JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.

Özet

Bu iletişim kuralı İnşaat ve bispecific antikor (bsAb), GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları açıklanmaktadır. bsAbs iki farklı kolları aracılığıyla iki farklı epitopları tanıyabilir. bsAbs aktif olarak yeteneklerini doğrudan bağışıklık hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için recruit için inceledik. Şu anda, bsAbs çoğunluğu rekombinant proteinler, Fc içeren bsAbs olarak veya daha küçük bsAb türevleri Fc bölge olmadan şeklinde üretilmektedir. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab, bir antikor parçası (Fab) tabanlı bispecific antikor anti-GPC3 antikor GC33 bir anti-CD16 tek etki alanı antikor ile Fab bağlama tarafından tasarlanmıştır. GPC3-S-Fab Escherichia coli ifade edilen ve iki benzeşme chromatographies tarafından arıtılmış. Saf GPC3-S-Fab özellikle bağlamak ve GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerini öldürmek doğal katil hücreler, işe alma tarafından GPC3-S-Fab potansiyel bir uygulama karaciğer kanseri tedavisi öneriyor.

Giriş

Monoklonal antikor şimdi geniş kanser tedavi1için kullanılır. Antikorlar esneklik nedeniyle çeşitli antikor tabanlı biçimler aktif olarak keşfedilmeyi. Monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında, bsAbs iki farklı hedefler aynı anda ve verimli bir şekilde hedef ve tümör hücreleri2öldürmek için bağışıklık efektör hücreleri alımı tetiklemek tanımasını sağlayarak iki farklı antijen bağlayıcı modülleri var.

Geçerli rekombinant bsAb biçimleri genellikle iki sınıf için atanmış: Fc içeren bsAbs ve bsAbs bir Fc bölge olmadan. Çoğunlukla memeli hücrelerinde üretilir Fc içeren biçimleri ile karşılaştırıldığında, bsAbs olmadan bir Fc bölge daha küçük boyutları, avantajları daha kolay mikroorganizma ifade sistemlerinde üretilen ve tümör doku daha verimli bir şekilde nüfuz 3.

bsAbs bir Fc bölge olmadan genellikle tek-zinciri değişken parçaları (scFvs) veya Fabs3gibi bireysel bağlama moieties bağlayarak meydana gelir. Olmadan teskin etki, scFv parçaları genellikle dayalı bsAbs termal kararlılık, düşük çözünürlük veya toplama4,5için artan bir potansiyel tehlikeye. Buna ek olarak, Fab-esaslı bsAbs CH1 ve CL heterodimerization yerli Fab yan4,6' nedeniyle daha istikrarlı.

Değişken etki alanından ağır zinciri yalnızca antikorlar (VHHs, tek etki alanı antikor da bilinir) doğal ağır zincir antikorlar7aktif antijen bağlayıcı parçası vardır. VHHs yüksek afinite özellikleri, geleneksel IgGs8, düşük immünojenisite ve yüksek verim özgüllük bakteriyel ifade9' var. FV parçaları ile karşılaştırıldığında, VHHs daha yüksek termal kararlılık10var. Fab moieties ile karşılaştırıldığında, VHHs daha küçük boyutları nedeniyle CH1 ve CL eksikliği var. Böylece, S-Fab, Fab bir tek etki alanı antikor, VHH, ile bağlantı kurarak elde bsAb biçiminde tasarlanmış ve onun anti-tümör etkisi11,12için okudu.

Bu çalışmada, GPC3-S-Fab inşaatı hGC3313 ile bir anti-CD16a VHH14 Fab bağlama tarafından tanımlanmıştır. GPC3-S-Fab, verimli bir şekilde periplasmic ifade Escherichia coli (e.coli)içinde üretilmektedir. GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları GPC3-S-Fab karaciğer kanseri tedavisi için umut verici bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Böylece, GPC3-S-Fab avantajları alternatif teknikleri ile ilgili başvuruları önceki çalışmalarda kolay üretim ve arıtma ve daha istikrarlı bsAbs içerir.

Memeli ifade ve prokaryotik ifade sistemler BsAbs çeşitli biçimlerde ifade etmek için kullanılmaktadır. Memeli ifade sistemleri, E. coliaksine-tabanlı protein ifade sistemlerine sahip pek çok faydaları, yüksek verim, düşük maliyetli ve emek tasarrufu, genetik manipülasyon ve yüksek dönüşüm verimliliği15kolaylığı dahil olmak üzere. E. colibsAbs ifade için iki temel strateji vardır: sitoplazma ve sitoplazma ve dış hücre zarlarında15arasında periplasm ifadede ifade. Sitoplazma azaltarak çevreye, periplasm bir daha oksitleyici doğru katlanır teşvik çevre ve proteinler16ortak ifade karşılaştırılır. Doğru katlanır çözünürlük, istikrar ve işlev bsAbs üretiminde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bir sinyal sıra pelB periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için S Fab N-terminus eklendi. Emin olmak için doğru katlanır, çözünürlük, termal kararlılık ve konformasyon istikrar, karmaşıklığı ve bir antikor boyutunu azaltarak sık16istihdam. S-Fab biçimi bir Fab ve bakteriyel sistemlerinde basit yapısı ve küçük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla çok iyi ifade edilen bir VHH oluşur.

GPC3 bu GPC3-S-Fab bispecific antikor biçimde seçildi. Glypican-3 (GPC3) ile glycosylphosphatidylinositol (GPI)18hücre yüzeyine demirli heparin sülfat (HS) proteoglikan ailesinin bir üyesidir. GPC3 karaciğer kanserleri19,20,21,22çoğunluğu için hangi hesabı % 70 hepatosellüler karsinom (HCC) olguların overexpressed. GPC3 nadiren normal dokulara ifade edilir çünkü GPC3 HCC için potansiyel bir hedef teklif edildi. Birden çok fare mAbs GPC3 karşı üretilen. Ancak, sadece GC33 sınırlı anti-tümör faaliyet 22sergiledi ve bu hastalarda klinik etkinlik sergilemek için başarısız oldu. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab NK hücreleri GPC3 tümör hücreleri14öldürmek için recruit edebilmek için gösterildi.

NK hücreleri toplamak için anti-CD16 VHH kullanıldı. CD16a esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar, monosit ve bazı alt türlerinden T hücrelerinin üzerinde ifade bir düşük benzeşme IgG reseptör var. NK hücreleri23tarafından antikor bağımlı hücre sitotoksisite (CCDA) ilgilenmektedir. İnsan NK hücreleri iki türe, CD56 kategorize - CD16 + ve CD56 + CD16-. CD56 + CD16− NK hücreleri, CD56 aksine-CD16 + NK hücreleri serbest bırakmak daha yüksek düzeyde perforin ve granzyme B ve böylece güçlü sitotoksisite24mevcut. CD16a, ifade Kupffer hücreleri (KCs), karaciğerde ikamet makrofajlar vardır. Kupffer hücreleri karaciğer kanseri25bastırılması içinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, CD16a hedefleme bsAbs T hücrelerinin karaciğer kanserine karşı ilgi çekici daha bir daha umut verici strateji olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İnsan kanı toplama dahil olmak üzere tüm yordamları Sun Yat-Sen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. GPC3-S-Fab tasarım stratejisi

  1. GPC3-S-Fab anti-GPC3 (insanlaşmış GC3313) bir anti-CD16 VHH14 (Şekil 1) ile bir Fab bağlayarak tasarlayın.
  2. Sentez ve VH-CH1-CD16-VHH ve VL-CL pET26b ve pET21a vektörel çizimler daha önce bildirilen12olarak klonu.

2. dönüşüm ve kültür

  1. 100 Ekle VH-CH1-CD16 (Şekil 1A) ve 100 içeren ng pET26b, pET21a, yetkili BL21 100 µL VL-CL (Şekil 1A) içeren ng (DE3) hücreleri. Mix iyi ve 45-90 s, transfer, 42 ° C su banyosunda 30 dk. Incubate buz üzerinde kuluçkaya ve 3-5 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
  2. Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL BL21 içeren bir tüpün içine ekleyin (DE3) hücreleri ve sonra 37 ° c, 45-60 dakika süreyle 150 d/d BL21 yayılmış 100 µL kuluçkaya LB-agar (DE3) hücre tabaklar içeren 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin 100 µg/mL ve 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    1. Lysogeny suyu (LB) orta hazırlamak: %1 wt/vol tryptone, % 0.5 wt/vol maya özü, % 1 wt/vol NaCl.
  3. Bir koloni hücrelerden sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilinve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika, 100 µg/mL gecede içeren Süper suyu (SB) orta 5 mL aşılamak. O zaman, kültür 1 mL 100 mL 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 4 h için 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren SB orta içine aşılamak. Ardından kültür 10 mL 1 L SB orta sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren içine aktarın.
    1. Süper suyu orta hazırlamak: % 3.2 wt/vol tryptone, % 2 wt/vol maya özü, % 0.5 wt/vol NaCl.
  4. OD600 0,6 - ulaştığında 0.8, 0.2 mM son bir konsantrasyon izopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ekleyin. Kültür 16 ° c, 36-48 h periplasmic ifade için 180 rpm.

3. GPC3-S-Fab Periplasmic arıtma

  1. Periplasmic kesir hazırlık
    1. 4000 x g, 30 dk için 4 ° C de centrifuging tarafından hücreleri toplamak, orta atın ve hücreleri tartın.
    2. 4 mL buz gibi sükroz çözeltisi (20 mM Tris-HCL, pH 7.5; %25 (wt/vol) sükroz ve 1 mM EDTA) gram hücre başına iyice hücrelerde resuspend ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    3. 8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), buz üzerinde 20 dk. kaldırmak için süpernatant (sukroz Kesir) ve kurtarmak o 4 ° C santrifüj kapasitesi.
    4. Buz gibi 5 mm MgCl2 ve PMSF (gram hücre başına 4 mL), 1 mM bir karışımında granül resuspend. Lizozim hisse senedi (15 mg/mL) gram başına 40 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.
    5. 8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), 4 ° C 20 dakika Transfer süpernatant (periplasmic Kesir) süreyle santrifüj kapasitesi ve buza kaydedin.
    6. Sükroz kesir ve periplasmic kesir birleştirin ve de 30.000 x g, 4 ° C'de 30 dk. kaldırmak için süpernatant ve kurtarmak o bir 50 mL konik tüp buz santrifüj kapasitesi.
  2. Ni-NTA benzeşme arıtma
    1. Homojen bir süspansiyon ulaşmak, Ni-NTA özel bir taze 15 mL konik tüp için 1 mL kaldırmak ve 10 sütun birimleri (CV) denge arabellek eklemek için iyice karıştırılarak Ni-NTA özel 1 mL resuspend (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl) equilibrate için.
    2. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. Daha sonra Ni-NTA özel sükroz kesir ve periplasmic kesir içeren 50 mL tüp içine ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.
    3. 400 x g karisimin santrifüj kapasitesi, 4 ° C'de 5 dakika süreyle dikkatli bir şekilde süpernatant ilişkisiz kesir olarak başka bir taze buz gibi tüp için çıkarın. Ni-NTA özel bir yerçekimi sütuna aktarmak.
    4. 10 Ekle CV, arabellek yıkama (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM veya 40 mM imidazole) sütun ve toplamak çamaşır kesir olarak elute.
      Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.
    5. 3 ekleyin elüsyon CV (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM veya imidazole 400 mM) sütun için tampon ve elüsyon kesir olarak 1, 2, 3 ve 4 elute toplamak.
      Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.
    6. Diyaliz PBS (137 mM NaCl, KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4 2.7 mM) 2 L eluted fraksiyonları % 12 kontrol GPC3-S-Fab varlığı diyaliz boru (12,4 kDa) 4 ° C'de 2 h. için istimal SDS-sayfa ve sonra tarafından Coomassie mavi boyama.
  3. IgG-CH1 benzeşme arıtma
    1. IgG-CH1 benzeşme reçine 1 mL 50 mL konik tüp içine aktarmak ve boncuk PBS ile önce yıkayın. Daha sonra GPC3-S-Fab-den sonra adım 3.2.6 içeren diyaliz çözüm ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.
    2. 5 min için 400 x g, santrifüj, 4 ° C. Dikkatle ve reçine bir ağırlık sütun için transfer için başka bir taze buz gibi tüp süpernatant çıkarın.
    3. 10 Ekle CV çamaşır tampon (PBS) için sütun ve yıkama kesir olarak elüsyon toplamak.
    4. Koleksiyon tüpler Tris pH 9.0 (her eluted kesir mL başına 0.1 mL) 1 M ekleyerek hazırlayın. 3 CV elüsyon arabellek (glisin-HCL, pH 2.7 0.1 M) ile elute ve eluted kesir toplamak; 3 kez tekrarlayın.
    5. Diyaliz diyaliz boru (12,4 kDa) kullanarak 4 ° C'de 2 h. için PBS 2 L eluted kesirler iki kez tekrarlayın.
    6. Ultramicrospectrophotometer tarafından protein konsantrasyonu belirlemek (Molar tükenme katsayısı: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).

4. SDS-sayfa ve Western blot Analizi

  1. 5 SDS yükleme arabellek x 10 µL örnek almak ve iyice karıştırın. 5 min için 100 ° C'de protein karışımı kaynatın.
    1. 5 x SDS yükleme arabellek hazırlamak: 250 mM Tris-HCL, pH 6.8, % 10 wt/vol SDS, %0,5 wt/vol bromophenol mavi, %50 vol/vol gliserol, % 5 vol/vol beta-mercaptoethanol.
  2. SDS-sayfa jel yükleme jel (% 5) ve ayrılık jeli (% 12) yukarıda açıklanan26,27,28hazırlayın.
  3. Haşlanmış protein karışımı ve protein marker 10 µL yük ve SDS-sayfayı çalıştırın.
  4. Coomassie parlak mavi çözüm ile 20 dk için sallayarak jel leke ve destaining gerçekleştirin.
  5. Western Blot, PVDF membran için aktardıktan sonra membran TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, %0,1 vol/vol ara 20 150 mM) ile blok + % 5 wt/vol sallayarak süre oda sıcaklığında 1 h için süt kaymağı alınmış.
  6. Membran birincil antikorlar ile kuluçkaya (Anti-O'nun veya anti-bayrak) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için.
  7. Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.
  8. İkincil antikoru (Anti-fare Fc antikor HRP bağlı) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için membran kuluçkaya.
  9. Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.
  10. HPR substrat film başına 1 mL ekleyin, geliştirmek ve fotoğraf çekmek.

5. jel filtrasyon Analizi

  1. Aşağıdaki sütun kullanın: sütun hacmi 24 mL; Denge arabellek PBS pH 7.4; Akış hızı 0.5 mL/dk odasında ılıman; Örnek hacmi 200 µL.
  2. Aşağıdaki protein güç ve konsantrasyon kullanın: 500 µL 1.2 mg/ml GPC3-S-Fab. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.
  3. Protein marker hacmi ve konsantrasyon, 100 µL sitokrom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL anhidraz (3 mg/mL, 29 kDa), albümin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL ve alkol dehidrogenaz (5 mg/mL, 150 kDa) 200 µL bir tüpün içine alın. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.
  4. Her koşudan önce en az 2 ile yıkayın CV distile suyun akış hızı 0.5 mL/dak.
  5. Sütun en az 2 ile equilibrate CV denge arabelleği (PBS, pH 7,4) 0.5 mL/dk akış hızında.
  6. Otomatik olarak örnek örnek yüklemek için 0.5 mL/dk enjekte et.
  7. Denge arabelleği 0.5 mL/dk ile elute ve 280 ve 215 nm algılamak.

6. Akış Sitometresi Analizi

  1. HepG2 Kültür (GPC3 pozitif), Hep3B (GPC3 pozitif), Huh7 (GPC3 pozitif) ve 100 x 20 mm plastik yemekleri DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° C'de içeren hücrelerde MHCC - 97H (GPC3 complement) %5 CO2.
  2. Kültür CHO (GPC3 complement) hücreleri ve tam uzunlukta insan GPC3 cDNA (GPC3 pozitif) 100 x 20 mm plastik yemekler RPMI 1640 orta %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2içeren yataklık CHO/GPC3 hücreleri.
  3. Tam uzunlukta insan CD16 cDNA (CD16 pozitif) barındıran NK92/CD16 25 cm2 şişeye %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2ile RPMI 1640 orta içeren kültür.
  4. Hücreleri % 70-90 birleşmesi olduğunuzda, orta atın ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° c için 2-3 dk (veya hücre yüzeyinden ayırmak başlayana kadar) kuluçkaya. Tripsin etkisiz hale getirmek ve hücrelerin yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya almak için tam büyüme orta 1 mL ekleyin.
  5. Neubauer hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak ve hücre canlılığı Trypan Mavitarafından algılamak.
  6. 3 x 106 hücreler her hücre satırı için toplamak. PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL ekleyin. 200 x g, santrifüj, 4 ° C 5 dk. iki kez tekrarlamak için.
  7. PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 0.3 mL ekleyin ve her 5 mL polistren yuvarlak alt tüp 100 µL (yaklaşık 1 milyon) aktarın.
    Not: Lütfen burada tüpler için adımları soğuk buz üstünde tutulmalıdır emin olun. Antikor hücre yüzey antijeni bağlanırken, karmaşık içselleştirmesi başlar. Soğuk tutarak, süreci önemli ölçüde yavaşladı.
  8. Her tüp için birincil antikor (GPC3-S-Fab veya insan Igg1, son konsantrasyonu 5 µg/mL) 10 µL ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
  9. PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.
  10. PBS + % 0,2 BSA, 100 µL yeniden askıya alma ve daha sonra ikincil antikoru (anti-insan IgG(H+L)-488, son konsantrasyonu 10 µg/mL) 0.5 µL ekleyin ve buz 1 h. Not için kuluçkaya: Bu adıma, lütfen hücreler gelen ışık tutmak..
  11. PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.
  12. Hücreleri tarafından akış sitometresi standart protokolü29göre analiz. Hücrelerin uyarma için 488 nm lazer ile elde etmek.

7. sitotoksik deneyleri

  1. Tümör hücreleri hazırlayın.
    1. Kültür HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H ve CHO hatları 6.1 6.5 adımlarda açıklandığı gibi hücre.
    2. 0,5 × 105/mL hücrelere sulandırmak ve 100 µL hücreleri (iyi başına 5000 hücre) 96-şey plakalar üzerinde plakası. 6-8 h hücre eklemek izin vermek için kültür.
  2. İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) hazırlayın.
    1. PBS eşit bir birimdeki bir 50 mL konik tüp taze hazırlanmış kanı sulandırmak. Örneğin, kan 10 mL 10 mL PBS ile oranında seyreltin.
    2. Lenfosit ayrılık orta 15 mL taze 50 mL konik tüp içine al. Lenfosit ayrılık ortama tüp tarafı boyunca seyreltilmiş kan yavaş yavaş aktarın.
      Not: tüp dikey tutun. Lenfosit ayrılık orta yüzeyine bozulmaz.
    3. 400 x g oda sıcaklığında 35 dk için de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.
    4. Yavaş yavaş üst plazma katmanı kaldırın ve PBMCs plazma-lenfosit ayrılık orta arayüz içeren beyaz kan katman al.
    5. PBS + % 2 Kişilik birimi olan PBMCs seyreltik FBS. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    6. Hücrelerle iki kez PBS + % 2 yıkama FBS. 5 dakika süreyle santrifüj 400 x g de 6,5 adımda anlatıldığı gibi hücre sayıları saymak.
  3. NK hücreleri hazırlayın.
    1. 5 x 107 hücre/mL PBS + %2 FBS ve yerde bir konsantrasyon, PBMCs süspansiyon hazırlamak 5 mL polistren yuvarlak alt tüp giriyordu.
    2. İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyl 50 µL/mL hücre ekleyin. Mix iyi ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. Manyetik parçacıklar NK hücre zenginleştirme kiti ve mix iyi onlar düzgün pipetting tarafından askıya alınır sağlamak için yukarı ve aşağı 5 katından fazla şiddetle resuspend. 100 µL/mL resuspended manyetik parçacıklar hücre süspansiyon aktarın. Mix iyi ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. PBS + %2 ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL kadar hücre süspansiyon getirmek FBS. Tüp hücrelerde yavaşça yukarı ve aşağı 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Olmadan bir kap) tüp mıknatıs yerleştirin. Oda sıcaklığında 2.5 min için yerleşmek manyetik boncuklar izin.
    5. Mıknatıs kaldırın. Bir sürekli çekimde zenginleştirilmiş hücre süspansiyon yeni bir tüp içine dökme Tüp, tersine çevirin.
    6. 6.5. adımda açıklandığı gibi hücre sayıları saymak.
  4. Sitotoksik tepki kadar ayarla.
    1. NK hücreleri 5 × 105 hücreleri/karşılık gelen kültür ortamı kullanarak ml seyreltik. 100 µL NK hücre süspansiyon, bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tümör hücreleri ekleyin.
    2. GPC3-S-Fab 10 µL 30 µg/mL, 3 kat seyreltme, 9 nokta (üç çoğaltır) son bir konsantrasyon, en yüksek dozla farklı konsantrasyonlarda ekleyin.
    3. 37 ° c, % 5 CO2 72 h için kuluçkaya.
    4. 72 h, kuluçka sonra orta kaldırmak ve DMEM orta CCK8 reaktif her kuyuya 96-şey plakaları için 10 µL içeren 100 µL ekleyin ve 37 ° C'de kuluçkaya
    5. 450 de plaka okumak nm'de 1, 2, 3 ve 4 h CCK8 reaktif ekledikten sonra.
    6. Verileri analiz. (OD450 GPC3-S-Fab + efektör + tümör - OD450 Orta) hayatta kalma oranı hesaplamak / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100 ve (OD450 GPC3-S-Fab + tümör - OD450 Orta) / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100. Efektör hücreler NK hücreleri vardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

GPC3-S-Fab arıtma

GPC3-S-Fab E. coli bir iki adım benzeşme saflaştırma tarafından ilk Ni-NTA-özel, IgG-CH1 benzeşme arıtma tarafından takip ile saflaştırıldı. İki adım benzeşme arıtma sonra GPC3-S-Fab homojenliği ile 1:1 (Şekil 2A) yakın iki zincir için saflaştırıldı. VH-CH1-CD16 VHH ve VL-CL polipeptitler varlığı onların farklı C-terminal eti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, biz bsAbs, yeni bir biçim oluşturmak için bir strateji mevcut GPC3-S-hangi GPC3 pozitif tümör hücreleri hedefleme NK hücreleri askere Fab. S-Fab üzerinde doğal Fab dayalı bir anti-CD16 VHH11,12ekleyerek biçimi. BsAbs içeren Fc bölge ile karşılaştırıldığında, GPC3-S-Fab kolayca bakteri büyük ölçüde periplasm olarak üretilmektedir.

İletişim kuralında tanımlanan ifade ve arıtma stratejisi k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Bu eser mali R & D planı, Guangdong Eyaleti (PR Çin) (2016A050503028) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Shaking incubatorThermo FisherMAXQ 4000
Shaking incubatorZhichengZWYR-D2402
CentrifugeCenceGL-10MD
CentrifugeBeckman coulterAvanti j-26S XPI
Centrifugeeppendorf5810R
Ultraviolet spectrophotometerThermo FisherNanodrop
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatusMini-PROTEAN® TetraBio-rad
Trans-blot apparatusCriterionBio-rad
Imaging systemBio-radchemidoc tm XRS+
Fast Protein Liquid chromatogramGE HealthcareAKTA avant
GF columnGE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow CytometerBeckman coulterFC500
Centrifugeeppendorf5702R
Envision plate readerTECANInfinite F50
Anti His-tageBioscience14-6657-82
anti-Flag-tagSigmaF1804
anti-human(H&L)-488A11013Invitrogen
Anti-mouse IgG HRP-linked antibodyCell Signaling7076S
Ni-NTA-AgaroseTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 affinity resinThermo Fisher194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
NK cell enrichment kitStemcell19055
MagnetStemcell18000
CCK8 kitDojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF2442
TrypsinGibco15050-057
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Cell culture
Standard markerSigma AldrichMWGF200Gel filtration
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)VWR chemicalsVWRC0487-100G
Dialysis tubingSigma AldrichD0655-100FT
KnanamycineVWRVWRC0408-100G
AmpicillinVWRVWRC0339-100G
TryptoneThermo FisherLP0042B
Yeast ExtractThermo FisherLP0021B
NaClSangon BiotechA100241
Trizma baseSigma AldrichT6791-1KG
EDTASigma AldrichV900106
GlycinealaddinA110752-500g
KClaladdinP112134-500g
MgClSigma AldrichV900020
AgarSangon BiotechA505255-0250
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)VWR7778-77-0
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-MercaptoethanolVWR60-24-2
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)VWR329-98-6
LysozymeSigma AldrichL6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250VWRVWRC0472-50G
Bromophenol blueSangon BiotechA500922-25G
Bovine Serum Albumin (BSA)VWRVWRC0332-100G
GlycerolSigma AldrichV900122
100mm x 20mm plastic dishCorning430167
25cm2 flaskCorning430639
96 well cell culture clusterCorning3599
SucroseSangon BiotechA610498-0005
CHOthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesGNHa 3
MHCC-97Hthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesSCSP-528
HepG2the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu 72
Huh7the Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu182
Hep3Bthe Type Culture Collection of the Chinese Academy of SciencesTCHu106
NK92ATCCCRL2408

Referanslar

  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
  3. Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
  4. Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
  5. Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
  6. Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
  7. Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
  8. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  9. Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).
  10. Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).
  11. Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
  12. Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32(2016).
  13. Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
  14. Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
  15. Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
  16. Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
  17. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  18. Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
  19. Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
  20. Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
  21. Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
  22. Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
  23. Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
  24. Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
  25. Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
  26. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  27. Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  29. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 137Bispecific antikorantikortek etki alanVHHGPC3 S FabGPC3karaci er kanseri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır