השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Summary

השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.

Abstract

השתלת הלבלב איון להפחית היפרגליקמיה היא מצליחה מאוד בחולדות עם סוכרת בהשפעת כימיקלים. האתר השתלת הנפוץ ביותר השתלת איון ניסיוני הוא הקפסולה כליות. עם זאת, פחות הידוע על האינטראקציה של לנגרהנס עם מרכיבי דם, זה גם הגיוני לנצל את הגישה וריד שער הכבד השתלת איון ניסיוני.

פרוטוקול זה מדגים שיטת השתלת איון intraportal בעכברים עירום NMRI. Streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) מוזרק intraperitoneally לזירוז היפרגליקמיה בעכברים הנמען. הם נחשבים כמו סוכרת ברמת הגלוקוז בדם ללא צום גדול מ- 20 mmol/ל' יום אחד לפני ההשתלה, העכבר לנגרהנס הם בודדו אותנו מהמתרחש הלבלב התורם על ידי עיכול collagenase; מינימום של 350 איונים מנוצלים לכל נמען סוכרתית. בהתאם התשואה בידוד איון, עכברים התורם שניים או יותר מנוצלים לכל נמען. לאחר לילה תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, איונים מנוהלים לתוך הכבד נמענים דרך וריד שער הכבד. לאחר הניתוח, העכברים מוגן בבתים Makrolon אדום והנצפית עד ערה. פרוטוקול זה שומר על הבקרה הגליקמית עבור 120 ימים בעכברים syngeneic ו- 15 ימים בעכברים allogeneic.

Introduction

השתלת איון היא גישה מבטיחה לטיפול סוג 1 סוכרת¹. הניסיון הראשון להעביר קטע הלבלב כבשים לתוך לחולה סוכרת בוצע על ידי ווטסון ויליאמס בשנת 1893. עם זאת, פריצת דרך השתלת איון קליני הושגה עם פרוטוקול אדמונטון, לאחר מכן, סדרה של תוכניות לאומיות היו מפותחות². בעבר, מספר אתרים, כגון מח העצם, נרתיק עם פגיעה, אזור תוך שרירית, השטח הרירית קיבה, טחול וכן כליה כמוסה, היו בציורו במודלים פרה, אבל וריד נחשב לאחד של אתר מתאים ויעיל עבור תוכניות קליני^3,4,5,6.

הממשל אקסוגני של אינסולין יכול להיות מוחלף על ידי אינפוזיה איון לתוך וריד שער הכבד. מצב זה נחשב אתר מועדף בגלל לאספקת החמצן דומה לזו בלבלב יליד בשל המיקום במורד הזרם של המפגש של פורטל עורק, וריד. יתר על כן, יש פני שטח גדול, כך למבנה התלת ממדי של ע עשוי להישמר, vascularization יכול להיות מונחה⁵. עכבר סוכרתית הנמען, 2,000 בני אדם או חזירי איון מקבילות או העכבר 350 איונים סבירים להפוך את המדינה hyperglycemic^7,8. רמות Euglycemic דווחו על 15 ימים במודל עכבר הנמען של איים קטנים xenogeneic, במודל עכבר allogeneic ועל יותר מ 120 ימים בהשתלת syngeneic העכבר-העכבר.

גורמים הקשורה היעילות של השתלת איון דרך וריד שער הכבד הם המתאימים הרדמה, שיטה של דקירה, hemostasis⁹. הרדמה יכולה להיגרם על ידי שאיפת (5% איזופלוריין) או הזרקה (קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים או פנטוברביטל), החומרים משולבים לעתים קרובות. שליטה על עומק וזמן של הרדמה, תשומת הלב צריך להיות משולם למצב של העכבר, כגון הצבע של קרום רירי, עין מכסה, רפלקס המצמוץ, קצב נשימה, טמפרטורת הגוף. חשוב לוודא כי החיה לא נאבק, הוא שורד את הניתוח. הטמפרטורה יכול להישמר על ידי מכשירי חימום שונים, כגון כריות חימום, אדום-נורות, צלחת תרמיים חמים וכו א שימש כדי לשמור על חום של 25-30 מעלות צלזיוס בין השולחן המבצע, אשר מונע את המופע של העכבר היפותרמיה. המינונים בהרדמה חשובים, כמו כולן הן מטבוליזם על ידי הכבד, תפקוד הכבד עשוי להיות מגרה transiently מאת לעירוי של המתלה איון. נקודת חדירה אידיאלי עבור וריד שער הכבד הוא המיקום בין הווריד אחד מיובליו של הראשון והשני.

מספר איים קטנים ונפח הזרקת המיועד להשפיע גם התוצאה של ההשתלה, כמו אמצעי מופרז עלול להגביר את מאמץ גזירה. אמצעי אחסון 0.2-mL נחשבת מתאימה השתלת איון לתוך וריד שער הכבד. הפצע puncturing (מחט בקוטר 26) גורם לדמם וריד שער הכבד, אשר צריך לעצור באופן מתוזמן ויעיל. גזה סטרילית או אצבע יכול להיות מיושם עם לחץ מינימלי באתר של הניקוב למשך כ 6 דקות לעצור את הדימום. איון ביחד, פורטל לקח זריקה יעיל ומספק רגולציה על רמות הגלוקוז בדם במודלים של העכבר סוכרת כימית המושרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

לכל השגרות פרוטוקול זה אושרו על-ידי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית והנחיות. שקול להשתמש 10 - עד השבוע ה-12 NMRI עכברים עירום ועכברים C57Bl/6 (התורם: מהמושב; הנמען: זכר) לאורך כל הניסויים. השתמש NMRI עכברים בעירום עבור בידוד איון. לשמור על העכברים בתנאים מוגדרים לפי תקנות מתקן בעלי חיים מקומיים.

1. אינדוקציה של סוכרת על ידי Streptozotocin

1. ביום-4, למדוד את המשקולות הגוף 10 עכברים עירום NMRI בת שבוע 12 ועכברים C57Bl/6 שימוש במכונה במשקל.
2. על פי משקל הגוף נמדד, להכין מנה 180 מ"ג/ק"ג של streptozotocin ב 0.1 מ"ל של תמיסת מלח לכל העכבר.
   הערה: Streptozotocin צריך להיות טרי שהוכן לפני השימוש, מכוסה ברדיד אלומיניום, גם ככה רגישים לאור.
3. . להזריק העכברים syngeneic ו allogeneic כל אחד עם מנה אחת של 0.1 מ"ל של streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות מחט 26-G.
4. ביום-3-2 ו-1 לאסוף 2-4 µL של דם על ידי ניקב את הוורידים הזנב של עכברים שאינם התענה.
5. להשתמש 2-4 µL של דגימת דם לכל רצועת הבדיקה כדי למדוד את רמת הסוכר בדם NMRI עכברים עירום ועכברים C57Bl/6
   הערה: בשלב זה, 80% מהעכברים צריך להיות סוכרתית (20 mmol/L).
   1. השתמש עכברים על השתלת איון כאשר רמות הגלוקוז בדם שלהם להגיע 20 mmol/ל'

2. בידוד של לנגרהנס של עכברים

1. עזים ומתנגד העכברים עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן עם מחט 26-G.
   הערה: אמצעי האחסון של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים היו נחושים לפי העובי הגוף של בעלי החיים (0.10 mL של 10 גרם).
2. לשמור על העכברים במצב פרקדן ולחטא עם povidone יוד פתרון. לאשר שהנהלים בבדיקת את רפלקס פדלים.
   הערה: במקרה של C57Bl/6 לגלח אזור הבטן.
3. להחזיק את העור עם מלקחיים בסדר, עושים חתך קו האמצע עם מספריים כדי לחשוף את חלל הבטן. מניחים את סיטוס במעי לשמאל, מחוץ חלל הבטן על קומפרס גזה סטרילית.
4. להתאים את הקיבה בכיוון אחר כדי לאתר את הלבלב ואת אחרים הקשורים לרקמות.
5. להגיע אבי העורקים, חותך חתך קטן כדי לנקז את הדם. להשתמש גזה סטרילית לקליטה דם.
6. הסר בזהירות את המעי. להפריד בין הלבלב לבין הבטן וה טחול.
7. בלו הלבלב ולמקם אותו בצלוחית טריים. הסר את כל החומרים לא רצויות, כגון שומן, באמצעות מלקחיים.
8. ממלאים מזרק 5 מ עם 4 מיליליטר collagenase ולהזריק לתוך הלבלב עם מחט 26-G (במניה פתרון: 30 מ"ג של collagenase ב- 12 מ של הפתרון של האנק).
9. מינצ הלבלב עם מספריים כדי להגדיל את שטח הפנים לעיכול משופרת, העברת צינור כובע אדום 12 מ.
   הערה: של האנק מאוזנת תמיסת מלח: HBSS 10 x (100 מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל), Gentamycin (1 מ"ל), ציפרופלוקסאצין (10 מ"ל), HEPES (35 מ ל), מזוקק H₂O (900 מ ל)
10. ביצוע של מערכת העיכול 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חזק. מערבולת המדגם שלוש פעמים על בסיס מרווח קבוע עבור 15 s.
11. מערבבים הלבלב מתעכל היטב על ידי היד למשך 3 דקות ומניחים אותו על קרח במשך 10 s.
12. להוסיף 6 מ של הפתרון של האנק קר כדי לעצור את התגובה עיכול צנטריפוגה ב 560 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
13. הסר את תגובת שיקוע, להמיס בגדר ב 10 מ"ל של פרקר/העוברי עגל בינונית סרום (P/FCS) בטמפרטורת החדר.
    הערה: P/FCS בינוני: TCM-199 10 x (100 מ"ל), FCS (50 מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל), HEPES (20 מ ל), מזוקק H₂O (900 מ ל)
14. לזהות את איונים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם (ספרואיד, צבע חום-זהוב) תחת מיקרוסקופ אור. להימנע איים קטנים עם מרכזי כהה. בדוק טוהר ואת הכדאיות בביצוע dithizone מכתים תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: Dithizone נקשר יון אבץ ומספק כתם בצבע אדום כדי ע.
15. השתמש פיפטה 1-mL לספור, לבחור. לאישתך איונים תחת מיקרוסקופ אור ולהעביר אותם על צלחת פטרי טריים (60 מ"מ x 15 מ"מ) המכיל 4 מיליליטר בינוני P/FCS.
    הערה: הנפח של P /FCS בינוני בצלוחית הפטרי לא יחרוג מ ל 4 על מנת להבטיח זמינות חמצן.
16. שמור את איים מבודדים 4 מיליליטר P/FCS בינוני בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.

3. הכנה של חיות השתלת איון

1. להסיר את איים מבודדים מן החממה 37 ° C ולמקם אותם תחת הספסל זרימה. מרכז את איים עם תנועה מעגלית מתנדנדים של הפטרי.
2. ממלאים מזרק 1-mL (מחט 23-G כחול) מ 0.1 ל P/FCS בינוני. לאחר מכן, הוסף איונים 350 mL 0.3 של הפתרון של האנק. שמור את המזרק בצורה מאונכת כדי לאפשר את איונים להתיישב.
3. הנמך את הנפח עד 0.05 מ"ל ולהחליף את המחט 23-G כחול עם מחט 26-G חום. כדי המזרק אותו, להוסיף 0.15 מ של Ficoll (צפיפות צבע בינוני) לפסגה כדי להגיע נפח סופי של 0.2 מ"ל במזרק. להימנע בועות אוויר.
4. לשמור את המזרק במצב אנכי, לסובב אותו מעט כדי למנוע את הצליעה של איים קטנים. ע יסדר בקונוס של המזרק בתוך 2-3 דקות.
5. למדוד את הגוף והמשקל דם רמות הגלוקוז של העכברים הנמען; רמות הגלוקוז בדם צריכה להיות בערך 20 mmol/ל'
6. עזים ומתנגד העכברים עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן עם המחט 26-G.
7. הצב והעכברים במצב פרקדן על צלחת תרמיים חמים (37 מעלות צלזיוס). בדוק את עומק הרדמה על ידי צובט את הבוהן.
8. לנקות את אזור הבטן עם povidone יוד פתרון (חיטוי העור). כדי למנוע ייבוש העיניים, לשמור אותם לחות עם משחה העין.
   הערה: במקרה של C57Bl/6 לגלח אזור הבטן.

4. השתלת איון דרך המסלול Intraportal

1. ביום 0, להתחיל עם פתיחה של הבטן על-ידי החזקת את העור עם מלקחיים וביצוע של 2-3 ס מרב קו האמצע החתך עם מספריים. המקום גזה סטרילית רטובה לדחוס בקצוות הפצע כדי לשמור על לחות.
2. מניחים את סיטוס במעי שמאלה ומחוץ חלל הבטן על הקומפרס גזה סטרילית.
   הערה: לשמור את המעי לחות לאורך כל ההליך עם מראש ומחוממת 0.9% NaCl פתרון או גזה סטרילית טבול תמיסת מלח.
3. להזיז התריסריון ואתר הלבלב. אתר את וריד שער הכבד ממוקם במתחם הגחון על ידי דחיפת הלבלב כלפי מעלה. להשתמש אצבע כדי לחשוף את וריד שער הכבד, ברגע נחשף, לנקב אותו ליד הכבד.
4. בתוך 1 דקות, לאט ובזהירות להזריק את איים קטנים (0.2 מ"ל מהשלב 3.4) לתוך וריד שער הכבד תחת הבדיקה של זכוכית מגדלת כדי למנוע דליפה כלשהי של איים קטנים.
   הערה: לאחר הזרקת, תמיד בדוק איונים הנותרים במזרק. לקחת 1 מ"ל של מדיה P/FCS מזרק, סומק לתוך צלחת פטרי טריים הספירה תחת מיקרוסקופ.
5. מקום סטרילי לאמוד החדירה והפעילו לחץ עם האצבע המורה (עומק החדירה: 0.5-1 ס מ) עבור 6 דקות לעצור את הדימום.
   הערה: אמצעי האחסון מוזרק לא יעלה 0.2 מ"ל. הלחץ ונפח מופרז עלול לגרום נזק על איונים עקב מאמץ גזירה.
6. בזהירות המקום את המעי סיטוס הצפק, שכבה שריר הבטן, fascia סמיכה.
7. באמצעות מלקחיים, להרים את העור, סגירת החתך שריר שנספג בתפר משי, ואת שכבת העור העליונה עם 2-3 סרטונים.
8. לנקות את השטח עם חומר חיטוי העור, החל מרפא את הפצע, ולמקם את העכברים בכלובים בודדים. מרפא את הפצע מספק שכבה אקרילט עמיד במים, להגן מפני השרייה, שאורכה, זיהום משני.
   הערה: להתבונן העכברים עד שהם יש חזרה להכרה מספקת, לספק טרמדול (0.2 מ ג לכל עכבר) יחד עם נוזלים. פרוטוקול זה, עכברים התאוששה מן ההרדמה במהירות, טרמדול המינהל מופחתת לכאב. לאחר 7 ימים, צריך לרפא הפצע.
9. להאכיל את העכברים עם מים ואוכל רגיל. מזון ומים צריכת ושתן הפרשה יגדל לאחר הזריקה streptozotocin.
10. למדוד את רמות הגלוקוז בדם כל יום במשך השבוע הראשון, אז פעם בשבוע בעכברים syngeneic. בעכברים allogeneic, למדוד את רמות הגלוקוז בדם שלוש פעמים בשבוע למשך עד 15 ימים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כשירות של המושתלים איונים נחקרה כימית המושרה בעכברים סוכרתיים. ע הושתלו דרך וריד במודל בעכברים סוכרתיים. היחס בין התורם-המטופל היה 2:1. במודל עכבר syngeneic, נוצלו שני עכברים התורם להשגת איונים 350. ע הושתלו ואז לתוך בעכברים סוכרתיים. ירידה ברמת הגלוקוז בדם נצפתה ביום 1 לאחר ההשת?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, התוואי intraportal של השתלת איון בחנו. פרוטוקול זה יעיל ביותר להקלת הלחץ סוכרתית ומספק הזדמנות מעמיק לחקור מחקרים השתלת איון. פרוטוקול זה מאשרת כי כ-350 איונים מאתר מסוגלים היפוך המדינה hyperglycemic. יתר על כן, אף אחד העכברים מתו במהלך ההליך, הבקרה הגליקמית הושג לכל הנמענים. משקל הגוף ורמות גל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)