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要約

ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.

要約

動作における神経細胞の亜集団の役割を識別するためには、生きている動物の活動をブロックの結果をテストするのには不可欠です。レーザーアブレーションのニューロンは、神経細胞が選択的に蛍光プローブ付けこの目的のための効果的な方法です。現在の研究では、2 光子励起顕微鏡を使用して、その機能と行動の結果のテストは神経細胞の亜集団をアブレーション レーザーのプロトコルを説明します。本研究ではゼブラフィッシュ幼虫で獲物のキャプチャ動作は研究モデルとして使用されます。Pretecto 視床下部の回路動作をキャッチこの視覚的に駆動される獲物の根底に知られています。ゼブラフィッシュ pretectum レーザー蒸散、視床下部 (または喘鳴症; pretectal 投影のターゲット) の下の葉の神経活動を調べた。Pretectal アブレーション後獲物キャプチャ動作もテストされました。

概要

動作が脳の神経細胞の活動から発生する方法を理解するには、行動の生成に関与している神経回路を識別するために必要です。幼虫の段階で、ゼブラフィッシュは、理想的な動物モデル小さく、透明な脳の広範な領域での携帯電話の解像度で神経細胞の活動を調査することが可能になるため、動作に関連付けられている脳機能を勉強して、1の動作を観察しながら脳。特定のニューロンの神経活動のイメージングは、GCaMP2など遺伝的コード化カルシウム (Ca) 指標 (GECIs) の発明によって可能にしました。GCaMP トランスジェニックゼブラフィッシュ行動動物3Ca イメージングを行うことにより、機能的な神経回路動作を関連付けるために有用であると証明しました。

Ca イメージングは、神経活動と行動間の相関関係を示すことが、一方の抑制神経細胞の活動と行動にその consequence(s) をテストは、因果関係を示す、重要な手順です。これを達成するためにさまざまな方法があります: 特定の神経回路4、特定のニューロン5,6ハロロドプシン7などの光遺伝学的ツールの使用で神経毒の発現を変化させる遺伝子の突然変異の使用と対象となるニューロン8,9のレーザーアブレーションします。レーザーアブレーションは比較的少数の特定のニューロンの活動を排除することに特に適しています。神経細胞を殺すことによって神経細胞の活動の不可逆的な除去を促進する行動の結果を評価します。

ゼブラフィッシュの幼虫の段階で観察することができます 1 つの興味深い現象は、獲物のキャプチャ (図 1A) です。この視覚誘導、目的指向行動視力10、視覚運動変換11,12,13視知覚と認識の研究のため有利な実験システムを提供します。オブジェクト14,15,16,17,18, および意思決定19。どのように獲物は神経行動学20の中心的な質問をされている行動をキャッチ捕食者と獲物の検出が獲物につながる方法によって認識されます。本稿で我々 は、pretectum の核の投射によって形成される pretecto 視床下部の回路の役割に焦点を当てる (核 pretectalis 浅パルス大、以下、単に、pretectum として有名)、または喘鳴症に。獲物捕獲活動を減らす visual 獲物知覚21に関連付けられているまたは喘鳴症で神経活動を廃止し、pretectum のレーザー ・ アブレーションを示した。ここでは、実行するプロトコル レーザー アブレーションと幼虫のとおりゼブラフィッシュの Ca2 +イメージングと行動記録を使用してその効果をテストします。

プロトコル

1。 2 光子レーザー顕微鏡を用いたニューロンの亜種のアブレーション

注:Ca イメージング次アブレーションを実行する場合は、UAShspzGCaMP6s ライン21を使用します。アブレーションに続く行動の記録を実行する場合は、EGFP 陽性細胞の切除は GCaMP6s 発現細胞のよりも簡単に UAS:EGFP 線を使用します。

  1. 調査される特定のニューロン、UAS:EGFP または UAShspzGCaMP6s のラベル Gal4 ラインの交配の設定から始めます。必ず真珠についての得ることができるように、両方の親の真珠の背景を使用してください。
    注:真珠については黒色素胞の体表面 (図 1B) を含まない。現在の研究、Gal4 ライン gSAIzGFFM119B (これは、pretectum のラベル) と別 Gal4 線 hspGFFDMC76A (これは、または喘鳴症のラベル) に使用される21。
  2. 交尾のセットアップの次の日、ゼブラフィッシュ卵を収集し、その時点で興味のニューロンが蛍光レポーターを表現する幼虫の段階にそれらを上げます。
  3. 2% 低融点アガロース (図 1B) のゼブラフィッシュ幼虫をマウントします。
    1. 2% アガロース ストック溶液を準備することによって開始: 2 g を溶解低融点アガロース粉末 100 mL システム水 (すなわち、循環水系の大人のゼブラフィッシュを維持するために使用される水) の22または E3 水23水を持って来ることによって電子レンジ、沸点と精力的に混合します。
    2. 沸騰するまで 2% 低融点アガロース株式は電子レンジします。6 cm のシャーレの蓋に agarose の 3.5 4.0 mL を注ぐ。Agarose 冷却してそれが続行する前に触ると暖かくなるまで待ちます。
    3. 次に、agarose の (この段階では麻酔しない) 単一の幼虫を配置します。つまり解離針 (図 1C) を使用して、直立位置と幼虫の向きの調整を保つ幼虫の適切な配置を確保するために agarose が固化するまで。
      注:幼虫は agarose が固化しながら泳ぐ続けます。
    4. 幼虫を配置すると、完全に固めるための agarose のため 5 分を許可します。
    5. Agarose の上 tricaine 溶液 (1 作業濃度 × 0.4%) 5 mL を注ぐ。
      注:レーザー焼灼時に幼虫の動きを避けるため、幼虫はアブレーションの手順で麻酔が保たれなければなりません。
  4. 2 光子レーザー顕微鏡システムで漂白の関数を使用して幼虫を切除します。
    1. 2 光子レーザー顕微鏡下でアガロース埋め込まれた幼虫を置き、顕微鏡システムを起動します。
    2. 画像集録ソフトウェアを起動し、レーザー (図 1D) をオンにする「レーザー」タブの"On"ボタンをクリックします。「取り込み中」から「モード ロック」に変更するレーザー「ステータス」を待つ
    3. 「チャンネル」タブの設定レーザーの波長 880 nm (最大電力: 約 2,300 mW) EGFP アブレーションまたは 800 nm (最大電力: 約 2,600 mW) GCaMP アブレーションの。
    4. 20 X 対物レンズを選択するには、レンズのリボルバーを手動で移動します。"GFP"を「検索」タブをクリックし、[光の経路を変更し、直接目で蛍光を見る。
    5. ビューの中心にゼブラフィッシュ仔脳を検索します。2 光子顕微鏡に戻るを取得する」タブをクリックします。
    6. '前にアブレーション' 条件のレコードとして (熱による損傷を避けるため) に高速スキャン速度で 20 X 対物レンズと z スタックのイメージを取る。アブレーションの実験 (図 2A) の前後に撮影した画像を後で比較します。Z スタックを取得するには、ピントを合わせた後 z スタック オプションを選択し、幼虫の脳の腹側の端に焦点を後の下限値 (「設定 1」ボタン"をクリックします) を設定し、上限値 (「過去の設定」ボタンをクリックします) を設定タブを展開する「Z スタック」をクリックして、脳の背側ほとんど表面。Z スタック画像集録を実行する「実験開始」ボタンをクリックします。
    7. 63 X 対物レンズを選択するには、レンズのリボルバーを手動で移動します。
    8. エピ蛍光顕微鏡に切り替える、目、ビューの中心に蒸散するのにセルを検索し、レーザー走査蛍光顕微鏡に戻るを取得する」タブをクリックして「検索」タブをクリックします。
  5. 「アクイジション ・ モード」タブで 256 x 256 で「フレーム サイズ」を設定します。「ライブ」をクリックし、目的の神経細胞を観察します。
  6. ほとんど背側から始まって、フォーカル プレーンのアブレーション過程のセルが、フォーカスを見つけます。
  7. 小型で円形の領域に「地域」関数を使用して利益 (率 ROI) の領域として各ニューロンの直径の約 3 分の 1 セルのサイズをマークします。
  8. 約 200 μ s/ピクセル、または 200 μ s/0.5 μ m のレーザー ドウェル時間に対応する x 256 ピクセル (134.42 μ m x 134.42 μ m)、13.93 s/256 にスキャン速度を設定します。また、セット 4 の繰り返し (' イテレーション サイクル: 4')。代わりに、イテレーションとスキャン速度の数を最適化十分な切除を達成しました。
  9. サンプル (アブレーション前後) や '領域 (Roi を設定) するには (図 1D) 使用するソフトウェアで同等の機能のイメージを「時間シリーズ (2 サイクル)」との組み合わせで、アブレーションの '漂白剤' 関数を実行します。
  10. (アブレーション) の前に最初のイメージと時系列 (アブレーション) 後 2 番目のイメージを比較することによってサイクル、漂白した後、バック グラウンド レベル (図 2B) で観察する標的細胞減少の蛍光を確認します。
  11. 蛍光がアブレーション後まだ存在する場合は、イテレーションの数を増やします。
  12. 次に、焦点面少し深い (すなわち、腹側に向かって)、移動し、非蒸散のセルが表示される次の焦点面を選択します。
  13. (ステップ 1.9) 上記のように漂白の関数を実行します。これらの手順を繰り返して、興味の神経構造のすべてのセルが蒸散されてください。
  14. 切断する神経構造を覆うすべての焦点面を通過した後廃止蛍光セルを確認します。まだ不十分なアブレーションにより蛍光するいくつかのセルがある場合レーザー-照射して再び前述のよう。
  15. 幼虫はレーザー照射後の agarose から回復する必要がある場合、幼虫に損傷を与える可能性がありますこのために agarose のそれを強制しようとしないでください。代わりに、慎重に削減するため小さな幼虫の周り agarose の垂直にその体の表面。麻酔が切れるとき、独自に泳ぐ agarose から幼虫を待ちます。
  16. アブレーションのため次の幼虫に進むか、調査中の動作に関与している神経細胞の別の人口を用いた制御実験を行います。
    注:ここでは、コントロール、UAS:EGFP; の嗅球のニューロンとしてgSAIzGFFM119B の幼虫は、レーザー蒸散 (図 2A右) 上記と同じプロトコルを使用していた。
  17. 数時間または 1 日 Ca イメージング (セクション 2) または行動記録 (セクション 3) に続行する前にリカバリを許可します。この回復時間の間に (すなわち、通常自発的なスイミング、蒸散面積等周辺ない明らかな熱破損) の幼虫の状態をチェックし、体調不良の兆候を見せて幼虫を削除します。

2. カルシウム イメージング Pretectum アブレーション ゼブラフィッシュ幼虫の捕食誘発神経活動を記録するには

  1. 録音室の準備、接着面をガラス上にしてスライド ガラスに保護シール交配チャンバーのガスケットを入れて、上部のシールを削除します。
    注:これは 9 mm 径、深さ (図 3A) 0.8 mm 小さな記録室を作成します。
  2. 次に、ナイロン メッシュを配置 (開口部のサイズ: 32 μ m) を切り拓いた底部を持っています 50 mL チューブに。キャップを使用して、チューブ (図 3B) にメッシュをアタッチします。
  3. ゾウリムシ(ある幼虫の視覚刺激として使用される獲物) を準備します。
    注:ゾウリムシ培養 (手順 2.3.1 と 2.3.2) を準備事前。
    1. 事前に、市販または学術のバイオ リソース センター24からゾウリムシ種子培養を取得します。
    2. オートクレーブ処理した稲わら、乾燥ビール酵母22 (図 3C) のペレットを含む水で数日間ゾウリムシの文化。
    3. 引き続いて 2 ふるいを通してゾウリムシ文化を注ぐ (150 μ m の開口部を持つ 1 つ 75 μ m の開口部を持つ別の後に続く)、文化からの残骸を削除します。
    4. ナイロン メッシュ (絞り値 13 μ m) に前の手順からフローでゾウリムシを収集します。
    5. 再使用水システム (図 3D) のスクイズ ボトル ガラス ビーカーにナイロン メッシュにゾウリムシを中断します。
  4. システム水 2 (図 3E) x メッシュ (図 3B) をすすいでください。
    注:この手順の目的は、神経活動を視覚的に駆動を観察する本研究の目標は、すべての可能な匂いやゾウリムシ培養培地に含まれる呈を取り除くことです。
  5. 麻酔する場所 tricaine ソリューションのゼブラフィッシュの幼虫。
  6. 2% 低融点アガロースで単一の幼虫をマウントします。
    1. まず、2% 低融点アガロースを電子レンジ、agarose を集中 tricaine x 10 の 1/10 ボリュームを追加します。
    2. 記録室 (図 3A) に tricaine を含む agarose の一滴を配置します。
    3. 確認後 agarose があまりにもホットではない、アガロース、agarose の表面がわずかに凸状に見えるので、すぐに任意の余分な agarose の取り外しに (ステップ 2.5) から麻酔の幼虫を配置します。
    4. すぐに解離針 (図 1C) 直立位置に幼虫に合わせます。
      注:これらの手順は、数秒間 agarose が固化する前に完了する必要があります。
    5. 幼虫を正しく配置すると、完全に固めるための agarose のため 5 分を許可します。その後、agarose の 1 の x tricaine 溶液の一滴を注ぐ。
  7. ゼブラフィッシュ幼虫の頭の周りアガロースを削除し、手術用のナイフを使用して泳ぐゾウリムシのスペースを確保します。これを行うには、まず、アガロース (図 3F) でいくつかの小さな切り傷を作る。その後、優しく室に関するシステム水を注ぐことによって余分な agarose を慎重に取り外します。
    注:この段階で、tricaine が洗い流されます。
  8. 次に、1 つゾウリムシを視覚刺激として機能する記録室に入れてください。
    注:ゾウリムシはゼブラフィッシュの幼虫の頭の近くに泳ぐ、それはニューロンの応答 (図 3G) を呼び起こすでしょう。
  9. エピ蛍光顕微鏡下で記録室の場所は科学的な CMOS カメラ (図 3H) が装備し、(図 3私) 2.5 X 対物レンズを選択します。
  10. GCaMP 蛍光信号の時間経過の録音を収集します。
    1. 装備のカメラ用画像集録アプリケーションを起動します。
    2. 「シーケンス ウィンドウ」をクリックしてしウィンドウの「ハード ディスク記録」を選択します。[スキャンの設定] セクションで、「フレーム カウント」900 または任意他の合計フレーム数希望を設定します。
      注:利用可能な場合は、モジュールでコマ撮り録画ソフトウェアを使用 (ここでは、「ハード ディスク記録」) ハード ドライブにデータの効率的な保存を可能にします。
    3. 「キャプチャ」ウィンドウで 2 倍 (すなわち、33.3 fps)、30 ms とビニング 2 露出時間を設定します。
    4. タッチパネルを制御する顕微鏡、GCaMP あり GFP 励起/蛍光スペクトルと同様、GFP の設定フィルターを選択します。
    5. カメラ ビューとフォーカス (図 4A) で幼虫を検索に、「ライブを停止」をクリックして「スタート」ボタンをクリックして [キャプチャ] ウィンドウには、「ライブ」をクリックします。.Cxd または買収条件についての情報を保持しているその他の形式でムービーを保存します。
  11. 録音後フィジー25フリーソフトを使ってコマ撮り映画の脳構造に設定 ROI の平均のピクセル値を取得することによって GCaMP6s の蛍光シグナル (Ca シグナル) を分析します。
    注:フィジーは多く便利なプラグで ImageJ のバージョンのプレインストールし、バイオ形式が .cxd 形式の画像ファイルを読むことができますプラグイン。
  12. 幼虫が録画中に少し移動する場合、フィジーで TurboReg プラグイン26によって画像の登録を実行します。メニューから 'プラグイン'、'登録'、および 'TurboReg' を選択します。
  13. 研究の目的に合わせてデータを分析する方法を検討してください。以下は、例です。
    1. F/F0 (蛍光強度各時、安静時、または任意の Ca トランジェントが発生しました前に蛍光強度で割った値) を次のように計算します。
    2. Pretectum または ROI マネージャーを使用してまたは喘鳴症に Roi を設定: メニューで、「分析」、「ツール」「ROI マネージャー」を選択・ ・ ロワ (図 4A) の一覧に"追加"。
    3. Roi の平均のピクセル値を計算 (すなわち、GCaMP6s の蛍光強度) ROI マネージャー パネルを選択する:"より、"「マルチ メジャー"と"OK"。スプレッドシート ファイルとして結果を保存します。
    4. 信号はノイズの多いは平均 11 時間-(移動平均) を使用してポイント スプレッドシート データを処理するアプリケーションのための信号です。
    5. F0 F (時間の経過と共に蛍光強度) を分割 (基底レベルで蛍光強度) 正規化された蛍光強度を計算します。データの可視化の例はの変更し、pretectum と、または喘鳴症で正規化された GCaMP6s の蛍光強度は色分けされゾウリムシ軌道 (図 4B - D) にマップされます。

3. 次のレーザーアブレーション行動の結果の評価

  1. 万国実体写真ビデオ カメラ装備で構成される行動記録システムを設定します。カメラを使用して、適切な画像取得ソフトウェアの商業またはカスタムメイド (図 5A)。
  2. ゾウリムシは画像処理で検出できるので、照明条件を最適化します。たとえば、スペーサー (図 5B) とリング ホワイト LED ライトを使用します。
    注:距離と角度、LED サンプル (すなわち、暗い背景に明るいまたは明るい背景に暗い) とされ、したがって、成功した画像処理にとって重要の外観に影響します。スペーサー (図 5C) の最高の高さを決定します。
  3. (スライド ガラスに添付してあった)、行動記録室に元トップ シール削除 (図 5D) (セクション 1 で説明したレーザー ・ アブレーションの実験から復元) ゼブラフィッシュ幼虫を配置します。
  4. 文化 (ステップ 2.3.5) から 50ゾウリムシを収集マイクロ ピペットを使用して、記録室に置いています。
  5. 録音室の上にカバー スリップを置きます。カバー スリップでチャンバー内の空気を導入することを避けるために記録室の水表面に置く前に水の小滴を置きます。
    注:このステップで、ゾウリムシといくつかの水が録音室からオーバーフローします。録音室でゾウリムシの残り数は、約 30-40 になります。
  6. 照明システム (図 5D) で (幼虫とゾウリムシを含む) 録音室を配置します。
  7. 11 分 (6,600 フレーム) の 10 fps でコマ撮りの録画を開始します。
  8. (省略可能)動作のテストされたそれぞれの幼虫のレーザーアブレーション (すなわち不在、または大幅に削減数、蛍光セルでの有効性を確認するための蛍光顕微鏡によるレーザー生成領域の蛍光を観察します。レーザー照射領域)。
    注:照射後も、いくつかの蛍光セルまだ以降 Gal4 アブレーション27後区別細胞遺伝子発現の発症により観察できます。
  9. 背景には、均一性の不足を補うために、幼虫の行動を記録した後フィジーで平均画像の各フレームのピクセル単位で除算を実行します: 'のプロセス'、' イメージ電卓 'をクリック' 操作: 分割 '、32 ビット (float) 結果 '、および '。[Ok] '。平均のイメージをするためには、'イメージ'、'スタック'、' Z プロジェクト '、'平均強度'、'[ok]' (図 5E, F) をクリックします。
  10. すべてゾウリムシをカバーする区域の範囲を設定、粒子 '分析' '分析' をクリックして商工会議所の左にゾウリムシの数カウント' ショー: マスク ' チェック ボックスをチェックし、「OK」をクリックするとします。'ショー: マスク' オプションは、各フレームでパーティクル (ゾウリムシ) の数のリストを抽出したゾウリムシイメージ (図 5G) が提供されます。
  11. 時間をかけてレコーディング室に残っているゾウリムシの番号をプロットします。ゾウリムシの数の見積もりはぶれがあるために、スプレッドシート上の 600 のフレーム (1 分) の範囲の各ポイントで移動平均を実行することをお勧めします。

結果

特定のニューロンは EGFP と式は Gal4 行で運転された GCaMP6s 遺伝子標識しました。Gal4 ライン gSAIzGFFM119B は、pretectal エリア (大浅 pretectal 核)、および嗅球神経細胞の亜集団の核をラベルに使用されました。別の Gal4 ライン、hspGFFDMC76A、だった、または喘鳴症に使用されます。私たちレーザーアブレーション pretectal ニューロン両側 (図 2...

ディスカッション

2 光子レーザーには、具体的には個々 のニューロンをアブレーションする優れた空間分解能がありますが、偉大な用心は、暑さで脳組織上の任意の不要な損傷を避けるために取られるべき。アブレーションの実験で最も重要なステップは、レーザー照射の最適な量を決定することです。不十分な照射は、ニューロンを殺すために失敗します。あまりにも多くの照射、熱損傷周囲の組織は、望?...

開示事項

著者はレポートに利害の対立があります。

謝辞

これらの研究は、文部科学省、日本学術振興会科研費助成番号 JP25290009、JP25650120、JP17K07494、および JP17H05984 から受け取った補助金によって賄われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
NuSieve GTG AgaroseLonzaCat.#50080low-melting temperature agarose
6 cm petri dishFALCONProduct#:351007
dissecting needleAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MPCarl Zeisstwo-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X objective lens
Imager.Z1Carl Zeissan epi-fluorescence microscope
ZENCarl ZeissImage acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depthMolecular ProbesCatalogue # S-24732Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing ChambersGrace Bio-LabsCoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5Used as a behavioral recording chamber
surgical knifeMANIOphthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodel:C11440-22CUa scientific CMOS camera
HCImageHamamatsu Photonicsimage acuisition software
Hard Disk Recording moduleHamamatsu PhotonicsAn software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7Olympusstereoscope
DF PL 0.5XOlympusobjective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Product No. GS3-U3-41C6NIR-CCMOS camera
XIMEA xiQ cameraXIMEAProduct No. MQ042RG-CMCMOS camera
a ring LED lightCCSModel: LDR2-100SW2-LAWhite LED
Nylon mesh 32µmTokyo ScreenN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µmTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron apertureTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron apertureTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Healthcare, Co. Ltd.dry beer yeast
LabVIEWNational Instrumentsan integrated development environment for programming
Mai-Tai HPSpectra Physics two-photon laser 

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