق علامة التبويب "تحديد" للتبديل إلى مجهر فلوري برنامج التحصين الموسع، وتحديد موقع الخلايا لتكون أبلاتيد في مركز العرض بالعين، ثم انقر فوق علامة التبويب "حيازة" العودة إلى الفحص المجهري بالليزر.
  5. في علامة التبويب "اكتساب الوضع"، تعيين "حجم الإطار" في 256 × 256. انقر فوق "لايف" ومراقبة الخلايا العصبية للفائدة.
  6. بدءاً من جانب معظم الظهرية، العثور المستوى البؤري التي الخلايا لتكون أبلاتيد في التركيز.
  7. علامة منطقة دائرية صغيرة الحجم حوالي الثلث للخلية في القطر على كل الخلايا العصبية كمنطقة للفائدة (ROI) باستخدام الدالة "المناطق".
  8. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى s/256 13.93 × 256 بكسل (ميكرومتر 134.42 x 134.42 ميكرومتر)، الذي يتوافق مع وقت يسكن ليزر المايكروثانيه تقريبا 200 بيكسل، أو 200 المايكروثانيه/0.5 ميكرومتر. أيضا، تعيين التكرار 4 ('دورة التكرار: 4'). وبدلاً من ذلك، تحسين عدد التكرارات وسرعة المسح الضوئي حتى يتحقق الاجتثاث كافية.
  9. أداء وظيفة 'التبييض' للاستئصال، بالاشتراك مع 'الوقت سلسلة (دورتان) صورة عينة (قبل وبعد الاستئصال) و' مناطق ' (لتعيين رويس) أو وظائف مماثلة في البرمجيات المستخدمة (الشكل 1د).
  10. بمقارنة الصورة الأولى (قبل التذرية) والصورة الثانية (بعد التذرية) في السلسلة الزمنية دورة، التأكد من أن بعد التبييض، الأسفار في النقصان الخلايا المستهدفة لمراعاتها على مستوى الخلفية (الشكل 2ب).
  11. إذا كانت الأسفار لا تزال موجودة بعد التذرية، زيادة عدد مرات التكرار.
  12. بعد ذلك، نقل المستوى البؤري أعمق قليلاً (أينحو الجانب البطني)، واختر المستوى البؤري القادم حيث تظهر الخلايا أبلاتيد الأمم المتحدة.
  13. أداء وظيفة التبييض كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 9). كرر هذه الخطوات حتى قد تم أبلاتيد كافة الخلايا الموجودة في البنية العصبية للفائدة.
  14. بعد أن يمر على جميع الطائرات المحورية التي تغطي الهياكل العصبية التي تكون أبلاتيد، تحقق من الخلايا للأسفار الملغاة. إذا تم العثور على بعض الخلايا تكون لا تزال الفلورسنت سبب الاجتثاث غير كافية، الليزر-تشعيع لهم مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
  15. إذا كان يحتاج اليرقة استردادها من [اغروس] بعد إشعاع الليزر، لا تحاول إجبارها خارج [اغروس] لأن هذا قد يلحق ضررا اليرقة. بدلاً من ذلك، بعناية إجراء تخفيضات صغيرة في [اغروس] حول اليرقة عمودياً على سطح الجسم. ثم، انتظر اليرقة للسباحة خارج [اغروس] بمفردها عندما يلبس المخدر.
  16. الانتقال إلى اليرقة القادم للاستئصال، أو القيام بتجارب مراقبة استخدام السكان آخر من الخلايا العصبية التي غير الضالعين في السلوك قيد التحقيق.
    ملاحظة: هنا، كعنصر تحكم، لمبة شمي الخلايا العصبية في UAS:EGFP؛ وكانت اليرقات gSAIzGFFM119B أبلاتيد الليزر باستخدام البروتوكول نفسه الموصوفة أعلاه (الشكل 2أ، حق).
  17. السماح لعدة ساعات أو يوم واحد للانتعاش قبل المتابعة إلى تصوير Ca (الفرع 2) أو تسجيل السلوكية (الفرع 3). خلال هذا الوقت الانتعاش، التحقق من صحة اليرقات (أي، سباحة عفوية طبيعية، أي ضرر الحرارة واضحة حول منطقة أبلاتيد، إلخ) وإزالة اليرقات أي دلائل على سوء الحالة الصحية.

