Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Abstract

Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L'ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l'attività neuronale nel lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.

Introduzione

Per capire come comportamento nasce dall'attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l'attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento¹. La formazione immagine dell'attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l'invenzione di indicatori codificato geneticamente calcio (Ca) (GECIs) come GCaMP². Zebrafish transgenici GCaMP hanno dimostrato di essere utile per l'associazione funzionale circuito neurale con comportamento conducendo imaging Ca a comportarsi animali³.

Mentre la formazione immagine Ca può dimostrare correlazioni tra attività neuronale e comportamento, per mostrare la causalità, soppressione dell'attività neuronale e prova la sua consequence(s) il comportamento sono passi importanti. Ci sono vari modi per raggiungere questo obiettivo: utilizzare di mutazione genetica che altera i circuiti neurali specifici⁴, espressione delle neurotossine in neuroni specifici^5,6, uso di strumenti di optogenetica come halorhodopsin⁷, e ablazione di neuroni mirate^8,9laser. L'ablazione laser è particolarmente adatta per l'eliminazione di attività in un numero relativamente piccolo di neuroni specifici. Eliminazione irreversibile dell'attività neuronale uccidendo i neuroni facilita la valutazione comportamentale conseguenze.

Un comportamento interessante che può essere osservato nella fase larvale in zebrafish è la cattura di prede (Figura 1A). Questo comportamento visivamente guidato, obiettivo-diretto fornisce un favorevole sistema sperimentale per lo studio della acuità visiva¹⁰, trasformazione visuomotoria^11,12,13, percezione visiva e riconoscimento della oggetti^{14,15,16,17,18}e il processo decisionale¹⁹. Come preda è riconosciuto dai predatori e come preda rilevamento conduce alla preda cattura comportamento è stato una questione centrale in neuroethology²⁰. In questa carta, ci concentriamo sul ruolo del circuito pretecto-ipotalamica formato da proiezioni di un nucleo nel pretetto (nucleo pretectalis superficialis pars magnicellulare, d'ora in avanti, semplicemente notato come il pretetto) per il ILH. Ablazione laser del Pretetto è stato indicato per ridurre l'attività di cattura di prede e abolire l'attività neuronale in ILH che è associato con la percezione visiva preda²¹. Qui, protocolli per l'esecuzione di laser ablazione e prova il suo effetto utilizzando Ca^{2 +} imaging e registrazione del comportamento in zebrafish larve sono descritti.

Protocollo

1. ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni Laser

Nota: Se gli utenti intenzione di eseguire l'ablazione seguente imaging Ca, utilizzare il UAShspzGCaMP6s linea²¹. Se gli utenti intenzione di eseguire la registrazione del comportamento dopo ablazione, utilizzare la riga di UAS:EGFP, come l'ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto delle cellule che esprimono GCaMP6s.

1. Iniziare impostando l'accoppiamento di una linea di Gal4 che etichette neuroni specifici per essere studiato e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurarsi di utilizzare lo sfondo di nacre per entrambi i genitori affinché nacre omozigoti possono essere ottenuti.
   Nota: Gli omozigoti di nacre non contengono nessun melanofori sulla superficie del corpo (Figura 1B). Nel presente studio, un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 (che etichette il pretetto) e un altro Gal4 linea hspGFFDMC76A (che etichette il ILH) sono usate²¹.
2. Il giorno seguente dell'installazione degli amori, raccogliere le uova di pesce zebra e farli crescere fino allo stadio larvale, al punto che i neuroni di interesse esprimerà reporter fluorescenti.
3. Montare la larva di pesce zebra in basso punto di fusione-agarosio al 2% (Figura 1B).
   1. Iniziare col preparare la soluzione di riserva di agarosio 2%: sciogliere 2 g di polvere a basso punto di fusione dell'agarosi in 100 mL di acqua di sistema (cioè, l'acqua utilizzata per mantenere zebrafish adulto in un sistema di ricircolo dell'acqua)²² o E3 acqua²³, portando l'acqua a ebollizione in un forno a microonde e mescolando energicamente.
   2. Forno a microonde lo stock di basso punto di fusione agarosio 2% fino a ebollizione. Versare 3,5-4,0 mL di agarosio sul coperchio di una scatola di Petri 6 cm. Attendere che l'agarosio si raffredda in modo che sia caldo al tatto prima di procedere.
   3. Successivamente, inserire una singola larva (non anestetizzata in questa fase) in agarosio. Tenere regolando la posizione e l'orientamento della larva in modo che sia in posizione verticale, utilizzando un ago per dissezione (Figura 1C), fino a quando l'agarosio si solidifica per garantire il corretto posizionamento della larva.
      Nota: La larva continuerà a nuotare intorno mentre l'agarosio si solidifica.
   4. Una volta posizionata la larva, consentire 5 min per l'agarosio a solidificare completamente.
   5. Versare 5 mL di soluzione di tricaina (0,4% 1x concentrazione di lavoro) sopra l'agarosio.
      Nota: Per evitare movimenti dalle larve durante l'ablazione laser, le larve devono essere tenute anestetizzate durante tutta la procedura di ablazione.
4. L'ablazione della larva utilizzando la funzione sbianca in un sistema di microscopia del due-fotone laser.
   1. Posizionare la larva dell'agarosi-incastonato sotto un microscopio di scansione laser di due fotoni e avviare il sistema di microscopia.
   2. Avviare il software di acquisizione immagine e fare clic sul pulsante "On" nella scheda "Laser" per accendere il laser (Figura 1D). Attendere che lo "stato" del laser per cambiare da "Occupato" a "Mode-locking."
   3. Nella scheda "Canali", impostare la lunghezza d'onda del laser a 880 nm (potenza massima: circa 2.300 mW) per ablazione di EGFP, o a 800 nm (potenza massima: circa 2.600 mW) per GCaMP l'ablazione.
   4. Selezionare la lente dell'obiettivo X 20 spostando manualmente il revolver lente. Fare clic sulla scheda "Locate", fare clic su "GFP" per cambiare le vie ottiche e visualizzare direttamente la fluorescenza dall'occhio.
   5. Individuare il cervello larvale di zebrafish al centro della vista; quindi fare clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia del due-fotone.
   6. Come un record della condizione 'prima ablazione', prendere un immagine dello stack z con la lente dell'obiettivo X 20 ad alta velocità di scansione (per evitare danni dovuti al calore). Poi confrontare le immagini scattate prima e dopo l'ablazione esperimenti (Figura 2A). Per ottenere una z-pila, fare clic su "Z-Stack" per selezionare l'opzione z-stack ed espandere la scheda impostare il limite inferiore (clicca il "primo Set" pulsante") dopo la focalizzazione sul lato ventrale del cervello larvale e impostare il limite superiore (clicca sul pulsante"Imposta ultimo") dopo la messa a fuoco sul la maggior parte-superficie dorsale del cervello. Quindi, fare clic sul pulsante "Avvia esperimento" per eseguire l'acquisizione di immagini di z-stack.
   7. Selezionare l'obiettivo obiettivo 63X spostando manualmente il revolver lente.
   8. Fare clic sulla scheda "Locate" per passare alla microscopia epi-fluorescente, individuare le cellule per essere rimosso al centro della vista dall'occhio, quindi fare clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla scansione microscopia laser.
5. Nella scheda "Modalità di acquisizione", è possibile impostare la "grandezza" a 256 x 256. Fare clic su "Live" e osservare i neuroni di interesse.
6. A partire dal lato dorsale più, trovare un piano focale in cui le cellule per essere rimosso sono a fuoco.
7. Contrassegnare una piccola zona circolare di dimensioni di circa un terzo della cella di diametro su ogni neurone come una regione di interesse (ROI) utilizzando la funzione di "Regioni".
8. Impostare la velocità di scansione di 13.93 s/256 x 256 pixel (134.42 µm x 134.42 µm), che corrisponde ad un tempo di permanenza del laser di circa 200 µs/pixel, o 200 µs/0,5 µm. Inoltre, impostare 4 ripetizioni (' ciclo di iterazione: 4'). In alternativa, di ottimizzare il numero di iterazioni e velocità di scansione in modo che sufficiente ablazione è raggiunto.
9. Eseguire la funzione 'Sbianca' per ablazione, in combinazione con il 'Time series (2 cicli)' per realizzare l'immagine campione (prima e dopo ablazione) e «Regioni» (per impostare il ROIs) o funzioni equivalenti nel software utilizzato (Figura 1D).
10. Confrontando la prima immagine (prima di ablazione) e la seconda immagine (dopo ablazione) della serie di tempo ciclo, garantire che dopo lo sbiancamento, la fluorescenza della diminuisce le cellule mirate a quella osservata a livello di sfondo (Figura 2B).
11. Se fluorescenza è ancora presente dopo ablazione, aumentare il numero di iterazioni.
12. Successivamente, spostare il piano focale leggermente più profondo (cioè, verso il lato ventrale) e scegliere il prossimo piano focale dove appaiono le cellule non-ablate.
13. Eseguire la funzione sbianca come descritto in precedenza (punto 1.9). Ripetere questi passaggi fino a quando tutte le celle nella struttura neurale di interesse sono stato rimosso.
14. Dopo aver attraversato tutti i piani focali che coprono le strutture neurali per essere rimossa, controllare le cellule per fluorescenza abolita. Se alcune celle si trovano ad per essere ancora fluorescente a causa di insufficiente ablazione, laser-irradiare li nuovamente come descritto sopra.
15. Se la larva deve essere recuperato da agarosio dopo irradiazione del laser, non tentare di forzarlo fuori l'agarosio, perché questo potrebbe danneggiare la larva. Invece, attentamente fare piccoli tagli in agarosio intorno la larva perpendicolarmente alla superficie del suo corpo. Quindi, attendere che la larva di nuotare fuori di agarosio su proprio quando l'anestetico svanisce.
16. Procedere alla prossima larva per ablazione o eseguire esperimenti di controllo utilizzando un'altra popolazione di neuroni che sono non coinvolto nel comportamento sotto inchiesta.
    Nota: Qui, come un controllo, i neuroni del bulbo olfattivo in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larve erano ablazione laser usando lo stesso protocollo descritto in precedenza (Figura 2A, destra).
17. Consentire diverse ore o 1 giorno per il recupero prima di procedere a Ca imaging (sezione 2) o registrazione del comportamento (sezione 3). Durante questo tempo di recupero, verifica la salute larvale (cioè, nuoto spontanea normale, nessun danno apparente di calore intorno alla zona ablato, ecc.) e rimuovere le larve mostrando segni di cattiva salute.

2. calcio Imaging per registrare l'attività neuronale preda-evocato nelle larve di Zebrafish pretetto-ablazione

1. Per preparare una camera di registrazione, mettere un giunto di alloggiamento di ibridazione del garantire-seal su un vetrino, con il lato adesivo rivolto verso il vetro e rimuovere la guarnizione superiore.
   Nota: Questo crea una camera di registrazione piccolo che è di 9 mm di diametro e 0,8 mm di profondità (Figura 3A).
2. Successivamente, inserire una rete di nylon (dimensioni di apertura: 32 µm) su un tubo da 50 mL che ha fondo taglio aperto. Utilizzare il tappo per collegare la mesh sul tubo (Figura 3B).
3. Preparare i Paramisha (che è la preda per essere utilizzato come stimolo visivo per larva).
   Nota: La cultura di Paramecium (punti 2.3.1 e 2.3.2) di preparare in anticipo.
   1. Ottenere la coltura di sementi Paramisha da fonti commerciali o²⁴ centri accademiche bio-risorse in anticipo.
   2. Cultura il paramecio per diversi giorni in acqua contenente un pellet di lievito di birra secco²² (Figura 3C) e paglia di riso in autoclave.
   3. Versare successivamente la cultura di paramecio attraverso 2 setacci (una con apertura da 150 µm, seguita da un'altra con un'apertura di 75 µm) per rimuovere i detriti dalla cultura.
   4. Raccogliere Paramisha a scorrere-attraverso il passaggio precedente su una rete di nylon (apertura 13-µm).
   5. Risospendere i Paramisha sulla rete di nylon in un becher di vetro utilizzando una bottiglia squeeze dell'acqua impianto (Figura 3D).
4. Sciacquare la mesh (Figura 3B) nel sistema acqua 2 x (Figura 3E).
   Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di rimuovere qualsiasi possibile odoranti e tastants contenute nel terreno di coltura di paramecio , come l'obiettivo del presente studio è quello di osservare visivamente guidato attività neuronale.
5. Posto una larva di pesce zebra nella soluzione tricaina per anestetizzare.
6. Montare una singola larva a basso punto di fusione agarosio al 2%.
   1. In primo luogo, a microonde di agarosio al 2% basso punto di fusione e aggiungere 1/10 di volume di 10x tricaina concentrato l'agarosio.
   2. Mettere una goccia di agarosio contenente tricaina sulla camera di registrazione (Figura 3A).
   3. Dopo aver confermato l'agarosio non è troppo caldo, inserire la larva anestetizzata (dal punto 2.5) l'agarosio, rimuovere immediatamente qualsiasi eccesso dell'agarosi affinché la superficie di agarosio sembra leggermente convessa.
   4. Orientare rapidamente la larva in una posizione eretta con un ago per dissezione (Figura 1C).
      Nota: Queste procedure devono essere completate entro alcuni secondi prima che l'agarosio si solidifica.
   5. Una volta la larva è posizionata correttamente, permettono di 5 min per l'agarosio a solidificare completamente. Quindi, versare una goccia di 1 x tricaine soluzione su agarosio.
7. Rimuovere l'agarosio intorno alla testa della larva zebrafish e fare spazio per il paramecio a nuotare usando un bisturi. Per effettuare questa operazione, in primo luogo, fare alcuni piccoli tagli in agarosio (Figura 3F). Quindi, rimuovere delicatamente l'eccesso agarosio versando delicatamente sistema acqua sulla camera.
   Nota: A questo punto, sarà lavato la tricaina.
8. Successivamente, mettere un paramecio nella camera di registrazione a servire come uno stimolo visivo.
   Nota: Quando il paramecio nuota vicino alla testa della larva zebrafish, evocherà una risposta neuronale (Figura 3G).
9. Posto la camera di registrazione sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CMOS scientifica (Figura 3H) e selezionare un 2,5 X lente dell'obiettivo (Figura 3io).
10. Raccogliere le registrazioni time-lapse dei segnali di fluorescenza di GCaMP.
    1. Avviare l'applicazione di acquisizione di immagini per la fotocamera attrezzata.
    2. Fare clic su "Sequenza riquadro" e selezionare "Record di disco rigido" nel riquadro. Nella sezione impostazioni di scansione, impostare il "conteggio dei fotogrammi" per 900 o qualsiasi altro numero di telaio totale desiderato.
       Nota: Se disponibile, utilizzare il software di registrazione time-lapse con un modulo (qui, "disco rigido Record") che consente l'efficiente salvataggio dei dati su un disco rigido.
    3. Nel riquadro "Cattura", è necessario impostare il tempo di esposizione a 30-ms (cioè, 33,3 fps) e Binning 2 x 2.
    4. Il microscopio controllo pannello a sfioramento, scegliere un filtro impostato per GFP, come il GCaMP ha simili spettri di eccitazione/emissione di GFP.
    5. Fare clic su "Live" nel riquadro acquisizione per individuare la larva nella vista telecamera e messa a fuoco (Figura 4A) e quindi fare clic su "Stop Live" e fare clic sul pulsante "Start". Salvare il filmato in. cxd o qualsiasi altro formato che contiene informazioni relative alla condizione di acquisizione.
11. Dopo le registrazioni, è possibile analizzare i segnali fluorescenti di GCaMP6s (Ca segnali) ottenendo i valori dei pixel medi per il ROI impostato su una struttura cerebrale nel filmato time-lapse utilizzando il software gratuito Fiji²⁵.
    Nota: Fiji è una versione di ImageJ con molti utili plug-in di preinstallato e può leggere file in formato. cxd con i Bio-formati plug-in.
12. Se la larva si sposta leggermente durante la registrazione, è possibile eseguire registratura delle immagini tramite il plug-in TurboReg²⁶ in Fiji. Selezionare il menu 'Plugins', 'Registrazione' e 'TurboReg'.
13. Considerare come analizzare i dati secondo l'obiettivo dello studio. Di seguito è riportato un esempio.
    1. Calcolare la F/F0 (intensità di fluorescenza in ogni momento, diviso per l'intensità della fluorescenza a riposo o prima che si è verificato eventuali transitori di Ca) come segue:
    2. Impostare ROIs il pretetto o ILH utilizzando il gestore di ROI: nel menu, selezionare "Analizzare", "Strumenti", "Manager di ROI" e "Aggiungi" per l'elenco dei ROIs (Figura 4A).
    3. Calcolare i valori dei pixel medi per il ROIs (cioè., intensità di fluorescenza di GCaMP6s) selezionando il pannello Gestione ROI: "More", "Multi-misura" e "OK". Salvare i risultati come un file di foglio di calcolo.
    4. Come i segnali sono rumorosi, media i segnali per 11 tempo-punti (media mobile) utilizzando un'applicazione in grado di gestire dati di foglio di calcolo.
    5. Dividere F (intensità di fluorescenza nel corso del tempo) da F0 (intensità di fluorescenza a livello basale) per calcolare l'intensità di fluorescenza normalizzata. Come un esempio di visualizzazione dei dati, cambia intensità di fluorescenza GCaMP6s normalizzato nel pretetto e il ILH sono color-coded e mappati sulle traiettorie paramecio (Figura 4B - D).

3. valutazione delle conseguenze comportamentali dopo ablazione Laser

1. Impostare un sistema di registrazione del comportamento che consiste di uno stereoscopio dotato di una videocamera. Utilizzare una fotocamera con un'immagine appropriata acquisizione software, commerciale o su misura (Figura 5A).
2. Ottimizzare le condizioni di illuminazione in modo che il paramecio può essere rilevato da elaborazione delle immagini. Ad esempio, utilizzare un'anello bianco LED luce con un distanziale (Figura 5B).
   Nota: La distanza da e l'angolo di, il LED influisce sull'aspetto del campione (cioè, brillante sfondo scuro o scuro in fondo luminoso) e sono, pertanto, fondamentale per l'elaborazione di immagine di successo. Determinare la migliore altezza del distanziale (Figura 5C).
3. Posizionare una larva di pesce zebra (recuperata dall'esperimento di ablazione laser descritto nella sezione 1) in una camera di registrazione del comportamento (che è stato fissato a una lastra di vetro) con la guarnizione superiore originale rimossa(Figura 5).
4. Raccogliere 50 Paramisha dalla coltura (passaggio 2.3.5) utilizzando una micropipetta e metterli nella camera di registrazione.
5. Collocare un vetrino coprioggetto sopra la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di acqua su vetrini coprioggetto prima di mettere sulla superficie dell'acqua della camera per evitare l'introduzione di aria nella camera di registrazione.
   Nota: In questo passaggio, un po' acqua con Paramisha traboccherà dalla camera di registrazione. Il numero rimanente di Paramisha nella camera di registrazione sarà circa 30-40.
6. Posizionare la camera di registrazione (contenente una larva e Paramisha) nel sistema di illuminazione(Figura 5).
7. Avviare la registrazione time-lapse a 10 fps per 11 min (6.600 fotogrammi).
8. (Opzionale) Per ogni larva è stato testato per comportamento, osservare la fluorescenza delle zone ablazione laser di microscopia fluorescente per confermare l'efficacia dell'ablazione laser (cioè, assenza o significativamente ridotte numero di cellule fluorescenti in l'area di laser-irradiati).
   Nota: Anche dopo irradiazione, alcune cellule fluorescenti possono ancora essere osservati a causa della successiva insorgenza di Gal4 l'espressione genica in cellule differenziate dopo ablazione²⁷.
9. Dopo aver registrato il comportamento di larva, per compensare la mancanza di uniformità in background, eseguire una divisione di pixel-per-pixel di ogni frame di un'immagine media in Fiji: fare clic su 'Processo', 'Immagine Calculator', ' operazione: dividere ', 32-bit (float) risultato ', e ' OK'. Per rendere un'immagine media, fare clic su 'Immagine', 'Pile', 'Z-Project', 'Media intensità' e 'OK' (Figura 5E, F).
10. Una gamma di zona che copre tutti i Paramisha, l'impostazione del numero di numero di Paramisha lasciato nella camera cliccando 'Analizzare', 'Analizzare particelle', 'Visualizza: maschere' casella di controllo e facendo clic su 'OK'. L'opzione 'Visualizza: maschere' fornirà un'immagine estratta Paramisha (Figura 5G), con un elenco del numero di particelle (Paramisha) in ogni fotogramma.
11. Tracciare il numero di sinistra Paramisha nella camera di registrazione nel tempo. Perché le stime del numero di Paramisha sono rumorose, si consiglia di eseguire una media mobile su ogni punto in una gamma di 600 fotogrammi (1 min) nel foglio di calcolo.

Risultati

Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un'altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura...

Discussione

Anche se il laser del due-fotone ha un'ottima risoluzione spaziale per specificamente l'ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell'esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	low-melting temperature agarose
6 cm petri dish	FALCON	Product#:351007
dissecting needle	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X objective lens
Imager.Z1	Carl Zeiss		an epi-fluorescence microscope
ZEN	Carl Zeiss		Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	Used as a behavioral recording chamber
surgical knife	MANI	Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	model:C11440-22CU	a scientific CMOS camera
HCImage	Hamamatsu Photonics		image acuisition software
Hard Disk Recording module	Hamamatsu Photonics		An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7	Olympus		stereoscope
DF PL 0.5X	Olympus		objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	Product No. GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS camera
XIMEA xiQ camera	XIMEA	Product No. MQ042RG-CM	CMOS camera
a ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Nylon mesh 32µm	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm	Tokyo Screen	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		dry beer yeast
LabVIEW	National Instruments		an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP	Spectra Physics		two-photon laser