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摘要

在此, 我们提出了一种在大肠杆菌中产生双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的协议.纯化 GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性肝癌细胞具有较强的细胞毒性作用。

摘要

该协议描述了双特异性抗体 (bsAb) 的构建和功能研究, GPC3-S-Fab。bsAbs 可以通过两个不同的手臂识别两个不同的表位。bsAbs 已积极研究他们的能力, 直接招募免疫细胞杀死肿瘤细胞。目前, 大多数 bsAbs 是以重组蛋白的形式生产的, 它们要么是含有 fc 的 bsAbs, 要么是没有 fc 区域的较小的 bsAb 衍生物。本研究通过将 anti-GPC3 抗体 GC33 与 anti-CD16 单域抗体相结合, 设计了一种基于抗体片段 (GPC3-S-Fab) 的双特异性抗体。GPC3-S-Fab 可在大肠杆菌中表达, 并经两种亲和 chromatographies 纯化。纯化的 GPC3-S-Fab 可以通过招募自然杀伤细胞来明确地结合和杀死 GPC3 阳性肝癌细胞, 这表明 GPC3-S-Fab 在肝癌治疗中的潜在应用。

引言

单克隆抗体现在广泛用于癌症治疗1。由于抗体的柔韧性, 各种基于抗体的格式已经得到了积极的探索。与单克隆抗体相比, bsAbs 有两种不同的抗原结合模块, 能够同时识别两个不同靶点, 有效地触发免疫效应细胞的招募, 以靶向和杀死肿瘤细胞2。

当前的重组 bsAb 格式通常可以分配给两个类: fc 包含 bsAbs 和 bsAbs, 而没有 fc 区域。与大多数哺乳动物细胞中所含 fc 格式相比, 没有 fc 区域的 bsAbs 具有较小尺寸的优点, 更容易在微生物表达系统中产生, 并且能更有效地穿透肿瘤组织。3。

没有 Fc 区域的 bsAbs 通常是通过链接单个绑定基团 (如单链变量片段 (scFvs) 或3) 来形成的。如果没有稳定的域, 基于抗体碎片的 bsAbs 通常会损害热稳定性、低溶解度或增加聚集4、5的潜力。相比之下, 以 bsAbs 为基础的 heterodimerization, 由于 CH1 和 CL 在原生的晶圆4,6, 更稳定。

由重链抗体 (VHHs, 也称为单域抗体) 的可变域是天然重链抗体的活性抗原结合片段7。VHHs 具有亲和力高、常规 IgGs8特异性强、免疫原化低、细菌表达率高的特点9。与抗体片段相比, VHHs 具有较高的热稳定性10。与基团相比, VHHs 的尺寸较小, 因为缺乏 CH1 和 CL。因此, 通过将 bsAb 与单域抗体、VHH 相连接获得的 S 型, 设计并研究了其抗肿瘤作用11、12。

本文介绍了 hGC3313与 anti-CD16a VHH14相结合的 GPC3-S-Fab 结构。周质在大肠杆菌(大肠杆菌)中的表达能有效地产生 GPC3-S-Fab。GPC3-S-Fab 的功能性研究表明 GPC3-S-Fab 是肝癌治疗的一个有前途的策略。因此, GPC3-S-Fab 在替代技术上的优势和适用于以前研究的参考, 包括易于生产和纯化, 以及更稳定的 bsAbs。

哺乳动物表达系统和原核表达系统已被用来表达各种形式的 BsAbs。与哺乳动物表达系统相比,大肠杆菌蛋白表达系统具有产量高、成本低、省力、遗传操作方便、转化效率高15的优点。对于 bsAbs 在大肠杆菌中的表达, 有两种基本策略: 细胞质中的表达和细胞质与外细胞膜之间 periplasm 的表达15。与细胞质的还原环境相比, periplasm 是一种比较氧化的环境, 促进了蛋白质16的正确折叠和共表达。正确的折叠对 bsAbs 的溶解度、稳定性和功能生成起着关键的作用。因此, 在 s--政局的 N 端添加了一个信号序列, 直接分泌到大肠杆菌的 periplasm17。为了确保正确的折叠、溶解度、热稳定性和构象稳定性, 减少抗体的复杂性和大小经常被使用16。S-晶圆的格式包括一个工厂和一个 VHH, 这是表达很好的细菌系统可能由于简单的结构和小规模。

GPC3 是在这种 GPC3-S-Fab 双特异性抗体格式中选择的。Glypican-3 (GPC3) 是肝素硫酸盐 (HS) 蛋白多糖家族的成员, 通过 glycosylphosphatidylinositol (GPI)18锚定在细胞表面。GPC3 是抗原70% 肝癌 (HCC) 病例, 占大多数肝癌19,20,21,22。由于 GPC3 在正常组织中很少表达, GPC3 被建议为肝癌的潜在靶向。对 GPC3 产生了多个鼠标抗体。然而, 只有 GC33 显示有限的抗肿瘤活动22, 它没有表现出临床疗效的病人。在这项研究中, GPC3-S-Fab 被证明能够招募 NK 细胞杀死 GPC3 肿瘤细胞14。

为了招募 NK 细胞, 使用了 anti-CD16 VHH。CD16a 是一种低亲和 IgG 受体, 主要表现为自然杀伤细胞、巨噬素、单核和 T 细胞的某些亚型。它涉及抗体依赖性细胞细胞毒性 (ADCC) 的 NK 细胞23。人 NK 细胞可分为两类, CD56-CD16+ 和 CD56+CD16。与 CD56+CD16− nk 细胞相比, CD56-CD16+ nk 细胞可以释放出更高水平的穿孔和颗粒酶 B, 从而呈现出强烈的细胞毒性24。枯否细胞 (KCs), 表达 CD16a, 是肝脏中的巨细胞。枯否细胞在25肝癌的抑癌中起着重要作用。因此, bsAbs 靶向 CD16a 可能是一个更有希望的策略比接触 T 细胞对抗肝癌。

研究方案

所有的程序, 包括人的血液收集被孙中山大学伦理委员会批准。

1. GPC3-S-Fab 设计策略

  1. 设计 GPC3-S-Fab 通过链接一个 anti-GPC3 (人性化的 GC3313) 与 anti-CD16 VHH14 (图 1)。
  2. 将 VH-CH1-CD16-VHH 和 pET26b 和 pET21a 载体合成并克隆为先前报告的12。

2. 变革和文化

  1. 将含有 VH-CH1-CD16 (图1A) 和 100 pET26b 的 pET21a 的 100 ng 添加到100µL 的主管BL21 (DE3) 细胞中。拌匀, 在冰上孵育30分钟, 在42摄氏度的水浴中孵化 45-九十年代, 转移, 并在冰上孵化 3-5 分钟。
  2. 将500µL 溶源性汤 (磅) 培养基放入含有 BL21 (DE3) 细胞的管中, 然后在37摄氏度处孵化, 150 rpm 45-60 分钟100µL 的 BL21 (DE3) 细胞在含有50µg/毫升卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林的 LB 琼脂板上的分布, 然后孵育37°c 12-16 小时。
    1. 准备溶源性肉汤 (磅) 培养基: 1% 磅/卷胰蛋白胨, 0.5% 磅/卷酵母萃取物, 1% 磅/卷氯化钠。
  3. 接种细胞从一个单一的殖民地成5毫升的超级汤 (锑) 培养基含有50µg/毫升卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林, 和文化在37摄氏度, 220 rpm, 一夜之间。然后, 将1毫升的培养物接种到100毫升的锑培养基中, 其中含有50µg卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林, 培养在37摄氏度, 220 rpm 为 4 h。然后, 将10毫升的培养物转移到1升的锑培养基中, 含卡那霉素50 µg/毫升,氨苄西林100 µg/毫升, 培养37摄氏度, 220 rpm。
    1. 准备超级肉汤培养基: 3.2% 胰蛋白胨/卷, 2% 个/卷酵母萃取物, 0.5% 个/卷氯化钠。
  4. 当外径600达到 0.6-0.8, 加入异丙基 d-硫 galactopyranoside (IPTG) 到最终浓度为0.2 毫米。文化在16°c, 180 转每分钟为 36-48 h 为周质表示。

3. GPC3-S-Fab 周质纯化

  1. 周质分数准备
    1. 收集细胞通过离心在 4000 x g, 4 °c 30 分钟, 丢弃培养基, 并权衡细胞。
    2. 并用重悬在4毫升的冰冷蔗糖溶液 (20 毫米的三盐酸, pH 7.5; 25% (重量/卷) 蔗糖和1毫米 EDTA) 每克细胞, 并在冰上孵育15分钟。
    3. 离心机在 8500 x g (桌上部离心机, 固定的角度转子), 4 °c 为20分钟. 去掉上清 (蔗糖分数) 并将其保存在冰上。
    4. 并用重悬在冰冷的5毫米氯化镁2和1毫米的 PMSF (每克细胞4毫升) 混合的颗粒。添加40µL 的溶菌酶的股票 (15 毫克/毫升) 每克, 并在冰上孵化30分钟。
    5. 离心机在 8500 x g (桌上部离心机, 固定角度转子), 4 °c 为20分钟. 转移上清 (周质分数), 并保存在冰上。
    6. 结合蔗糖分数和周质分数, 离心机在 3万 x g, 4 °c 30 分钟. 取出上清, 并将其保存在冰上的50毫升锥形管中。
  2. 镍 NTA 亲和纯化
    1. 并用重悬1毫升的镍 NTA 琼脂糖通过混合彻底达到均匀悬浮, 除去1毫升的镍 NTA 琼脂糖到一个新鲜的15毫升圆锥管, 并增加10柱容积 (CV) 平衡缓冲 (25 毫米的三 HCl, pH 7.5; 1 米氯化钠) 到平衡。
    2. 离心机在 400 x g 的5分钟, 并仔细清除上清。然后, 将镍 NTA 琼脂糖加入含有蔗糖分数和周质分数的50毫升管中。岩石在4°c 为 2 h。
    3. 离心机的混合物在 400 x g, 4 °c 为5分钟. 小心地将上清液移至另一条新鲜冰冷的管子作为未绑定的分数。将镍 NTA 琼脂糖转移到重力柱上。
    4. 添加10个洗涤缓冲器 (25 毫米的三盐酸, pH 7.5; 1 米的氯化钠; 20 毫米, 30 毫米或40毫米咪唑) 到列, 并收集洗脱作为洗涤分数。
      注意: 这些解决方案应添加到增加咪唑浓度的顺序。
    5. 添加3个洗脱缓冲液 (25 毫米的三盐酸, pH 7.5; 300 毫米氯化钠; 100 毫米, 200 毫米, 300 毫米或400毫米咪唑) 到专栏并且收集洗脱作为洗脱分数 1, 2, 3 和4。
      注意: 这些解决方案应添加到增加咪唑浓度的顺序。
    6. 透析洗脱2升的 PBS (137 毫米氯化钠, 2.7 毫米的氯化钾, 10 毫米的 Na2HPO4, 2 毫米的第 2 PO4,pH 7.4) 使用透析油管 (12.4 kDa) 在4°c 为 2 h. 检查是否存在 GPC3-S-Fab 由 12% SDS 页, 然后通过考马斯蓝染色。
  3. IgG-CH1 亲和纯化
    1. 将1毫升的 IgG-CH1 亲和树脂转化为50毫升圆锥管, 首先用 PBS 清洗珠子。然后, 在步骤3.2.6 后添加包含 GPC3-S-Fab 的透析解决方案。岩石在4°c 为 2 h。
    2. 离心机在 400 x g 为5分钟, 4 °c。小心地将上清液移到另一条新鲜冰冷的管子上, 将树脂转移到重力柱上。
    3. 将洗涤缓冲器 (PBS) 的10个 CV 添加到柱上, 并将洗脱作为洗涤分数。
    4. 通过添加1米的三 pH 值 9.0 (每个洗脱分数的每毫升0.1 毫升) 准备收集管。洗脱 3 CV 洗脱缓冲器 (0.1 米甘氨酸盐酸盐, pH 2.7), 并收集洗脱分数;重复3次。
    5. 用透析油管 (12.4 kDa) 在4摄氏度洗脱2升的 PBS 进行透析. 重复两次。
    6. 用 ultramicrospectrophotometer 测定蛋白质浓度 (摩尔消光系数: 91105. 1 A280 = 0.69 毫克/升)。

4. SDS 页和西方印迹分析

  1. 将10µL 的样品放入 5x SDS 加载缓冲器中, 混合均匀。将蛋白质混合物煮沸100摄氏度, 5 分钟。
    1. 准备 5x SDS 装载缓冲器: 250 毫米的三盐酸, pH 值 6.8, 10% 量/卷 SDS, 0.5% 溴酚/卷蓝色, 50% 卷/卷甘油, 5% 卷/卷 beta 巯基乙醇。
  2. 准备一个 SDS 页凝胶与加载凝胶 (5%) 和分离凝胶 (12%), 如前所述26,27,28。
  3. 加载10µL 的煮蛋白质混合物和蛋白质标记, 并运行 SDS 页。
  4. 用考马斯亮蓝溶液晃动20分钟, 然后执行脱色。
  5. 对于西方印迹, 转移到 PVDF 膜后, 用 TBST (20 毫米的三 HCl、150毫米氯化钠、0.1% 卷/卷补 20) + 5% 小时脱脂牛奶在室温下, 在震动时将膜堵塞。
  6. 用原抗体 (反他或反旗) 孵育膜, 稀释 1:2, 000 TBST + 5% 脱脂奶1小时。
  7. 在室温下用 TBST 洗5分钟, 重复3次。
  8. 在二级抗体中孵化膜 (与酶联的抗小鼠 Fc 抗体) 稀释 1:2, 000 TBST + 5% 脱脂牛奶1小时。
  9. 在室温下用 TBST 洗5分钟, 重复3次。
  10. 每片添加1毫升 HPR 基片, 开发并拍摄图像。

5. 凝胶过滤分析

  1. 使用以下栏: 列容积为24毫升;PBS pH 值7.4 的平衡缓冲器;室温下0.5 毫升/分的流动速率;样品体积为200µL。
  2. 使用以下蛋白质体积和浓度: 500 µL 1.2 毫克/毫升 GPC3-S-Fab。离心机在 2万 x g 30 分钟, 并采取200µL 加载。
  3. 对于蛋白质标记的体积和浓度, 采取100µL 细胞色素 C (2 毫克/毫升, 12.4 kDa), 140 µL 的酸酐酶 (3 毫克/毫升, 29 kDa), 140 µL 的白蛋白 (10 毫克/毫升, 66 kDa) 和200µL 酒精脱氢 (5 毫克/毫升, 150 kDa) 成一管。离心机在 2万 x g 30 分钟, 并采取200µL 加载。
  4. 每次运行前, 以0.5 毫升/分钟的流速清洗至少2的蒸馏水。
  5. 平衡至少有 2 CV 的平衡缓冲器 (PBS, pH 值 7.4), 流速为0.5 毫升/分钟。
  6. 自动注入0.5 毫升/分钟的样品来装载样品。
  7. 洗脱与平衡缓冲器在0.5 毫升/分钟, 并检测在280和 215 nm。

6. 流式细胞仪分析

  1. 文化 HepG2 (GPC3 阳性), Hep3B (GPC3 阳性), Huh7 (GPC3 阳性), MHCC-97H (GPC3 阴性) 细胞在100毫米 x 20 毫米的塑料菜肴含有 DMEM 培养基10% 胎牛血清 (血清), 青霉素 (100 µg/毫升) 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37°c,5% CO2。
  2. 培养的 CHO (GPC3 阴性) 细胞和 CHO/GPC3 细胞窝藏全长人类 GPC3 cDNA (GPC3 阳性) 在100毫米 x 20 毫米塑料菜肴含有 RPMI 1640 培养基10% 血清, 青霉素 (100 µg/毫升), 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37摄氏度, 5% CO2。
  3. 在 25cm2瓶含有 RPMI 1640 培养基10% 血清, 青霉素 (100 µg/毫升), 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37摄氏度, 5% CO2的 NK92/CD16 中, 培养全长人 CD16 cDNA (CD16 阳性)。
  4. 当细胞 70-90% 汇合时, 丢弃培养基, 用2毫升的 PBS 冲洗细胞。添加1毫升0.25% 胰蛋白酶和孵育37°c 2-3 分钟 (或直到细胞开始从表面分离)。添加1毫升的完全生长培养基, 以中和胰蛋白酶和重新暂停细胞通过轻轻吹打上下。
  5. 用 Neubauer hemocytometer 计数细胞数, 用台盼蓝检测细胞活力。
  6. 为每个细胞线收集 3 x 106细胞。添加1毫升 PBS + 0.2% BSA, 以重新悬浮细胞。离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复两次。
  7. 添加0.3 毫升 PBS + 0.2% BSA, 以重新悬浮细胞, 并转移100µL (约 100万) 到每5毫升聚苯乙烯圆底管。
    注意: 请确保从这里到管道的所有步骤都应在冰上保持冷。当抗体与细胞表面抗原结合时, 复合体将开始内部化。通过保持寒冷, 这个过程会大大减慢。
  8. 添加10µL 的主要抗体 (GPC3-S-Fab 或人类 IgG1, 最终浓度5µg/毫升) 每管, 并在冰上孵化1小时。
  9. 添加1毫升 PBS + 0.2% BSA 清洗, 离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复三次。
  10. 在100µL 的 PBS + 0.2% BSA 中重新暂停, 然后添加0.5 µL 的二级抗体 (抗人 IgG (H + L)-488, 最后浓度10µg/毫升) 和在冰上孵育1小时. 注: 从这一步, 请保持细胞不受光线的影响。
  11. 添加1毫升 PBS + 0.2% BSA 清洗, 离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复三次。
  12. 根据标准协议29, 用流式细胞仪对单元进行分析。用488纳米激光获取细胞激发。

7. 细胞毒性化验

  1. 准备肿瘤细胞。
    1. 文化 HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC-97H 和 CHO 细胞系, 如步骤 6.1-6.5 所述。
    2. 稀释细胞到 0.5 x 105/毫升, 和板材100µL 细胞 (每井5000个细胞) 在96井板材。文化 6-8 h 允许细胞附加。
  2. 制备人外周血单个核细胞 (PBMCs)。
    1. 用50毫升锥形管中的 PBS, 稀释新鲜的准备好的血液。例如, 用10毫升的 PBS 稀释10毫升血液。
    2. 将15毫升淋巴细胞分离培养基转化为新鲜的50毫升圆锥管。慢慢将稀释后的血液转移到淋巴细胞分离培养基上。
      注意: 保持管子垂直。不要破坏淋巴细胞分离培养基的表面。
    3. 离心机在 400 x g 为35分钟在室温下与刹车。
    4. 慢慢移除上血浆层, 并采取在血浆淋巴细胞分离培养基界面中含有 PBMCs 的白血层。
    5. 稀释 PBMCs 的双卷 PBS + 2% 的血清。离心机在 400 x g 5 分钟。
    6. 用 PBS + 2% 的血清冲洗细胞两次。离心机在 400 x g 的5分钟. 计算步骤6.5 中所述的单元格数。
  3. 准备 NK 细胞。
    1. 准备 PBMCs 悬浮在 5 x 107细胞/毫升的 PBS + 2% 的血清, 并把它们放在一个5毫升聚苯乙烯圆底管。
    2. 添加人类 NK 细胞浓缩鸡尾酒在50µL/毫升细胞。混合好, 室温孵育10分钟。
    3. 从 NK 细胞浓缩试剂盒中并用重悬磁性颗粒, 混合均匀, 确保吹打向上和向下一致悬浮5倍以上。将悬浮磁性粒子转移到100µL/毫升到细胞悬浮。混合好, 室温孵育5分钟。
    4. 通过增加 PBS + 2% 的血清, 使细胞悬浮量达到2.5 毫升的总体积。通过轻轻吹打 2-3 倍, 将管中的细胞混合在一起。把管子 (没有盖子) 放进磁铁里。让磁性珠子在室温下安定下来2.5 分钟。
    5. 卸下磁铁。在一个连续的运动中, 将管子倒置, 将富细胞悬浮液倒入新管中。
    6. 按步骤6.5 中的说明计算单元格数。
  4. 建立细胞毒性反应。
    1. 使用相应的培养基将 NK 细胞稀释为 5 x 105细胞/毫升。将 NK 细胞悬浮液中的100µL 添加到96井板上镀的肿瘤细胞中。
    2. 添加10µL 的 GPC3-S-Fab 在不同浓度, 最高剂量的最终浓度为30µg/毫升, 3 倍稀释, 9 点 (三复制)。
    3. 孵育在37°c, 5% CO2为 72 h。
    4. 经过72小时的孵化, 去除培养基, 并添加100µL 的 DMEM 培养基含有10µL 的 CCK8 试剂, 每个井在96井板, 然后孵化在37摄氏度。
    5. 添加 CCK8 试剂后, 在1、2、3和 4 h 上读出 450 nm 的板材。
    6. 分析数据。计算存活率为 (OD450 GPC3-S-Fab + 效应 + 肿瘤OD450培养基)/(OD450肿瘤-OD450培养基) x 100% 和 (OD450 GPC3-S-Fab + 肿瘤-OD450培养基)/(OD450肿瘤-OD450中等) x 100%。效应细胞为 NK 细胞。

结果

GPC3-S-Fab 净化

GPC3-S-Fab 从大肠杆菌中纯化, 经两步亲和纯化, 先用镍 NTA 琼脂糖, 其次 IgG-CH1 亲和纯化。两步亲和纯化后, GPC3-S-Fab 被纯化为同质性, 两链接近 1:1 (图 2A)。VH-CH1-CD16 VHH 和 cl 多肽的存在可以通过它们独特的 C 终端标记来识别, 反他的大约 25 kDa, 以及 VH-CH1-VHH 大约 38 kDa 的反旗 (...

讨论

在这项研究中, 我们提出了一个新的格式 bsAbs, GPC3-S-Fab, 它可以招募 NK 细胞靶向 GPC3 阳性肿瘤细胞。s-工厂是基于自然的晶圆格式, 添加一个 anti-CD16 VHH11,12。与含 Fc 区的 bsAbs 相比, GPC3-S-Fab 可以很容易地在细菌 periplasm 中产生。

利用该协议中描述的表达式和纯化策略, 得到了大量的可溶性和功能 GPC3-S-Fab。为便于周质表达, 政局在 N 终...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了广东省 (2016A050503028) 研究 & 开发计划的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Shaking incubatorThermo FisherMAXQ 4000
Shaking incubatorZhichengZWYR-D2402
CentrifugeCenceGL-10MD
CentrifugeBeckman coulterAvanti j-26S XPI
Centrifugeeppendorf5810R
Ultraviolet spectrophotometerThermo FisherNanodrop
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatusMini-PROTEAN® TetraBio-rad
Trans-blot apparatusCriterionBio-rad
Imaging systemBio-radchemidoc tm XRS+
Fast Protein Liquid chromatogramGE HealthcareAKTA avant
GF columnGE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow CytometerBeckman coulterFC500
Centrifugeeppendorf5702R
Envision plate readerTECANInfinite F50
Anti His-tageBioscience14-6657-82
anti-Flag-tagSigmaF1804
anti-human(H&L)-488A11013Invitrogen
Anti-mouse IgG HRP-linked antibodyCell Signaling7076S
Ni-NTA-AgaroseTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 affinity resinThermo Fisher194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
NK cell enrichment kitStemcell19055
MagnetStemcell18000
CCK8 kitDojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF2442
TrypsinGibco15050-057
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Cell culture
Standard markerSigma AldrichMWGF200Gel filtration
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)VWR chemicalsVWRC0487-100G
Dialysis tubingSigma AldrichD0655-100FT
KnanamycineVWRVWRC0408-100G
AmpicillinVWRVWRC0339-100G
TryptoneThermo FisherLP0042B
Yeast ExtractThermo FisherLP0021B
NaClSangon BiotechA100241
Trizma baseSigma AldrichT6791-1KG
EDTASigma AldrichV900106
GlycinealaddinA110752-500g
KClaladdinP112134-500g
MgClSigma AldrichV900020
AgarSangon BiotechA505255-0250
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)VWR7778-77-0
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-MercaptoethanolVWR60-24-2
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)VWR329-98-6
LysozymeSigma AldrichL6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250VWRVWRC0472-50G
Bromophenol blueSangon BiotechA500922-25G
Bovine Serum Albumin (BSA)VWRVWRC0332-100G
GlycerolSigma AldrichV900122
100mm x 20mm plastic dishCorning430167
25cm2 flaskCorning430639
96 well cell culture clusterCorning3599
SucroseSangon BiotechA610498-0005
CHOthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesGNHa 3
MHCC-97Hthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesSCSP-528
HepG2the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu 72
Huh7the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu182
Hep3Bthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu106
NK92ATCCCRL2408

参考文献

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