İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Özet

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

Özet

Hiperglisemi azaltmak için pankreas adacık nakli kemirgenler kimyasal kaynaklı şeker hastalığı olan son derece başarılı. Deneysel adacık nakli en yaygın nakli sitedeki böbrek kapsülü var. Ancak, daha az kan bileşenlerinin pankreas adacıkları etkileşim hakkında bilinen, aynı zamanda deneysel adacık nakli portal ven yaklaşımda kullanmak mantıklı olur.

Bu iletişim kuralı bir intraportal adacık nakli tekniği NMRI çıplak farelerde gösterir. Streptozotocin (180 mg/kg) intraperitoneally hiperglisemi alıcı farelerde ikna etmek için enjekte edilir. Onlar sigara açlık kan şekeri düzeyi, şeker hastası olarak 20 mmol/l büyük kabul edilir Bir gün önce nakli, fare pankreas adacıkları donör pankreas collagenase sindirim tarafından izole edilmiştir; en az 350 adacıklar diyabetik alıcı kullanılmaktadır. Adacık yalıtım verimi bağlı olarak, iki veya daha fazla donör fareler alıcı kullanılmaktadır. 37 ° C'de gecede kültür sonra adacıkları içine alıcı karaciğer portal ven yoluyla yönetilirler. Ameliyattan sonra fare kırmızı Makrolon evleri koruma ve kadar gözlenen Erdin. Bu iletişim kuralı için 120 syngeneic farelerde ve 15 gün allojeneik farelerde Glisemik denetimi kullanır.

Giriş

Adacık nakli tip 1 diyabet¹tedavisi için umut verici bir yaklaşımdır. Bir koyun pankreas parçası bir diyabetik hasta aktarmak için ilk girişim Watson Williams tarafından 1893 yılında gerçekleştirildi. Ancak, büyük bir atılım klinik adacık nakli içinde Edmonton protokol ile elde edildi ve bundan sonra bir dizi ulusal program gelişmiş²vardı. Geçmişte, kemik iliği, omental kese, kas içi bölge, Gastrik mukozal yüzeyinde, dalak ve böbrek kapsülü, gibi bazı siteler Preklinik modellerin keşfedilmeyi ama portal Venöz sistem uygun ve etkili site kabul edilir Klinik programları^3,4,5,6için.

İnsülin eksojen yönetim adacık infüzyon portal ven içine yerine. Oksijen için karşılaştırılabilir aşağı konumu nedeniyle yerli pankreas portal arter ve ven izdiham olduğu için bu tercih edilen bir site olarak kabul edilir. Ayrıca, adacıklar üç boyutlu yapısı korunmuş böylece geniş bir yüzey alanı olduğunu ve vaskülarizasyon kolaylaştırılmış⁵olabilir. Alıcı diyabetik fare, 2.000 insan veya domuz adacık eşdeğerleri veya 350 fare adacıkları Hiperglisemik devlet^7,8tersine çevirmek yeterli. Euglycemic düzeyleri ve syngeneic fare fare Ekiminde 120 günden fazla 15 gün içinde fare alıcı modeli xenogeneic adacıkları ve allojenik fare fare modeli için rapor edilmiştir.

Adacık nakli portal ven yoluyla etkinlik için uygun uygun anestezi, delik ve hemostaz⁹yöntem faktörlerdir. Anesteziye inhalasyon (%5 isoflurane) veya enjeksiyon (ketamin, xylazine veya Fentobarbital) tarafından indüklenen ve maddeler çoğunlukla birlikte. Derinliği kontrolünü ve zaman anestezi için mukoza, göz kapağı, Korneal refleks, solunum hızı ve vücut ısısı rengi gibi fare durumuna dikkat edilmeli. Hayvan değil mücadele ve işlem hayatta emin olmak önemlidir. Kırmızı Işık Ampüller sıcaklık Isıtma pedleri gibi farklı Isıtma cihazları tarafından korunabilir, vb A sıcak termal plaka 25-30 ° C sıcaklık fare ve oluşumunu engeller işlem tablosu arasında korumak için kullanılan hipotermi. Anestezi dozlarda hepsini karaciğer tarafından metabolize ve hepatik fonksiyon geçici. adacık süspansiyon infüzyonu düzensiz gibi önemlidir Birinci ve ikinci vergisel ven arasındaki portal ven için ideal ponksiyon noktasıdır.

Aşırı bir güç kesme stres arttıkça adacıkları ve amaçlanan enjeksiyon birim sayısını da organ nakli, sonucunu etkiler. 0,2 mL cilt portal ven içine adacık nakli için uygun olarak kabul edilir. Puncturing yara (26'lik iğne) zamanında ve etkili bir şekilde durdurulmalı portal ven gelen kanama neden olmaktadır. Steril gazlı bez veya bir parmak delik kanamayı durdurmak yaklaşık 6 dakika için sitenin en az basınç ile uygulanır. Alınan birlikte, portal adacık enjeksiyon etkilidir ve kan şekeri düzeyleri kimyasal olarak indüklenen diyabetik fare modelleri üzerinde düzenleme sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu iletişim kuralı tüm yordamları Alman hayvan refah yasaları ve kuralları tarafından onaylanmıştır. 10 - için 12-hafta-yaşlı NMRI çıplak fareler ve C57Bl/6 fare kullanmayı düşünün (donör: eski erkek; alıcı: erkek) boyunca deneyler. NMRI çıplak fareler adacık yalıtımı için kullanma. Fareler yerel hayvan tesisi düzenlemelere göre tanımlanmış koşullar altında tutun.

1. indüksiyon diyabet Streptozotocin tarafından

1. -4 günde 10 12 haftalık NMRI çıplak fareler ve tartı makinasıyla C57Bl/6 fareler vücut ağırlıkları ölçmek.
2. Ölçülen vücut ağırlığı göre streptozotocin serum fare başına 0.1 ml 180 mg/kg doz hazırlayın.
   Not: Streptozotocin taze kullanmadan önce hazırlanacak ve ışığa duyarlı olduğu gibi alüminyum folyo ile kaplı.
3. Syngeneic ve allojenik fareler her 0.1 mL streptozotocin (180 mg/kg) tek bir doz intraperitoneally 26-G iğne kullanarak enjekte et.
4. Gün -3, -2 -1 2-4 µL kan kuyruk damarlar sigara oruç farelerin delinme tarafından toplamak ve.
5. NMRI çıplak fareler ve C57Bl/6 fareler kan glukoz ölçümü için 2-4 µL kan örneği test şeridi başına kullanın
   Not: Bu noktada, fareler % 80'i şeker hastası olmak gerekir (20 mmol/L).
   1. Kan glikoz düzeyleri 20 mmol/l ulaştığınızda adacık nakli için fare kullanma

2. izolasyon fareler gelen pankreas adacıkları

1. Ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (20 mg/kg vücut ağırlığı) ile fareler mayi enjeksiyonu ile 26-G iğne ile anestezi.
   Not: Ketamin ve xylazine hacimleri (0.10 mL/10 g) hayvanların vücut ağırlıkları göre belirlenmiştir.
2. Fareler sırtüstü pozisyonda tutun ve povidone-iyot çözüm ile dezenfekte. Uygun ötenazi pedal refleks denetleyerek doğrulayın.
   Not: C57Bl/6 durumunda karın bölgesi tıraş.
3. Cilt iyi Forseps ile sık ve bir ensizyon makas ile karın boşluğu ortaya çıkarmak için. Bağırsak kalbin sol ve karın boşluğu dışında bir steril gazlı bez basmak üstünde yer.
4. Mide pankreas ve diğer ilişkili bulmak için başka bir yöne ayarlamak dokular.
5. Aort ulaşmak ve kanı için küçük bir kesim yapmak. Steril gazlı bez kan emme için kullanın.
6. Bağırsak dikkatli bir şekilde çıkarın. Pankreas mide ve dalak ayırın.
7. Pankreas tüketim ve taze kabında yerleştirin. Fat, forseps kullanarak gibi istenmeyen tüm malzemeyi kaldır.
8. Collagenase ile 4 mL 5 mL şırınga doldurulması ve 26-G iğne ile pankreas enjekte (stok çözüm: 12 mL Hank'in çözeltisi içinde collagenase 30 mg).
9. Bir geliştirilmiş sindirim ve 12 mL kırmızı bere tüp aktarmak için yüzey alanını artırmak için makas ile pankreas kıyma.
   Not: Hank'in dengeli tuz solüsyonu: HBSS 10 x (100 mL), penisilin-streptomisin (10 mL), viomisin (1 mL), siprofloksasin (10 mL), HEPES (35 mL), distile H₂O (900 mL)
10. Titreyen bir su banyosu içinde 37 ° C'de 10 dakika için bir sindirim gerçekleştirin. Girdap 15 için düzenli aralıklarla üç kez örnek s.
11. 3 min için el tarafından sindirilmiş pankreas kuvvetle karıştırın ve buz 10 yerleştirin s.
12. 6 mL sindirim tepki ve 3 dakika oda sıcaklığında 560 x g, santrifüj durdurmak için soğuk Hank'in çözeltisi ekleyin.
13. Süpernatant kaldırmak ve Pelet Parker/fetal buzağı serum (P/FCS) orta oda sıcaklığında 10 ml geçiyoruz.
    Not: P/FCS orta: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penisilin-streptomisin (10 mL), HEPES (20 mL), distile H₂O (900 mL)
14. Onların morfolojisi (küresel, altın kahverengi renk) dayalı adacıkları ışık mikroskop altında tanımlayın. Karanlık merkezleri ile adacıkları kaçının. Saflık ve canlılığı ışık mikroskobunda boyama dithizone gerçekleştirerek denetleyin.
    Not: Dithizone çinko iyon bağlar ve kırmızı renkli leke adacıkları için sağlar.
15. 1-mL pipet saymak ve hafif bir mikroskop altında adacıkları BitTorrents ve onlara taze Petri kabına (60 mm x 15 mm) P/FCS orta 4 mL içeren aktarmak için kullanın.
    Not: Hacmi P /Petri kabına ortamda FCS geçmemelidir 4 mL oksijen kullanılabilirliğini sağlamak için.
16. İzole adacıkları bir kuluçka 37 ° C'de P/FCS orta gecede 4 mL tutun.

3. adacık nakli için hayvanlar hazırlanması

1. İzole adacıkları 37 ° C kuluçka makinesi kaldırmak ve bir akış tezgah altında koyun. Petri kabına bir dairesel hareketli hareket ile adacıkları ortalayın.
2. 1-mL şırınga (mavi 23-G iğne) P/FCS Orta 0.1 mL ile doldurulması. Daha sonra 350 adacıkları 0.3 mL Hank'in çözeltisi ekleyin. Şırınga adacıkları yerleşmek izin vermek için bir dikey pozisyonda tutun.
3. 0.05 ml azaltmak ve mavi 23-G iğne kahverengi 26-G iğne ile değiştirin. Aynı şırıngaya 0.2 mL şırınga son hacmi ulaşmak için en Ficoll (yoğunluk gradient orta) 0,15 mL ekleyin. Hava kabarcıkları kaçının.
4. Şırınga dikey pozisyonda tutun ve hafifçe adacıkları topaklanma önlemek için döndürün. Adacıkları, 2-3 dakika içinde şırınga koni razı olacak.
5. Alıcı fareler vücut ağırlığı ve kan glikoz düzeyleri ölçmek; kan şekeri düzeyleri yaklaşık 20 mmol/l olmalıdır
6. Ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (20 mg/kg vücut ağırlığı) ile fareler mayi enjeksiyonu ile 26-G iğne ile anestezi.
7. Fareler sıcak termal plaka (37 ° C) üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anestezi derinliği parmak pinching tarafından kontrol edin.
8. Povidone-iyot solüsyonu (Cilt dezenfektan) karın Bölge temiz. Gözlerinin kurumasını önlemek için onları göz merhem ile nemli tutmak.
   Not: C57Bl/6 durumunda karın bölgesi tıraş.

4. adacık nakli Intraportal rota üzerinden

1. 0 gün, bir laparotomi ile Forseps ile cilt tutan ve 2-3 cm kazanmaya başlamak-uzun Ensizyon makas ile. Yerde ıslak steril bir gazlı bez nemli tutmak için yara kenarları etrafında sıkıştırın.
2. Bağırsak kalbin sol ve karın boşluğu dışında steril gazlı bez basmak üstünde yer.
   Not: bağırsak yordam önceden ısıtılmış % 0,9 NaCl çözüm veya normal tuz daldırma steril gazlı bez ile boyunca nemli tutmak.
3. Duodenum taşımak ve pankreas bulun. Portal ven pankreas yukarı iterek ventral sitesinde yer alan bulun. Portal ven ortaya çıkarmak için bir parmak ve başparmak kullanın ve bir kez maruz, karaciğer yakın ponksiyon.
4. 1 dakika içinde yavaş yavaş ve sürekli (Adım 3,4 0,2 mL) adacıkları Büyüteç adacıklar herhangi bir sızıntı önlemek için denetim altında portal ven içine enjekte et.
   Not: enjekte sonra her zaman şırınga içinde kalan adacıkları denetleyin. P/FCS medya 1 mL şırınga, floş bir taze Petri kabına ve mikroskop altında sayısı içine almak.
5. Steril bir ölçüm ponksiyon sitesinde yerleştirin ve işaret parmağı ile basınç uygulayın (penetrasyon Derinlik: 0.5-1 cm) kanamayı durdurmak 6 dk için.
   Not: 0.2 mL enjekte birimi geçmemelidir. Aşırı hacim ve basınç adacıkları kesme stres nedeniyle zarar verebilir.
6. Dikkatle bağırsak kalbin, Periton, karın kas katmanı ve fasya pozisyon içine yerleştirin.
7. Forseps kullanarak, Cilt Kaldır, absorbe ipek sütür ile kas kesi ve üst deri tabakası 2-3 kliplerle kapatın.
8. Temiz Cilt dezenfektan, yüzeyle bir yara iyileştirici uygulamak ve bireysel kafeslerde fareler yer. Yara iyileştirici bir suya dayanıklı akrilat katmanı sağlar ve maserasyon ve ikincil enfeksiyon korumak.
   Not: yeterli bilincine kadar fareler gözlemlemek, tramadol (0.2 mg-fare de) ile birlikte sıvı sağlamak. Bu iletişim kuralı, fareler anesteziden hızlı bir şekilde kurtarıldı ve ağrı tramadol yönetim düşük. 7 gün sonra yara iyileşir.
9. Fareler düzenli yemek ve su besleme. Yiyecek ve su tüketimi ve idrar atılımı streptozotocin enjeksiyon sonra artacak.
10. Kan şekeri düzeyleri her gün ilk hafta ve sonra bir kez bir hafta syngeneic farelerde için ölçmek. Allojeneik farelerde, 15 gün boyunca, haftada üç kez kan şekeri düzeylerini ölçmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Transplante adacıkları yeterliliğinin kimyasal olarak indüklenen diyabetik farelerde incelenmiştir. Adacıkları diyabetik fare modeli portal Venöz sistemi üzerinden nakledilen. Verici-alıcı oranı 2:1 idi. Syngeneic fare modelinde iki donör fare 350 adacıkları elde etmek için kullanılmıştır. Adacıkları sonra diyabetik fare nakledilen. Kan şekeri düzeyini bir azalma 1 gün sonra düşündüren bir rol kan şekeri düzeyini azaltmada transplante pankreas adacıkları n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, adacık nakli intraportal güzergahı keşfedilmeden. Bu iletişim kuralı diyabetik stres giderici yüksek verimli ve adacık nakli çalışmaları keşfetmek için derinlemesine bir fırsat sağlar. Bu iletişim kuralı yaklaşık 350 fare adacıkları Hiperglisemik devlet geri yeteneğine sahiptirler onaylar. Ayrıca, fareyi hiçbiri işlem sırasında öldü ve Glisemik kontrol tüm alan kimse içinde elde edildi. Vücut ağırlığı ve kan glikoz düzeyleri düzenli olarak yetkinlik, standart ve hi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)