2-الكالسيوم تصوير لتسجيل نشاط الخلايا العصبية التي أثارت فريسة في اليرقات الزرد أبلاتيد بريتيكتوم

  1. إعداد دائرة تسجيل ووضع طوقا دائرة تهجين ختم تأمين على شريحة زجاجية، مع الجانب لاصقة تواجه على الزجاج، وإزالة الختم العلوي.
    ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء دائرة تسجيل صغيرة التي من عيار 9 ملم وقطرها 0.8 ملم في العمق (الشكل 3أ).
  2. المقبل، بوضع شبكة نايلون (الحجم لافتتاح: 32 ميكرون) في أنبوب 50 مل يحتوي الجزء السفلي قطع مفتوحة. استخدام الحد الأقصى لإرفاق الشبكة في الأنبوب (الشكل 3ب).
  3. إعداد باراميسيا (وهو فريسة لاستخدامها كحافز البصرية ليرقة).
    ملاحظة: إعداد ثقافة براميسيوم (الخطوات 2.3.1 و 2.3.2) مسبقاً.
    1. الحصول على البذور باراميسيا الثقافة من مصادر تجارية أو مراكز الموارد الأحيائية الأكاديمية24 مقدما.
    2. الثقافة براميسيوم لعدة أيام في المياه التي تحتوي على قش الأرز يعقم وبيليه من خميرة البيرة الجافة22 (الشكل 3ج).
    3. من أجل ثقافة براميسيوم تباعا من خلال ثقب سيتا 2 (واحد مع فتحه 150 ميكرومتر، متبوعاً بآخر مع فتحه 75-ميكرومتر) لإزالة الحطام من الثقافة.
    4. جمع باراميسيا في التدفق عبر من الخطوة السابقة على شبكة نايلون (الفتحة 13-ميكرومتر).
    5. إعادة تعليق باراميسيا على شبكة النايلون في كوب زجاج باستخدام زجاجة ضغط لنظام المياه (الشكل 3د).
  4. شطف في mesh (الشكل 3ب) في نظام المياه 2 x (الشكل 3ه).
    ملاحظة: والغرض من هذه الخطوة إزالة أي ممكن أودورانتس وتاستانتس الواردة في الأجلين المتوسط والثقافة براميسيوم ، كما أن الهدف من هذه الدراسة مراقبة بصريا مدفوعة نشاط الخلايا العصبية.
  5. ضع يرقة الزرد في حل تريكيني تخدير.
  6. جبل يرقة واحدة في 2% نقطة انصهار منخفضة [اغروس].
    1. أولاً، الميكروويف 2% نقطة انصهار منخفضة [اغروس] وإضافة المجلد 1/10 من 10 × تريكيني تتركز [اغروس].
    2. ضع قطره واحدة من [اغروس] التي تحتوي على تريكايني على قاعة تسجيل (الشكل 3أ).
    3. بعد التأكد من [اغروس] ليس حار جداً، وضع اليرقة أنيسثيتيزيد (من الخطوة 2، 5) في [اغروس]، إزالة أي فائض [اغروس] فورا حيث أن سطح [اغروس] يبدو محدب قليلاً.
    4. توجيه اليرقة بسرعة في وضع رأسي بإبرة تشريح (الشكل 1ج).
      ملاحظة: هذه الإجراءات يجب أن تكتمل في غضون عدة ثوان قبل أن يقوي [اغروس].
    5. حالما يتم وضع اليرقة بشكل صحيح، السماح 5 دقيقة على [اغروس] ترسيخ تماما. بعد ذلك، صب قطره 1 x tricaine الحل [اغروس].
  7. إزالة [اغروس] حول رأس اليرقة الزرد، وإفساح المجال براميسيوم للسباحة باستخدام سكين جراحية. للقيام بذلك، أولاً، إجراء تخفيضات صغيرة قليلة في [اغروس] (الشكل 3و). ثم إزالة بعناية [اغروس] الزائدة بلطف صب نظام المياه في الدائرة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تغسل تريكيني.
  8. بعد ذلك، وضع أحد براميسيوم في قاعة التسجيل بمثابة حافز بصرية.
    ملاحظة: عندما تسبح براميسيوم قرب رأس اليرقة الزرد، سوف تثير استجابة الخلايا العصبية (الشكل 3ز).
  9. المكان قاعة تسجيل تحت مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار مزودة بكاميرا CMOS علمية (الشكل 3ح) وحدد عدسة هدف X 2.5 (الشكل 3أنا).
  10. جمع التسجيلات الوقت الفاصل بين الإشارات الأسفار جكامب.
    1. بدء تشغيل التطبيق اقتناء صورة للكاميرا مجهزة تجهيزا.
    2. انقر فوق "جزء التسلسل" وحدد "سجل القرص الثابت" في الجزء. في المقطع "إعدادات المسح الضوئي"، قم بتعيين "عدد الإطارات" إلى 900 أو أي أخرى رقم الإطار الإجمالي المطلوب.
      ملاحظة: إذا كانت متوفرة، استخدم برنامج تسجيل الوقت الفاصل مع وحدة نمطية (هنا، "القرص الثابت سجل") التي تمكن من إنقاذ فعالة من البيانات على القرص صلب.
    3. في جزء "التقاط"، تعيين زمن التعرض في 30 مللي ثانية (أي، 33.3 إطارا في الثانية)، و Binning 2 × 2.
    4. في المجهر السيطرة على لوحة اللمس، اختيار عامل تصفية للتجارة والنقل، كما جكامب قد أطياف الإثارة/الانبعاثات مماثلة للتجارة والنقل.
    5. انقر فوق "لايف" في جزء الالتقاط لتحديد موقع اليرقة في عرض الكاميرا والتركيز (الشكل 4أ)، ثم انقر فوق "إيقاف لايف" وانقر فوق الزر "ابدأ". حفظ الفيلم في.cxd أو أي تنسيق آخر يحتوي على معلومات حول حالة حيازة.
  11. بعد التسجيلات، تحليل الإشارات GCaMP6s نيون (Ca إشارات) عن طريق الحصول على قيم بكسل يعني للعائد على الاستثمار في بنية الدماغ في الوقت الفاصل بين الفيلم باستخدام البرمجيات الحرة فيجي25.
    ملاحظة: فيجي هي نسخة إيماجيج مع العديد من المفيد التوصيل في شكل مسبق ويمكن قراءة ملفات صورة تنسيق.cxd مع بيو-الأشكال في المكونات.
  12. إذا نقل اليرقة قليلاً أثناء التسجيل، إجراء تسجيل الصورة بواسطة تشغيل المكونات في توربوريج26 في فيجي. من القائمة، حدد 'الإضافات'، 'التسجيل'، و 'توربوريج'.
  13. النظر في كيفية تحليل البيانات وفقا لهدف الدراسة. التالي مثال.
    1. حساب و/F0 (شدة الأسفار في كل وقت، مقسوماً على كثافة fluorescence في الراحة أو قبل حدوث أي عابر Ca) على النحو التالي:
    2. تعيين رويس على بريتيكتوم أو إيله استخدام إدارة العائد على الاستثمار: في القائمة، حدد "تحليل،" "أدوات"، "إدارة العائد على الاستثمار"، و "إضافة" إلى قائمة رويس (الشكل 4أ).
    3. حساب قيم بكسل يعني رويس (أي.، كثافة الأسفار GCaMP6s) عن طريق تحديد لوحة إدارة العائد على الاستثمار: "أكثر من ذلك،" "التدبير المتعدد"، و "موافق". حفظ النتائج كملف جدول بيانات.
    4. كما الإشارات صاخبة، متوسط الإشارات ل 11-النقاط الزمنية (متوسط متحرك) باستخدام أحد تطبيقات التي يمكن التعامل مع بيانات جدول البيانات.
    5. القسمة F0 و (الأسفار الكثافات مع مرور الوقت) (شدة الأسفار على المستوى القاعدي) لحساب كثافة fluorescence تم تسويتها. كمثال من البيانات التصور، والتغيرات في تطبيع GCaMP6s fluorescence كثافة في بريتيكتوم وإيله مرمزة والمعينة على المسارات براميسيوم (الشكل 4ب-د).

3-تقييم النتائج السلوكية بعد التذرية الليزر

  1. قم بإعداد نظام تسجيل سلوكية التي تتكون من ستيريوسكوبي مجهزة بكاميرا فيديو. استخدام كاميرا مع صورة مناسبة اقتناء برنامج، تجارية أو مصنوعة خصيصا (الشكل 5ألف).
  2. تحسين ظروف الإضاءة بحيث براميسيوم يمكن الكشف عنها بواسطة معالجة الصور. على سبيل المثال، استخدام ضوء LED الدائري أبيض مع فاصل (الشكل 5ب).
    ملاحظة: المسافة من، والزاوية، الصمام يؤثر على مظهر العينة (أيمشرق في الخلفية الداكنة أو المظلمة في الخلفية مشرق) وهي، بالتالي، ذات أهمية حاسمة لمعالجة الصور الناجحة. تحديد ارتفاع أفضل من المباعدة (الشكل 5ج).
  3. ضع يرقة الزرد (المستردة من التجربة التذرية الليزر المبينة في الفرع 1) في دائرة تسجيل سلوكية (الذي كان يعلق على شريحة زجاجية) بختم أعلى الأصلي إزالتها (الشكل 5د).
  4. جمع 50 باراميسيا من الثقافة (الخطوة 2.3.5) باستخدام ميكروبيبيتي ووضعها في دائرة التسجيل.
  5. ضعه بكشف غطاء أعلى دائرة التسجيل. وضع قطره صغيرة من الماء على كشف الغطاء قبل أن يضع على سطح الماء دائرة التسجيل لتجنب إدخال الهواء في الغرفة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، وتجاوز بعض الماء مع باراميسيا من دائرة التسجيل. وسيكون العدد المتبقي من باراميسيا في قاعة تسجيل حوالي 30-40.
  6. ضع دائرة التسجيل (يتضمن اليرقة و باراميسيا) في نظام الإضاءة (الشكل 5د).
  7. بدء تسجيل الوقت الفاصل بين الساعة 10 إطارا في الثانية لمدة 11 دقيقة (إطارات 6,600).
  8. (اختياري) لكل يرقة التي تم اختبارها للسلوك، مراقبة الأسفار مجالات الليزر أبلاتيد بالفحص المجهري نيون التأكد من فعالية الليزر التذرية (أيغياب أو خلايا الفلورسنت، وعدد من انخفاض كبير في مجال الليزر المشع).
    ملاحظة: حتى بعد التشعيع، ويمكن ملاحظة بعض الخلايا الفلورسنت لا يزال سبب ظهور لاحق Gal4 التعبير الجيني في الخلايا التي ميزت بعد التذرية27.
  9. بعد تسجيل السلوك لليرقة، للتعويض عن عدم الاتساق في الخلفية، وإجراء تقسيم بكسل بكسل لكل إطار بصورة متوسط في فيجي: انقر فوق 'العملية'، '"صورة الحاسبة"'، 'العملية: تقسيم'، 32-بت (عدد عشري) نتيجة '، و' موافق '. لجعل صورة متوسط، انقر فوق 'صورة' 'مكدسات'، 'Z-مشروع'، 'متوسط'، وكثافتها 'موافق' (الشكل 5هاء، واو).
  10. عد عدد باراميسيا غادر في الدائرة عن طريق النقر فوق 'تحليل'، '"تحليل الجزيئات"'، إعداد مجموعة مجال الذي يغطي جميع باراميسيا، التحقق من خانة الاختيار 'إظهار: أقنعة'، والنقر فوق 'موافق'. الخيار 'إظهار: أقنعة' سيوفر صورة المستخرج باراميسيا (الشكل 5ز)، مع قائمة بعدد من الجسيمات (باراميسيا) في كل إطار.
  11. ارسم عدد باراميسيا اليسار في قاعة التسجيل على مر الزمن. نظراً لأن التقديرات لعدد باراميسيا صاخبة، نوصي بأداء متوسط نقل على كل نقطة في مجموعة إطارات 600 (1 دقيقة) في جدول البيانات.

النتائج

كانت تسمية الخلايا العصبية المحددة وراثيا أما اجفب أو GCaMP6s، التعبير الذين طردوا في خطوط Gal4. GSAIzGFFM119B خط Gal4 استخدمت لتسمية نواة في منطقة بريتيكتال (نواة ماجنوسيلولار بريتيكتال السطحية)، ويتدنى لمبة شمي الخلايا العصبية. خط آخر من Gal4، hspGFFDMC76A، استخدمت لتسمية في إيله. نحن الليز...

Discussion

وبالرغم من أن الليزر اثنين-فوتون قرار مكانية ممتازة ليجتذ الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد، ينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيها في أنسجة المخ سبب الحرارة. الخطوة الأكثر أهمية في هذه التجربة الاجتثاث لتحديد مقدار الأمثل لإشعاع الليزر. فشل تشعيع غير كافية لقتل الخلا...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في التقرير.

Acknowledgements

ومولت هذه الدراسات بالحصول على منح من يأمرون و JSPS كاكينهي منحة أرقام JP25290009، JP25650120، JP17K07494، و JP17H05984.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NuSieve GTG AgaroseLonzaCat.#50080low-melting temperature agarose
6 cm petri dishFALCONProduct#:351007
dissecting needleAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MPCarl Zeisstwo-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X objective lens
Imager.Z1Carl Zeissan epi-fluorescence microscope
ZENCarl ZeissImage acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depthMolecular ProbesCatalogue # S-24732Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing ChambersGrace Bio-LabsCoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5Used as a behavioral recording chamber
surgical knifeMANIOphthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodel:C11440-22CUa scientific CMOS camera
HCImageHamamatsu Photonicsimage acuisition software
Hard Disk Recording moduleHamamatsu PhotonicsAn software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7Olympusstereoscope
DF PL 0.5XOlympusobjective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Product No. GS3-U3-41C6NIR-CCMOS camera
XIMEA xiQ cameraXIMEAProduct No. MQ042RG-CMCMOS camera
a ring LED lightCCSModel: LDR2-100SW2-LAWhite LED
Nylon mesh 32µmTokyo ScreenN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µmTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron apertureTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron apertureTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Healthcare, Co. Ltd.dry beer yeast
LabVIEWNational Instrumentsan integrated development environment for programming
Mai-Tai HPSpectra Physics two-photon laser 

References

  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
  24. . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  27. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
  28. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved