JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج جسم بيسبيسيفيك GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في الإشريكيّة القولونية. تنقية GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية قد سيتوتوكسيسيتي قوية ضد خلايا سرطان الكبد الإيجابية GPC3.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول البناء والدراسات الفنية لجسم بيسبيسيفيك (بسب)، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية. يمكن التعرف على بسابس اثنين [ابيتوبس] مختلفة من خلال أسلحتهم مختلفة اثنين. وقد درست بسابس بنشاط لقدرتها على توظيف مباشرة الخلايا المناعية لقتل الخلايا السرطانية. حاليا، يتم إنتاج معظم بسابس في شكل البروتينات المؤتلف، أما بسابس المحتوية على Fc أو مشتقات بسب أصغر دون منطقة Fc. في هذه الدراسة، صمم GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، جسم بيسبيسيفيك استناداً إلى جزء (القوات المسلحة البوروندية) الأجسام المضادة، التي تربط بين القوات المسلحة البوروندية جسم GPC3 مكافحة GC33 مع جسم مجال مفرد مكافحة CD16. يمكن المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية وتنقيته قبل سنتين تقارب تشروماتوجرافيس. يمكن على وجه التحديد ربط المنقي GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية وتقتل خلايا سرطان الكبد إيجابية GPC3 بتجنيد الخلايا القاتلة الطبيعية، مما يوحي إمكانية تطبيق GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في علاج سرطان الكبد.

Introduction

[مونوكلونل] الآن تستخدم على نطاق واسع ل علاج السرطان1. بسبب مرونة الأجسام المضادة، تم استكشاف أشكال مختلفة تستند إلى جسم بنشاط. وبالمقارنة مع الأجسام المضادة، قد بسابس اثنين من وحدات الربط مستضد مختلفة، تمكينهم من التعرف على اثنين من أهداف مختلفة في وقت واحد وكفاءة الزناد تجنيد الخلايا المناعية المستجيب لاستهداف وقتل الخلايا السرطانية2.

يمكن تعيين تنسيقات بسب المؤتلف الحالية عموما إلى فئتين: بسابس المحتوية على نادي وبسابس دون منطقة Fc. بالمقارنة مع تنسيقات المحتوية على لجنة التيسير التي يتم إنتاجها في الغالب في خلايا الثدييات، بسابس دون منطقة Fc لها مزايا أحجام أصغر، يتم إنتاجها بسهولة أكبر في نظم التعبير الكائنات الدقيقة، ويمكن اختراق أنسجة الورم أكثر كفاءة 3.

بسابس دون منطقة Fc تتشكل عادة عن طريق ربط مويتيس ملزم الفردية، مثل شظايا متغير سلسلة مفردة (سكففس) أو الشؤون3. دون استقرار المجالات، بسابس استناداً إلى شظايا سكفف غالباً ما يكون الخطر الثبات الحراري، وانخفاض معدلي الذوبان، أو زيادة احتمال تجميع4،5. وفي المقابل، المستندة إلى القوات المسلحة البوروندية بسابس أكثر استقرارا بسبب هيتيروديميريزيشن CH1 و CL في4،moiety القوات المسلحة البوروندية الأصلي6.

المجال المتغير من الأجسام الثقيلة سلسلة فقط (فحص، كما يشار إلى مجال مفرد الأجسام المضادة) هي الجزء مستضد ملزمة النشطة من الأجسام المضادة الطبيعية الغزيرة سلسلة7. وقد فحص خصائص تقارب عالية وخصوصية التقليدية IgGs8، الاستمناع منخفضة وعالية الغلة في التعبير البكتيرية9. وبالمقارنة مع شظايا Fv، قد فحص الثبات الحراري أعلى10. وبالمقارنة مع القوات المسلحة البوروندية مويتيس، قد فحص أصغر حجماً نظراً لعدم وجود CH1 و CL. وهكذا، صمم S-القوات المسلحة البوروندية، بالشكل بسب التي تم الحصول عليها عن طريق ربط القوات المسلحة البوروندية بجسم مجال مفرد، فة، ودراسة عن الآثار المضادة للورم11،12.

في هذه الدراسة، وصف بناء GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية التي تربط بين القوات المسلحة البوروندية من hGC3313 مع فة مكافحة--CD16a14 . يمكن أن تنتج GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية كفاءة عن طريق التعبير بيريبلاسميك في الإشريكيّة القولونية (). واقترحت الدراسات الفنية من GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية أن GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية استراتيجية واعدة لعلاج سرطان الكبد. وهكذا، تشمل مزايا GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية على تقنيات بديلة مع المراجع المطبقة على الدراسات السابقة سهلة الإنتاج والتنقية، وبسابس أكثر استقرارا.

نظم التعبير الثدييات والتعبير بدائية قد استخدمت للتعبير عن مختلف أشكال بسابس. وعلى النقيض من نظم التعبير الثدييات، كولاي-أنظمة تعبير البروتين أساس لها العديد من المزايا، بما في ذلك غلة عالية، منخفضة التكلفة وتوفير العمالة، وسهولة التلاعب الجيني، وتحويل عالية الكفاءة15. بسابس التعبير في كولاي، هناك اثنين من الاستراتيجيات الأساسية: التعبير في السيتوبلازم والتعبير في بيريبلاسم بين السيتوبلازم وأغشية الخلية الخارجي15. مقارنة بالبيئة مما يقلل من السيتوبلازم، هو بيريبلاسم البيئة، التي تروج للطي الصحيحة والتعبير المشارك من البروتينات16مؤكسدة أكثر. الطي الصحيحة دوراً رئيسيا في توليد بسابس القابلية للذوبان والاستقرار ووظيفتها. ولذلك، أضيفت بيلب تسلسل إشارة N-المحطة S-القوات المسلحة البوروندية لتوجيه إفراز بيريبلاسم كولاي17. لضمان صحيحة قابلة للطي والذوبان والثبات الحراري والاستقرار كونفورماشونال، الحد من التعقيد وحجم جسم مضاد غالباً ما يلجأ16. تنسيق S-القوات المسلحة البوروندية يتكون من واحد من القوات المسلحة البوروندية وفه واحدة، التي يعبر عنها جيدا جداً في النظم البكتيرية احتمالاً بسبب هيكل بسيط وصغير الحجم.

واختير GPC3 بهذا الشكل جسم بيسبيسيفيك GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية. 3-جليبيكان (GPC3) هو عضو في الأسرة بروتيوغليكان الهيبارين كبريتات (HS) الذي يرتكز على سطح الخلية عن طريق جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)18. GPC3 أوفيريكسبريسيد في 70% حالات سرطانه الخلية الكبدية (HCC)، التي تشكل غالبية سرطانات الكبد19،20،،من2122. لأنه نادراً ما يتم التعبير عن GPC3 في أنسجة طبيعية، قد اقترح GPC3 كهدف محتمل للعقود. وتم إنتاج عدة الماوس مابس ضد GPC3. بيد أن GC33 فقط أظهرت المضادة للورم النشاط المحدود 22ولم يحمل الفعالية السريرية في المرضى. وأبدى GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في هذه الدراسة، أن تكون قادرة على تجنيد خلايا ناغورني كاراباخ لقتل خلايا الورم GPC314.

لتعيين الخلايا ناغورني-كاراباخ، استخدمت فة مكافحة CD16. CD16a مستقبلات مفتش تقارب منخفضة، أعرب أساسا على الخلايا القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) والضامة ووحيدات وبعض أنواع فرعية من الخلايا التائية. أنها تشارك في الخلية تعتمد على جسم سيتوتوكسيسيتي (ADCC) من ناغورني كاراباخ الخلايا23. يمكن تصنيف الخلايا البشرية في ناغورني كاراباخ إلى نوعين، CD56-CD16 + و CD56 + CD16-. وعلى النقيض من الخلايا CD56 + CD16− ناغورني كاراباخ، CD56-CD16 + "ناغورني كاراباخ" الخلايا يمكن الإفراج عن مستويات أعلى من بيرفورين وجرانزيمي ب وهكذا يقدم سيتوتوكسيسيتي قوية24. هي خلايا كوبفر (KCs)، وإذ تعرب عن CD16a، الضامة المقيم في الكبد. خلايا كوبفر دوراً هاما في مكافحة سرطان الكبد25. وهكذا، قد يكون بسابس استهداف CD16a استراتيجية واعدة أكثر من الانخراط في خلايا تي ضد سرطان الكبد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الإجراءات بما في ذلك جمع الدم البشري بموافقة "لجنة الأخلاقيات جامعة سون" يأت-صن.

1-GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية تصميم استراتيجية

  1. تصميم GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية بربط القوات المسلحة البوروندية لمكافحة GPC3 (أنسنة GC3313) مع مكافحة CD16 فة14 (الشكل 1).
  2. توليف واستنساخ VH-CH1-CD16-فة وداء الليشمانيات الحشوي-CL في ناقلات pET26b و pET21a كما ذكر سابقا12.

2-التحول والثقافة

  1. إضافة 100 نانوغرام pET26b التي تحتوي على VH-CH1-CD16 (الشكل 1A) و 100 نانوغرام pET21a التي تحتوي على داء الليشمانيات الحشوي-CL (الشكل 1A) إلى 100 ميليلتر من BL21 المختصة الخلايا (DE3). يخلط جيدا واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 إينكوباتي في حمام مائي 42 درجة مئوية ل 45-90 s، نقل، واحتضان على الجليد لمدة 3-5 دقائق.
  2. إضافة 500 ميليلتر من ليسوجيني مرق (رطل) المتوسطة في أنبوب يحتوي على BL21 (DE3) الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة ل 45-60 دقيقة ثم انتشر 100 ميليلتر من BL21 الخلايا (DE3) على رطل-أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين ، وثم احتضانها في 37 درجة مئوية ح 12-16.
    1. إعداد متوسطة مرق (رطل) ليسوجيني: تريبتوني wt/المجلد 1%، 0.5% wt/المجلد استخراج خميرة، 1% wt/المجلد كلوريد الصوديوم.
  3. تلقيح خلايا من مستعمرة واحدة إلى 5 مل من مرق سوبر (SB) المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، والثقافة في 37 درجة مئوية، 220 لفة في الدقيقة، بين عشية وضحاها. ثم، تطعيم 1 مل ثقافة إلى 100 مل من بينالي الشارقة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والثقافة في 37 درجة مئوية، 220 لفة في الدقيقة ح 4. ثم قم بنقل 10 مل الثقافة إلى 1 لتر لبينالي الشارقة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والثقافة في 37 درجة مئوية، 220 لفة في الدقيقة.
    1. إعداد مرق سوبر المتوسطة: 3.2% wt/المجلد تريبتوني، 2% wt/المجلد استخراج الخميرة، 0.5% wt/المجلد كلوريد الصوديوم.
  4. عندما OD600 تصل إلى 0.6-0.8، إضافة الأيزوبروبيل-ب-د-الايثير-جالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي من 0.2 مم. الثقافة في 16 درجة مئوية، 180 لفة في الدقيقة ح 36-48 للتعبير بيريبلاسميك.

3-GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية تنقية بيريبلاسميك

  1. إعداد جزء بيريبلاسميك
    1. جمع الخلايا من سينتريفوجينج في س 4,000 ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل المتوسطة، وتزن الخلايا.
    2. ريسوسبيند الخلايا تماما في 4 مل محلول السكروز المثلج (20 من تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ 25 السكروز % (wt/المجلد) و 1 ملم يدتا) جرام من الخلايا، واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي في س 8,500 ز (الجدول أعلى أجهزة الطرد المركزي، ودوار الزاوية الثابتة)، 4 درجة مئوية 20 دقيقة إزالة المادة طافية (الكسر السكروز) وحفظه على الجليد.
    4. ريسوسبيند الكريات في مزيج من المثلج 5 مم مجكل2 و 1 مم من بمسف (4 مل في الخلايا غرام). إضافة 40 ميليلتر من مخزون lysozyme (15 ملغ/مل) كل غرام، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    5. الطرد المركزي في س 8,500 ز (الجدول أعلى أجهزة الطرد المركزي، ثابتة دوار زاوية)، 4 درجة مئوية عن 20 دقيقة نقل المادة طافية (الكسر بيريبلاسميك) وحفظه على الجليد.
    6. ضم على السكروز الكسر والكسر بيريبلاسميك، والطرد المركزي في س 30,000 ز، 4 درجة مئوية لإزالة الحد الأدنى 30 المادة طافية وحفظه في أنبوب 50 مل مخروطية على الجليد.
  2. ني-جاتا انجذاب تطهير
    1. ريسوسبيند 1 مل ني-جاتا [اغروس] عن طريق خلط دقيق لتحقيق وقف متجانسة وإزالة 1 مل ني-جاتا [اغروس] إلى أنبوب مخروطي طازجة 15 مل، وإضافة العمود 10 وحدات التخزين (CV) الموازنة العازلة (25 مم من تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ م 1 من كلوريد الصوديوم) حجته.
    2. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق، وإزالة المادة طافية بعناية. ثم، إضافة [اغروس] ني-الإدارة الوطنية للسياحة في أنبوب 50 مل تحتوي على السكروز الكسر والكسر بيريبلاسميك. صخرة في 4 درجات مئوية عن ح 2.
    3. الطرد المركزي المخلوط في ز 400 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 بعناية إزالة المادة طافية إلى آخر الأنبوب المثلج الطازجة كالجزء غير منضم. نقل في [اغروس] ني-الإدارة الوطنية للسياحة في عمود جاذبية.
    4. إضافة 10 السيرة الذاتية لغسل العازلة (25 مم من تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ م 1 من كلوريد الصوديوم؛ 20 مم، 30 مم أو عيار 40 ملم من ايميدازول) إلى العمود، وجمع الوت الكسر الغسيل.
      ملاحظة: ينبغي إضافة هذه الحلول في ترتيب زيادة تركيزات ايميدازول.
    5. إضافة 3 السيرة الذاتية شطف المخزن المؤقت (25 مم من تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ 300 ملم من كلوريد الصوديوم؛ 100 مم، 200 مم، 300 مم أو 400 مم من ايميدازول) إلى العمود وجمع الوت شطف جزء 1، 2، 3، و 4.
      ملاحظة: ينبغي إضافة هذه الحلول في ترتيب زيادة تركيزات ايميدازول.
    6. الغسيل الكلوي الكسور التيد في 2 لتر من برنامج تلفزيوني (ملم 137 من كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 ملم من Na2هبو4مم 2 خ2ص4، درجة الحموضة 7.4) باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي (12.4 كاتشين) عند 4 درجة مئوية حاء 2 التحقق من وجود GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية بنسبة 12 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ومن ثم تلوين أخذ الأزرق.
  3. CH1 مفتش انجذاب تطهير
    1. نقل 1 مل راتنج تقارب CH1 مفتش في أنبوب 50 مل مخروطية، وتغسل الخرز مع برنامج تلفزيوني أولاً. ثم إضافة الحل دياليزيد التي تحتوي على GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية بعد الخطوة 3.2.6. صخرة في 4 درجات مئوية عن ح 2.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية إلى آخر الأنبوب المثلج الطازجة، ونقل الراتنج إلى عمود جاذبية.
    3. إضافة 10 السيرة الذاتية للغسيل المخزن المؤقت (PBS) إلى العمود، وجمع شطف الكسر الغسيل.
    4. إعداد أنابيب جمع بإضافة 1 م للأس الهيدروجيني تريس 9.0 (0.1 مل الواحد مل من كل جزء التيد). الوت بالسيرة الذاتية 3 شطف العازلة (0.1 م جليكاين-HCl، pH 2.7)، وجمع الكسر التيد؛ كرر 3 مرات.
    5. الغسيل الكلوي الكسور التيد في 2 لتر من برنامج تلفزيوني باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي (12.4 كاتشين) عند 4 درجة مئوية حاء 2 كرر مرتين.
    6. تحديد تركيز البروتين بواسطة أولتراميكروسبيكتروفوتوميتير (معامل الانقراض المولى: 91105-1 A280 = 0.69 مغ/لتر).

4-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتحليل النشاف الغربية

  1. تأخذ 10 ميليلتر من العينة في 5 × الحزب الديمقراطي الصربي تحميل المخزن المؤقت ومزيج جيد. يغلي خليط البروتين عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. إعداد 5 × الحزب الديمقراطي الصربي تحميل المخزن المؤقت: 250 ملم من تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 10% wt/المجلد الحزب الديمقراطي الصربي، 0.5% wt/المجلد bromophenol blue، والغليسيرول المجلد/المجلد 50%، 5% المجلد المجلد/بيتا-ميركابتوثانول.
  2. إعداد جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع تحميل هلام (5 في المائة) وفصل هلام (12 ٪) كما هو موضح سابقا26،،من2728.
  3. تحميل 10 ميليلتر الخليط المغلي البروتين والبروتين ماركر، وتشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة.
  4. وصمة عار للهلام بالمصافحة لمدة 20 دقيقة مع أخذ الحل الأزرق الرائعة، ثم قم بتنفيذ ديستينينج.
  5. النشاف الغربية، بعد نقل إلى غشاء PVDF، كتلة الغشاء مع تبسة (20 مم من تريس-HCl، 150 مم من كلوريد الصوديوم، 0.1% المجلد/المجلد 20 توين) + 5% wt/المجلد المقشود حليب ح 1 في درجة حرارة الغرفة بينما تهتز.
  6. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (المضادة صاحب أو المضادة العلم) تضعف 1:2,000 في تبسة + اللبن المقشود 5% ح 1.
  7. يغسل مع تبسة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر 3 مرات.
  8. احتضان الغشاء في جسم الثانوي (الماوس المضادة المرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية جسم Fc) المخفف 1:2,000 في تبسة + اللبن المقشود 5% ح 1.
  9. يغسل مع تبسة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر 3 مرات.
  10. أضف 1 مل الركازة HPR كل الأفلام وتطوير واتخاذ الصور.

5-هلام الترشيح التحليل

  1. استخدام الأعمدة التالية: حجم العمود مل 24؛ المخزن المؤقت للموازنة لبرنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4؛ معدل التدفق من 0.5 مل/دقيقة في الغرفة المعتدلة؛ حجم العينة من 200 ميليلتر.
  2. استخدم التالي البروتين حجم وتركيز: 500 ميليلتر من 1.2 ملغ/مل GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية. الطرد المركزي في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة، وأن 200 ميليلتر لتحميل.
  3. لحجم علامة البروتين وتركيز، تأخذ 100 ميليلتر من السيتوكروم ج (2 ملغ/مل، كاتشين 12.4)، 140 ميليلتر من أنهيدراسي (3 ملغ/مل، كاتشين 29)، ميليلتر 140 الزلال (10 ملغ/مل، كاتشين 66) و 200 ميليلتر من نازعة الكحول (5 ملغ/مل، 150 كاتشين) في أنبوب واحد. الطرد المركزي في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة، وأن 200 ميليلتر لتحميل.
  4. قبل تشغيل كل، يغسل مع الأقل 2 السيرة الذاتية للماء المقطر بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة.
  5. حجته العمود مع الأقل 2 السيرة الذاتية للموازنة المخزن المؤقت (PBS، درجة الحموضة 7.4) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة.
  6. حقن العينة في 0.5 مل/دقيقة لتحميل النموذج تلقائياً.
  7. الوتي مع المخزن المؤقت للموازنة في 0.5 مل/دقيقة، وكشف في 280 و 215 شمال البحر الأبيض المتوسط.

6-التدفق الخلوي التحليل

  1. الثقافة في HepG2 Hep3B (GPC3 الإيجابية)، Huh7 (GPC3 الإيجابية)، (GPC3 إيجابية)، والخلايا مهكك-97 ح (GPC3 سلبية) في 100 ملم × 20 ملم الأطباق البلاستيكية التي تحتوي على دميم المتوسطة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين (100 ميكروغرام/مل) ستربتوميسين (50 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية، أول أكسيد الكربون 5%2.
  2. ثقافة تشو (GPC3 سلبية) الخلايا والخلايا تشو/GPC3 إيواء كدنا GPC3 البشرية كاملة الطول (GPC3 الإيجابية) في 100 ملم × 20 ملم أطباق بلاستيكية تحتوي على المتوسط RPMI 1640 مع 10% FBS والبنسلين (100 ميكروغرام/مل) ستربتوميسين (50 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  3. الثقافة NK92/CD16 إيواء كدنا CD16 البشرية كاملة الطول (CD16 الإيجابية) في 25 سم2 قارورة تحتوي على المتوسط RPMI 1640 مع 10% FBS والبنسلين (100 ميكروغرام/مل) ستربتوميسين (50 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  4. عندما تكون الخلايا روافد 70-90 ٪، تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 0.25% التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق (أو حتى تبدأ الخلايا لفصل من على سطح الأرض). أضف 1 مل متوسط النمو الكامل لتحييد التربسين وإعادة تعليق الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  5. عد الأرقام الخلية باستخدام هيموسيتوميتير نويباور والكشف عن صلاحية خلية قبل Blue تريبان.
  6. جمع 3 × 106 خلايا لكل خط الخلية. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني + 0.2% جيش صرب البوسنة لوقف إعادة الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في ز 200 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 كرر مرتين.
  7. أضف 0.3 مل من برنامج تلفزيوني + 0.2% جيش صرب البوسنة لوقف إعادة الخلايا، ونقل 100 ميليلتر (حوالي 1 مليون) لكل أنبوبة القاع المستديرة البوليستيرين 5 مل.
    ملاحظة: الرجاء التأكد من جميع الخطوات من هنا للأنابيب ينبغي أن تظل باردة على الجليد. عندما هو ملزم الجسم الخلية للمستضد السطحي، سوف تبدأ المجمع ﻻستيعاب. العملية بإبقائها الباردة، تباطأ إلى حد كبير.
  8. إضافة 10 ميليلتر من الأجسام المضادة الأولية (GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية أو البشرية IgG1، التركيز النهائي 5 ميكروغرام/مل) لكل أنبوبة، واحتضان على الجليد ح 1.
  9. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني + 0.2% جيش صرب البوسنة للمياه والصرف الصحي، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 كرر ثلاث مرات.
  10. إعادة تعليق في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + 0.2% جيش صرب البوسنة، ثم إضافة 0.5 ميليلتر من جسم الثانوي (الإنسان المضادة تركيز IgG(H+L)-488، والنهائي 10 ميكروغرام/مل) واحتضان على الجليد ﻫ 1. ملاحظة: من هذه الخطوة، الرجاء الحفاظ على الخلايا من الضوء.
  11. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني + 0.2% جيش صرب البوسنة للمياه والصرف الصحي، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 كرر ثلاث مرات.
  12. تحليل الخلايا بتدفق cytometer وفقا لبروتوكول قياسي29. الحصول على الخلايا مع ليزر 488 نانومتر للإثارة.

7-السامة للخلايا فحوصات

  1. إعداد الخلايا السرطانية.
    1. HepG2 الثقافة، Hep3B، Huh7، مهكك-97 ح، وتشو الخلية خطوط كما هو موضح في الخطوات 6، 1-6، 5.
    2. تمييع الخلايا إلى 0.5/mL5× 10، ولوحة 100 ميليلتر الخلايا (الخلايا 5,000 كل بئر) على ألواح 96-جيدا. الثقافة 6-8 (ح) السماح بإرفاق الخلايا.
  2. إعداد خلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى (ببمكس).
    1. تمييع الدم استعداد جديدة مع حجم متساو لبرنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع 10 مل دم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. تأخذ 15 مل من اللمفاويات فصل المتوسطة في أنبوب مخروطي طازجة 50 مل. نقل الدم المخفف على المتوسط فصل اللمفاويات على طول الجانب أنبوب ببطء.
      ملاحظة: الاحتفاظ الأنبوب عمودي. لا تكسر سطح المتوسطة فصل الخلايا اللمفاوية.
    3. الطرد المركزي في ز 400 x لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل قبالة.
    4. ببطء إزالة الطبقة العليا من البلازما، وأخذ الدم البيضاء الطبقة التي تحتوي على ببمكس في الواجهة المتوسطة فصل البلازما-اللمفاويات.
    5. تمييع ببمكس مع وحدة تخزين مزدوجة لبرنامج تلفزيوني + 2% FBS. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق.
    6. تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني + 2% FBS. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز للحد الأدنى 5 عد الأرقام الخلية كما هو موضح في الخطوة 6، 5.
  3. إعداد الخلايا ناغورني-كاراباخ.
    1. إعداد تعليق ببمكس بتركيز 5 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني + 2% FBS، ومكان لهم في أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل البوليستيرين.
    2. إضافة خلية بشرية ناغورني-كاراباخ كوكتيل الإثراء في 50 ميليلتر/مل من الخلايا. المزيج جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    3. ريسوسبيند المغناطيسي الجسيمات من ناغورني كاراباخ خلية طقم الإثراء، والمزيج جيدا التأكد من أنها هي شكل موحد أوقفته في بيبيتينج وأسفل بقوة أكثر من 5 مرات. نقل "الجسيمات المغناطيسية" ريسوسبينديد في 100 ميليلتر/مل إلى تعليق خلية. المزيج جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. جلب تعليق خلية ما يصل إلى إجمالي حجم 2.5 مل بإضافة برنامج تلفزيوني + 2% FBS. مزيج من الخلايا في الأنبوب بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات. ضع الأنبوب (بدون سقف) في المغناطيس. واسمحوا الخرز المغناطيسي يستقر 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. إزالة المغناطيس. في حركة مستمرة واحدة، عكس الأنبوب، صب قبالة تعليق التخصيب الخلية في أنبوب جديد.
    6. حساب عدد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 6، 5.
  4. قم بإعداد رد فعل السامة للخلايا.
    1. تمييع الخلايا ناغورني كاراباخ إلى × 10 55 خلايا/مل باستخدام المتوسط الثقافة المقابلة. إضافة 100 ميليلتر من ناغورني كاراباخ تعليق خلية إلى خلايا الورم مطلي على لوحة 96-جيدا.
    2. إضافة 10 ميليلتر من GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية بتركيزات مختلفة، مع أعلى جرعة بتركيز نهائي 30 ميكروغرام/مل، 3-fold تمييع، 9 نقطة (ثلاثة replicates).
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 72.
    4. بعد 72 ساعة حضانة، إزالة المتوسطة، وإضافة 100 ميليلتر من دميم المتوسطة التي تحتوي على 10 ميليلتر من كاشف CCK8 لكل بئر في لوحات 96-جيدا، ومن ثم احتضان عند 37 درجة مئوية.
    5. قراءة اللوحة في 450 نيوتن متر في 1، 2، 3 و 4 ح بعد إضافة الكاشف CCK8.
    6. تحليل البيانات. حساب معدل البقاء على قيد الحياة (OD450 GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية + المستجيب ورم -OD450 المتوسطة)/(OD450 ورم -OD450 المتوسطة) × 100% و (OD450 GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية + ورم -OD450 المتوسطة)/(OD450 ورم - OD450 المتوسطة) × 100%. خلايا المستجيب خلايا ناغورني-كاراباخ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تنقية GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية

GPC3--S-القوات المسلحة البوروندية تمت تنقيته من كولاي بتنقية تقارب خطوتين، أولاً مع ني-جاتا-[اغروس]، تليها CH1 مفتش انجذاب تطهير. بعد تنقية تقارب خطوتين، تمت تنقيته GPC3-S-القوات المسلحة البورون...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقدم في هذه الدراسة، وضع استراتيجية لبناء شكل جديد من بسابس، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، التي يمكن أن تجند خلايا ناغورني كاراباخ استهداف الخلايا السرطانية إيجابية GPC3. S-القوات المسلحة البوروندية يستند إلى القوات المسلحة البوروندية الطبيعية تنسيق عن طريق إضافة مكافحة CD16 فة11<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل ماليا والتطوير د خطة لمقاطعة قوانغدونغ (الصين العلاقات العامة) (2016A050503028).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Shaking incubatorThermo FisherMAXQ 4000
Shaking incubatorZhichengZWYR-D2402
CentrifugeCenceGL-10MD
CentrifugeBeckman coulterAvanti j-26S XPI
Centrifugeeppendorf5810R
Ultraviolet spectrophotometerThermo FisherNanodrop
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatusMini-PROTEAN® TetraBio-rad
Trans-blot apparatusCriterionBio-rad
Imaging systemBio-radchemidoc tm XRS+
Fast Protein Liquid chromatogramGE HealthcareAKTA avant
GF columnGE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow CytometerBeckman coulterFC500
Centrifugeeppendorf5702R
Envision plate readerTECANInfinite F50
Anti His-tageBioscience14-6657-82
anti-Flag-tagSigmaF1804
anti-human(H&L)-488A11013Invitrogen
Anti-mouse IgG HRP-linked antibodyCell Signaling7076S
Ni-NTA-AgaroseTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 affinity resinThermo Fisher194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
NK cell enrichment kitStemcell19055
MagnetStemcell18000
CCK8 kitDojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF2442
TrypsinGibco15050-057
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Cell culture
Standard markerSigma AldrichMWGF200Gel filtration
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)VWR chemicalsVWRC0487-100G
Dialysis tubingSigma AldrichD0655-100FT
KnanamycineVWRVWRC0408-100G
AmpicillinVWRVWRC0339-100G
TryptoneThermo FisherLP0042B
Yeast ExtractThermo FisherLP0021B
NaClSangon BiotechA100241
Trizma baseSigma AldrichT6791-1KG
EDTASigma AldrichV900106
GlycinealaddinA110752-500g
KClaladdinP112134-500g
MgClSigma AldrichV900020
AgarSangon BiotechA505255-0250
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)VWR7778-77-0
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-MercaptoethanolVWR60-24-2
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)VWR329-98-6
LysozymeSigma AldrichL6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250VWRVWRC0472-50G
Bromophenol blueSangon BiotechA500922-25G
Bovine Serum Albumin (BSA)VWRVWRC0332-100G
GlycerolSigma AldrichV900122
100mm x 20mm plastic dishCorning430167
25cm2 flaskCorning430639
96 well cell culture clusterCorning3599
SucroseSangon BiotechA610498-0005
CHOthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesGNHa 3
MHCC-97Hthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesSCSP-528
HepG2the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu 72
Huh7the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu182
Hep3Bthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu106
NK92ATCCCRL2408

References

  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
  3. Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
  4. Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
  5. Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
  6. Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
  7. Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
  8. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  9. Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).
  10. Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).
  11. Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
  12. Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32(2016).
  13. Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
  14. Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
  15. Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
  16. Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
  17. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  18. Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
  19. Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
  20. Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
  21. Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
  22. Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
  23. Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
  24. Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
  25. Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
  26. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  27. Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  29. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137 GPC3 S GPC3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved