إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

Summary

زرع البنكرياس جزيرة ليلى وسيلة لتحقيق نورموجليسيميا في مرض السكري من النوع 1. تركز هذه المقالة على تقنية زرع الأعضاء من خلال توجيه إينترابورتال للحفاظ على مستويات السكر العادي في الفئران السكري.

Abstract

زرع البنكرياس جزيرة ليلى للحد من ارتفاع السكر في الدم ناجحة للغاية في القوارض بالسكري المستحث كيميائيا. هو موقع الزرع الأكثر شيوعاً في جزيرة تجريبي زرع كبسولة الكلي. ومع ذلك، كما هو معروف أقل حول تفاعل جزيرات البنكرياس مع مكونات الدم، أيضا يجعل الشعور باستخدام نهج الوريد البابي في زرع جزيرة التجريبية.

هذا البروتوكول يوضح أسلوب زرع جزيرة إينترابورتال في الفئران عارية الرنين. يتم حقن بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي للحث على ارتفاع السكر في الدم في الفئران المستفيدة. أنها تعتبر كمرضى السكري على مستوى جلوكوز دم غير صيام أكبر من 20 ملمول/لتر. يوم واحد قبل الزرع، جزيرات البنكرياس الماوس يتم عزل من البنكرياس المانحين بالهضم كولاجيناز؛ وتستخدم كحد أدنى الجزر 350 كل مستلم السكري. اعتماداً على محصول عزلة جزيرة ليلى، تستخدم اثنين أو أكثر من الفئران المانحة كل مستلم. بعد الحصول على الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تدار الجزر الصغيرة في الكبد المستفيدة عن طريق الوريد البابي. بعد الجراحة، ومحمية في الحمراء Makrolon منازل الفئران ولاحظ حتى مستيقظا. يحتفظ هذا البروتوكول مراقبة نسبة السكر في الدم لمدة 120 يوما في الفئران سينجينيك و 15 يوما في الفئران متمكنة.

Introduction

زرع جزيرة ليلى نهج واعدة لعلاج النوع 1 السكري¹. وكان يؤديها أول محاولة لتحويل جزء من البنكرياس الأغنام إلى مريض السكري "ويليامز واتسون" في عام 1893. ومع ذلك، تحقق إنجازا كبيرا في زرع جزيرة السريرية لبروتوكول إدمنتون، وبعد ذلك، كانت سلسلة من البرامج الوطنية للبلدان المتقدمة النمو². في الماضي، تم استكشاف العديد من المواقع، مثل نخاع العظام والحقيبة أومينتال، المنطقة العضلي، وسطح المخاطية المعدة، الطحال، وكبسولة الكلي، في نماذج الإكلينيكية، ولكن النظام الوريدي المدخل يعتبر واحداً من موقع مناسب وفعال للبرامج السريرية^3،4،،من⁵⁶.

يمكن أن يكون محل الإدارة الخارجية للأنسولين بضخ جزيرة صغيرة في الوريد البابي. يعتبر هذا موقع مفضل لأن الإمداد بالأكسجين مماثلة لتلك في البنكرياس الأصلية نظراً لموقع مجرى النهر من التقاء مدخل الشريان والوريد. وعلاوة على ذلك، هناك مساحة كبيرة، حتى يمكن الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للجزر، والأوعية الدموية يمكن أن تكون ميسرة⁵. ماوس السكري المتلقية أو شبه جزيرة الإنسان أو الخنزير 2,000 الماوس 350 الجزر الصغيرة كافية لعكس اتجاه^7،الدولة هايبرجليسيميك⁸. كما أبلغ عن مستويات يوجليسيميك لمدة 15 يوما في طراز الماوس المستفيدة من الجزر إكسينوجينيك وفي طراز الماوس إلى ماوس متمكنة، وأكثر من 120 يوما في سينجينيك الماوس لزرع الأعضاء.

العوامل ذات الصلة بفعالية زرع الجزيرة عن طريق الوريد البابي هي مناسبة التخدير، أسلوب الثقب، والارقاء⁹. التخدير يمكن أن يكون الناجم عن استنشاق (5% إيسوفلوراني) أو حقن (الكيتامين أو إكسيلازيني أو بينتوباربيتال)، وغالباً ما يتم الجمع بين هذه المواد. للتحكم عمق ووقت التخدير، ينبغي إيلاء اهتمام دولة الماوس، مثل لون الغشاء المخاطي وغطاء العين، ومنعكس القرنية، ومعدل التنفس، ودرجة حرارة الجسم. من المهم التأكد من أن الحيوان لا تكافح وبقائها في العملية. يمكن الحفاظ درجة الحرارة بأجهزة التدفئة المختلفة، مثل منصات التدفئة، المصابيح الحمراء، وقد تم استخدام لوحة الحرارية الحارة إلخ A للحفاظ على درجة حرارة 25-30 درجة مئوية بين الماوس والجدول العملية، مما يمنع حدوث انخفاض درجة حرارة الجسم. جرعات المسكنات هامة، كما كل منهم يستقلبان في الكبد، وقد تكون وظيفة الكبد اضطرابه عابر بضخ تعليق جزيرة ليلى. النقطة ثقب مثالية الوريد البابي هو الموقف بين الوريد رافد الأولى والثانية.

العدد من الجزر الصغيرة، وحجم الحقن المقصود أيضا التأثير على نتيجة عملية الزرع، كوحدة تخزين مفرطة قد تزيد من إجهاد القص. وحدة تخزين 0.2 مل يعتبر مناسباً للزرع جزيرة صغيرة في الوريد البابي. •اجراء الجرح (26-قياس الإبرة) الحث على النزف من الوريد البابي، الذي يحتاج إلى وقفه بطريقة فعالة وفي الوقت المناسب. ويمكن تطبيق شاش معقم أو إصبع مع الحد الأدنى من الضغط في موقع البزل لحوالي 6 دقائق لوقف النزيف. الحقن المتخذة من جزيرة ليلى معا، المدخل الفعال وتنص اللائحة على مستويات الجلوكوز في الدم في نماذج الماوس السكري المستحث كيميائيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كافة الإجراءات في هذا البروتوكول أقرها قانون رعاية "الحيوان الألمانية" والمبادئ التوجيهية. النظر في استخدام 10-12 أسبوع الرنين عارية الفئران والفئران C57Bl/6 (المانحة: أنثى القديمة؛ والمتلقي: الذكور) في جميع أنحاء هذه التجارب. استخدام الفئران عارية الرنين لعزله جزيرة ليلى. الحفاظ على الفئران تحت شروط محددة وفقا للوائح مرفق الحيوانات المحلية.

1-تنظيم دورات تعريفية لمرض السكري من بالستريبتوزوتوسين

1. في يوم-4، قياس أوزان الجسم من 10 إلى 12 أسبوع من العمر الرنين عارية الفئران والفئران C57Bl/6 استخدام آلة وزنها.
2. استناداً إلى وزن الجسم المقاسة، إعداد جرعة 180 مغ/كغ من بالستريبتوزوتوسين في 0.1 مل من المحلول الملحي للماوس.
   ملاحظة: بالستريبتوزوتوسين ينبغي طازجة أعد قبل الاستخدام ومغطاة برقائق الألومنيوم، كما أنها حساسة للضوء.
3. حقن الفئران سينجينيك ومتمكنة كل إينترابيريتونيلي باستخدام إبرة 26-ز بجرعة وحيدة من 0.1 مل بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ).
4. اليوم-3، جمع-2 و-1 2-4 ميليلتر من الدم من خلال ثقب الأوردة ذيل الفئران غير صامت.
5. استخدام 2-4 ميليلتر من عينة الدم كل شريط الاختبار لقياس نسبة الجلوكوز في الدم في الفئران عارية الرنين والفئران C57Bl/6
   ملاحظة: عند هذه النقطة، 80% الفئران ينبغي أن يصبح السكري (20 ملمول/لتر).
   1. استخدام الفئران لزرع جزيرة ليلى عندما تصل مستويات جلوكوز الدم إلى 20 ملمول/لتر.

2-عزل جزيرات البنكرياس من الفئران

1. تخدير الفئران مع الكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (20 مغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل مع إبرة 26-ز.
   ملاحظة: تم تحديد وحدات التخزين من الكيتامين وإكسيلازيني وفقا لاوزان الجسم من الحيوانات (0.10 مل/10 غرام).
2. تبقى الفئران في موقف ضعيف وتعقيمها بمحلول بوفيدون. تأكيد القتل الرحيم السليم عن طريق فحص دواسة المعاكسة.
   ملاحظة: في حالة C57Bl/6 حلق منطقة البطن.
3. عقد الجلد مع الملقط الجميلة وجعل شق خط الوسط مع مقص لفضح تجويف البطن. ضع مكان الأمعاء إلى اليسار وخارج تجويف البطن في ضغط شاش معقم.
4. ضبط المعدة في اتجاه آخر لتحديد موقع البنكرياس وغيرها المرتبطة الأنسجة.
5. الوصول إلى الشريان الاورطي وجعل قطع صغيرة نزيف الدم. استخدام شاش معقم لامتصاص الدم.
6. بعناية إزالة الأمعاء. فصل البنكرياس من المعدة والطحال.
7. المكوس البنكرياس ووضعه في طبق بتري طازجة. قم بإزالة جميع المواد غير المرغوب فيها، مثل الدهون، واستخدام الملقط.
8. ملء حقنه 5 مل مع 4 مل كولاجيناز والبنكرياس بحقن بإبرة 26-ز (الأسهم الحل: 30 ملغ كولاجيناز في 12 مل من محلول هانك في).
9. فرم البنكرياس مع مقص لزيادة المساحة السطحية لتحسين الهضم ونقل إلى أنبوب كاب أحمر 12 مل.
   ملاحظة: هانك متوازنة الحل الملح: حبس 10 × (100 مل)، المقطر البنسلين-ستربتوميسين (10 مل)، مع الجنتامايسين (1 مل)، سيبروفلوكساسين (10 مل)، حبيس (35 مل)، ح₂س (900 مل)
10. أداء هضم لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تهتز. دوامة العينة ثلاث مرات على فترات منتظمة لمدة 15 ثانية.
11. مزيج البنكرياس هضمها بقوة باليد لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 10 ق.
12. إضافة 6 مل من محلول الباردة هانك التوقف عن رد فعل الهضم وأجهزة الطرد المركزي في 560 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
13. إزالة المادة طافية وحل بيليه في 10 مل من العجل باركر/الجنين المصل (P/FCS) المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: P/FCS المتوسطة: الطب الصيني التقليدي-199 10 × (100 مل)، المقطر FCS (50 مل)، البنسلين-ستربتوميسين (10 مل)، حبيس (20 مل)، ح₂س (900 مل)
14. تحديد الجزر استناداً على مورفولوجيا (كروي، اللون الذهبي والبنى) تحت مجهر خفيفة. تجنب الجزر الصغيرة مع مراكز الظلام. البحث عن النقاء والبقاء بأداء ديثيزوني تلطيخ تحت مجهر خفيفة.
    ملاحظة: ديثيزوني بربط أيون الزنك ويوفر حمراء اللون وصمة عار للجزر.
15. استخدام ماصة 1 مل لعد و handpick الجزر تحت مجهر خفيفة ونقلها إلى طبق بتري طازجة (60 ملم × 15 ملم) التي تحتوي على 4 مل ف/FCS متوسطة.
    ملاحظة: الحجم ف/FCS المتوسطة في طبق بتري لا ينبغي أن تتجاوز 4 مل من أجل ضمان توافر الأكسجين.
16. الحفاظ الجزر الصغيرة المعزولة في 4 مل ف/FCS متوسطة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة.

3-إعداد الحيوانات لزرع جزيرة ليلى

1. إزالة الجزر المنعزلة من حاضنة 37 درجة مئوية ووضعها تحت مقعد في تدفق. مركز الجزر بحركة دائرية يتأرجح طبق بيتري.
2. ملء 1 مل حقنه (إبرة 23-ز الأزرق) مع 0.1 مل متوسطة ف/FCS. ثم أضف الجزر 350 في 0.3 مل من محلول هانك. الاحتفاظ حقنه في وضع عمودي للسماح للجزر الصغيرة تسوية.
3. إنقاص حجم الصوت إلى 0.05 مل واستبدال الإبرة 23-ز الأزرق بإبرة 26-ز بني. لنفس المحاقن، إضافة 0.15 مل فيكل (الكثافة المتوسطة الانحدار) إلى أعلى للوصول إلى وحدة تخزين نهائي لمل 0.2 في المحاقن. تجنب فقاعات الهواء.
4. الاحتفاظ حقنه في وضع عمودي وتناوب عليه قليلاً لتجنب التثاقل من الجزر الصغيرة. سوف تستقر الجزر الصغيرة في المخروط لحقنه داخل 2-3 دقيقة.
5. قياس الجسم الوزن والدم مستويات الجلوكوز الفئران المستفيدة؛ يجب أن تكون مستويات السكر في الدم حوالي 20 ملمول/لتر.
6. تخدير الفئران مع الكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (20 مغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل مع إبرة 26-ز.
7. وضع الفئران في موقف ضعيف على لوحة حرارية حارة (37 درجة مئوية). تحقق من عمق التخدير معسر إصبع القدم.
8. تنظيف منطقة البطن بمحلول بوفيدون (مطهر الجلد). لمنع العيون من التجفيف، الاحتفاظ بها رطبة مع مرهم العين.
   ملاحظة: في حالة C57Bl/6 حلق منطقة البطن.

4-جزيرة زرع طريق إينترابورتال

1. في اليوم 0، تبدأ فتح البطن بعقد الجلد بالملقط وصنع سم 2-3-شق خط الوسط طويلة مع مقص. ضغط المكان شاش رطب عقيمة حول حواف الجرح للحفاظ على رطوبة.
2. ضع مكان الأمعاء إلى اليسار وخارج تجويف البطن في ضغط شاش معقم.
   ملاحظة: إبقاء الأمعاء رطبة طوال فترة الإجراءات مع محلول كلوريد الصوديوم 0.9% المعالجون مسبقاً أو شاش معقم انخفض في المحلول الملحي العادي.
3. نقل العفج وتحديد موقع البنكرياس. قم بتحديد موقع الوريد البابي موجودة في موقع البطني عن طريق دفع البنكرياس إلى الأعلى. استخدام الإصبع والإبهام لفضح الوريد البابي، وعندما يتعرض، ثقب قرب الكبد.
4. داخل 1 دقيقة، حقن ببطء واطراد الجزيرات (0.2 مل من الخطوة 3، 4) في الوريد البابي تحت تفتيش مكبرة لتجنب أي تسرب للجزر الصغيرة.
   ملاحظة: بعد الحقن، دائماً التحقق من الجزر الصغيرة المتبقية في المحاقن. أخذ 1 مل ف/FCS وسائط الإعلام في حقنه، تدفق إلى طبق بتري الطازجة والعد تحت مجهر.
5. وضع مقياس عقيمة في موقع الثقب والضغط بالسبابة (عمق الاختراق: 0.5-1 سم) لمدة 6 دقائق وقف النزيف.
   ملاحظة: يجب أن لا يتجاوز حجم حقن 0.2 مل. الصوت والضغط المفرط يمكن أن تلحق الضرر الجزر بسبب إجهاد القص.
6. بعناية بوضع مكان الأمعاء، والصفاق والعضلات البطن طبقة اللفافة إلى موقف.
7. استخدام الملقط، رفع الجلد، وإغلاق شق العضلات مع خياطة الحرير قابلة للامتصاص، وطبقة الجلد العليا مع مقاطع 2-3.
8. تنظيف السطح مع مطهر الجلد وتطبيق المداوي جرح ووضع الفئران في أقفاص فردية. الجرح المداوي يوفر طبقة أكريلاتي للماء وحماية من تعطن والعدوى الثانوية.
   ملاحظة: مراقبة الفئران حتى قد وعيه كافية، وتوفير ترامادول (0.2 ملغ في الماوس) جنبا إلى جنب مع السوائل. في هذا البروتوكول، الفئران المستردة من التخدير بسرعة وتخفيض الإدارة ترامادول الألم. بعد 7 أيام، وينبغي أن التئام الجرح.
9. تغذية الفئران بالماء والطعام العادية. سيتم زيادة إفراز البول واستهلاك الأغذية والمياه بعد حقن بالستريبتوزوتوسين.
10. قياس مستويات السكر في الدم كل يوم الأسبوع الأول وبعد ذلك مرة واحدة في الأسبوع في الفئران سينجينيك. في الفئران متمكنة، قياس مستويات الجلوكوز في الدم ثلاث مرات في أسبوع لمدة تصل إلى 15 يوما.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ودرس الكفاءات الجزيرات المزروعة في الفئران السكري المستحث كيميائيا. تم زرع الجزر عبر نظام وريدي المدخل في نموذج الفئران السكري. كانت بين المانح والمتلقي نسبة 2:1. في طراز الماوس سينجينيك، استخدمت اثنين من الفئران الجهات المانحة للحصول على 350 من الجزر الصغيرة. ثم تم زرعها ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة هو استكشاف الطريق إينترابورتال من زرع جزيرة ليلى. هذا البروتوكول هو ذات كفاءة عالية في تخفيف التوتر السكري ويوفر فرصة متعمقة لاستكشاف جزيرة زرع الدراسات. هذا البروتوكول يؤكد أن حوالي 350 من الجزيرات مورين قادرون على عكس الدولة هايبرجليسيميك. وعلاوة على ذلك، أي من الفئران توف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)