JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتطوير وتميز الخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس) وتقييم فائدتها إيمونوثيرابيوتيك.

Abstract

يعمل الجهاز المناعي بالحفاظ على توازن محكم بين تنسيق الاستجابات ضد المستضدات الأجنبية والحفاظ على دولة لا تستجيب ضد المستضدات الذاتية فضلا عن المستضدات المستمدة من الكائنات الحية commensal. يمكن أن يؤدي الإخلال بهذا التوازن المناعي لالتهاب مزمن وتنمية المناعة الذاتية. الخلايا الجذعية (DCs) هي خلايا نظام المناعة الفطرية المشتركة في تنشيط الخلايا السذاجة T الشروع في الاستجابات المناعية ضد المستضدات الأجنبية عرض مستضد المهنية. ومع ذلك، وحدات تحكم المجال Dc يمكن أن تكون متباينة أيضا في تولدكس التي تعمل على الحفاظ على وتعزيز التسامح خلية تي وأن قمع خلايا المستجيب المساهمة في تطوير الأوضاع الذاتية أو المزمن التهاب أما. النهوض الأخيرة في فهمنا تولدكس يوحي بأنه يمكن تحقيق التسامح DC بتحوير ظروف التمايز. أدت هذه الظاهرة إلى النمو الهائل في تطوير علاجات تولدك للاضطرابات المناعية عديدة تسبب الواجبة لكسر في منأى عن التسامح. كذلك أقرت الدراسات الناجحة في نماذج مورين المناعة الذاتية الإكلينيكية الأداة إيمونوثيرابيوتيك من تولدكس في علاج اضطرابات المناعة الذاتية. اليوم، أصبحت تولدكس أداة إيمونوثيرابيوتيك واعدة في العيادة لإعادة المفصولين التسامح المناعي في الاضطرابات المناعية المختلفة باستهداف الاستجابات الذاتية المسببة للمرض بينما ترك حصانة وقائية سليمة. على الرغم من أن مجموعة من الاستراتيجيات اقترحه مختبرات متعددة للحث على تولدكس، لا يوجد اتساق في وصف النمط الظاهري الخلوية والوظيفية لهذه الخلايا. هذا البروتوكول يوفر دليل خطوة بخطوة لتطوير وحدات تحكم المجال Dc المشتقة من نخاع العظام بإعداد كبيرة، أسلوب فريد يستخدم للتفريق بينهم في تولدكس مع triterpenoid اصطناعية 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic حمض-ديفلورو-بروبيل-أميد (كدو-مديرة)، والتقنيات المستخدمة لتأكيد على النمط الظاهري، بما في ذلك تحليلات للتوقيعات الجزيئية الأساسية من تولدكس. وأخيراً، نحن إظهار أسلوب تقييم الدالة تولدك باختبار تلك الاستجابة المثبطة للمناعة في المختبر و في فيفو في نموذج السريرية للتصلب المتعدد.

Introduction

الخلايا الجذعية (DCs) هي جزء لا يتجزأ من نظام المناعة الفطرية وأول مرة اكتشفت وتميزت رالف ستينمان وزانفيل كوهن في عام 1973 كما عرض مستضد المهنية الأولية الخلايا1. وحدات تحكم المجال Dc قد ثبت أن تلعب دوراً مهما في تنشيط محصنة بتقديم المستضدات المجهزة للخلايا T والخلايا ب عن طريق المجمعات الكبرى histocompatibility (MHC) في الأجهزة اللمفاوية الثانوية لربط نظم المناعة الفطرية وتكيفية2. في الثدييات المناعي، هناك فئتين على الأقل من وحدات تحكم المجال Dc التي وصفت بأنها النقوي وحدات تحكم المجال Dc وبلاسماسيتويد DCs (pDCs)3. وحدات تحكم المجال Dc النقوي، أيضا يعرف باسم Dc التقليدية (المؤلفان)، تتميز بالتعبير عن CD11c ويمكن أن تكون متباينة DCs (البلدان الجزرية النامية) غير ناضجة في المختبر من خلايا السلف نخاع العظام أو الدم المحيطي وحيدات باستخدام عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)، وايل-4 في الأنواع موريني أو البشرية، على التوالي4.

تفعيل 'خطر' إشارات، مثل أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بمب) أو أنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (الرطوبة)، سوف تدفع البلدان الجزرية النامية النضج تجاه DCs مكسبه ناضجة DCs (مدكس) عبر ملزم مستقبلات الاعتراف بنمط مختلف سطح DC5. DCs مكسبه كذلك رئيس الوزراء تكاثر الخلايا T ساذجة والتمايز من خلال أوبريجوليشن مهسيي2، يغاندس كوستيمولاتوري (CD80 و CD86 و CD40)6، السيتوكينات، وسائر الوسطاء للذوبان7. سلسلة من الوسطاء المحترفين التهابات الإنتاج من "وحدات تحكم المجال Dc مكسبه" ضروري للتمايز سيتوكين بوساطة الخلايا T. على سبيل المثال، IFN-γ وايل-12 ضرورية ل التمايز Th18 و IL-1، إيل-6، وايل-23 حاسمة بالنسبة للسذاجة خلية T الاستقطاب نحو خلايا Th179. رغم DCs ناضجة الرد على المستضدات الأجنبية، غير المنضبط DC التنشيط بواسطة المستضدات الذاتية قد تسبب التذرية التسامح وتعزيز التنمية لأمراض المناعة الذاتية عن طريق توليد خلايا أوتوريكتيفي تي التنشيط الذي يؤدي إلى تدمير الأنسجة10 .

وقدمت التقارير الأخيرة دليل واضح على اللدونة DC، يتجلى في قدرتها على التفاعل مع إشارات مختلفة داخل بهم المكروية الأنسجة والتفريق إلى مجموعات فرعية متميزة المستجيب/القامع DC. الوسطاء للالتهابات، مثل TGF-β12، إيل-1011و 1 هو13 تبين أن تلعب دوراً مهما في قمع المناعة بحمل توليروجينيك DCs (تولدكس). هذه تولدكس الحصول على المهام التنظيمية وقمع انتشار الخلايا T14. وعلاوة على ذلك، انعدام التحفيز المشارك بوحدات تحكم المجال Dc وإنتاج الوسطاء للالتهابات من تولدكس سواء المساهمة في تنظيم دورات تعريفية للخلايا التائية التنظيمية (تريجس) وأيضا فعالة تحول دون Th1 و Th17 التمايز وتوسيع15. في الماضي عقدين، إمكانات علاجية تولدكس أبلغت العديد من المحققين. في هذه الدراسات، ولدت تولدكس ليس فقط تحسن الأعراض المرضية في مختلف النماذج السريرية لأمراض المناعة الذاتية16 إدارة السابقين فيفو ، لكنه أدى أيضا إلى تنمية التسامح المناعي في المرضى الذين17 ،18. من المثير للاهتمام، اليوم، العلاج تولدكس نظرت كنهج بديل أو مرافقة لأمراض المناعة الذاتية في العديد من التجارب السريرية، بما في ذلك نوع 1 مرض البول السكري19،20التهاب المفاصل، 21، التصلب المتعدد (MS)22،،من2324، و مرض كرون25.

وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي استخدمت لوضع تولدكس وأفادت مختبرات عدة أساليب لتوليد وتوصيف المظهرية من تولدكس. يمكن استخدام هذه الأساليب لتكاثر توليد تولدكس في المختبر من فروعه المكونة للدم والحفاظ على ستابلي لهم في توليروجينيك دولة في فيفو26،،من2728،29. البلدان الجزرية النامية يمكن تحويلها إلى تولدكس بالتعرض لمختلف العوامل الدوائية immunomodulatory أو السيتوكينات المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، فيتامين D3 عامل دوائية معروفة المعروفة لزيادة إنتاج إيل-10 وقمع إفراز إيل-12 من وحدات تحكم المجال Dc ومما يعزز هذه الدالة كآبته30. وعلاوة على ذلك، عندما يتعرض DCs للمنبهات تحريضية قوية، مثل ليبوبوليساكتشاريديس (LPS)، عدة وكلاء الدوائية مثل الديكساميتازون31و32من ربمسن القشرية33 قد ثبت للحث النمط الظاهري تولدك بتخفيض DC التعبير السطحي CD40، CD80، CD86، ومهسيي34. إيل-10 و TGF-β، أظهرت السيتوكينات المضادة للالتهابات التي درست معظم للحث على التسامح العاصمة35 والتعرض ملازم لكل من هذه السيتوكينات للحث النمط الظاهري توليروجينيك في وحدات تحكم المجال Dc36.

منذ توليروجينيك DC تتحدد بالخصائص الوظيفية بدلاً من قبل علامات المظهرية، هناك كبيرة تحتاج إلى تطوير طريقة متسقة لتوصيف تولدكس الخلوية والوظيفية. وعلاوة على ذلك، يجب إنشاء بروتوكول دقيق ومتسق للتقييم متسقة ووصف النمط الظاهري توليروجينيك العاصمة إذا ما أردنا مقارنة فعالية وتكاثر عوامل جديدة قادرة على حمل النمط الظاهري تولدك في مختبر. هنا نقدم بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة طرق لعزل البلدان الجزرية النامية من فروعه المكونة للدم في الفئران وبعد ذلك تحليل فعالية عوامل جديدة قيد التقييم لقدرتها على تحويل البلدان الجزرية النامية في تولدكس، توفير قوي توصيف وظيفي والمظهرية تولدكس في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويشمل هذا الوصف أسلوب وضع وصف تولدكس يغاندس السطحية وسيتوكين الشخصية، ووظائف كآبته في المختبر. كما نقدم مثالاً على طريقة لاستكشاف إمكانية تطبيق العلاج من هذه تولدكس في نموذج ما قبل سريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد، النخاع الذاتية التجريبية (ع). هذا البروتوكول المتبعة سوف يساعد المحققين لتقييم قدرة عوامل جديدة النهوض بتحريض تولدكس وسيتم تيسير الجهود الرامية إلى توسيع نطاق التنمية العلاجية تولدك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت جميع الدراسات وفقا للإجراءات التي أقرتها القضية Western Reserve كلية الطب بجامعة لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.

1. إعداد الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم (بمدكس)

  1. تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.
  2. Euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. المكوس عظام الشظية الساق والفخذ باستخدام مقص جراحي ووضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 10 سم.
  3. استخدام شفرات الجراحية وملقط تشريح الأنسجة بعيداً قدر الإمكان على غطاء 10 سم الثقافة الطبق وعزل تيبياس وقصبة وضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 6 سم.
  4. استخدام شفرات الجراحية لتقليم كلا طرفي تيبياس وقصبة. استخدام 3 مل برنامج تلفزيوني في محقن 3 مللي بإبرة ز 23 لمسح محتويات نخاع من واحدة من نهاية العظام إلى أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 12 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 3 x لكل طرف من أطراف العظام.
  5. الطرد المركزي بتعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع ACK 1 مل ليسينج المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  7. إضافة 9 مل برنامج تلفزيوني تمييع ACK ليسينج المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة المادة طافية وريسوسبيند مع 10 مل الثقافة المتوسطة (RPMI 1640 بالإضافة إلى الجلوتامين ل 10% FBS، 1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x)، 10 ملم حبيس، 50 نانومتر β-ميركابتوثانول والبنسلين/ستربتوميسين 5%).
    ملاحظة: مستوى الذيفان يجب أن تكون أقل من 0.1 مليلتر الاتحاد الأوروبي في FBS.
  9. يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 40 ميكرومتر واتخاذ 20 ميليلتر من تعليق خلية وتخلط مع 80 ميليلتر من تريبان الأزرق لعد عدد الخلايا الحية باستخدام سيتوميتير.
  10. ضبط عدد الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4.
  11. لوحة 3 مل من 1 × 106 خلايا/مل في كل من لوحة 6-جيدا جيدا واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: خلايا النخاع العظمى من الماوس واحد حوالي 3-5 × 107 الخلايا، مما يشير إلى أنها يمكن أن توضع من 2 إلى 3 6-جيدا لوحات.
  12. في يوم 3، إزالة جميع المتوسطة الثقافة 3 مل من كل بئر، إضافة 2 مل برنامج تلفزيوني جديد في كل بئر، ومن ثم بلطف دوامة لوحة لضمان إزالة كافة الخلايا غير ملتصقة.
  13. استبدال 3 مل الطازجة الثقافة المتوسطة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
  14. في يوم 5، مباشرة إضافة آخر 3 مل الطازجة المتوسطة الثقافة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2، 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: الحجم الإجمالي في كل بئر الآن 6 مل.
  15. في يوم 7، وضعت لوحة كاملة على الجليد لمدة 10 دقائق. بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر لإزاحة شكل فضفاض-تمسكا بمدكس كالبلدان الجزرية النامية في التعليق.
    ملاحظة: لا يزال يتم إرفاق الضامة ملتصقة باللوحة. درجة الحرارة منخفضة والإجراءات بلطف هي المفتاح لتجنب التنشيط DC للتأثير على مزيد من التجارب.
  16. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند مع المتوسطة ثقافة جديدة لإجراء مزيد من التجارب.
    ملاحظة: يمكن تحديد بمدكس بجسم CD11c fluorescence المسمى بالتدفق الخلوي واظهرنا استراتيجيتنا النابضة من بمدكس لتجارب أخرى في الشكل 1.

2-تميز تولدك الجينات والبروتين الشخصية

  1. لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: كدو-مديرة، تريتيربينويد اصطناعية، عامل نووية (المستمدة من محمر 2)-مثل-2 (Nrf2) عامل محفز ومثبط النووية عامل-κB (NF-κB). تطبيق العوامل الأخرى لتحريض تولدكس من البلدان الجزرية النامية، مثل إيل-10، وفيتامين D3، الديكساميتازون أو خليج 11-7085، وتعديل هذه الخطوة بشرط أمثل لكل عامل.
  2. إضافة 10 أو 100 نانوغرام/مليلتر من لبس تفرخ 4-24 ساعة للحث على مدكس (وقت الحضانة مختلفة بسبب القياس مرناً أو البروتين).
  3. بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر والحصاد تعليق خلية باستخدام ماصة 1 مل. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا والمادة طافية، على التوالي.
  4. تحليل يغاندس السطحية من الكريات الخلية بالتدفق الخلوي، مثل يغاندس تنشيطية: CD40، CD80، CD86، MHC-ثانيا، OX40L، إيكوسل، أو يغاندس المثبطة: PD-L1، PD L2، ILT3، ILT4.
  5. عزل الحمض النووي الريبي من الكريات الخلية وتحليل الحمض النووي الريبي وعينات طافية على المستويات الشخصية والجينات والبروتين سيتوكين الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR) وإليزا، على التوالي.
    ملاحظة: على سبيل المثال، السيتوكينات الالتهابية: السيتوكينات تنف-α، IFNγ، EDN-1، وايل-6، وايل-12، وايل-23، أو المضادة للالتهابات: إيل-4، وايل-10، إيل-15، TGF-β1، وهو 1.

3-تقييم وظيفة تولدكس في المختبر و في فيفو

  1. تي خلية انتشار سينجينيك الإنزيم
    1. تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.
    2. إعداد أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت باستخدام 0.5% ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 مم يدتا في 500 مل برنامج تلفزيوني. تعقيم المخزن المؤقت عن طريق التصفية عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
      ملاحظة: الاحتفاظ المخزن المؤقت على الجليد خلال التجربة التالية.
    3. للحصول على خلايا CD4+ تي euthanize الخلايا، OT-تي الثاني خلية الفئران المعدلة وراثيا مستقبلات (تكر) 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط.
    4. وضع الطحال مع 2 مل برنامج تلفزيوني في صحن ثقافة 6 سم واستخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
    5. جمع في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 400 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
    7. إضافة 100 ميكروليتر من خلايا CD4+ "كوكتيل" البيوتين-جسم الخلية T عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: ربط جسم كوكتيل في أنواع الخلايا الأخرى ما عدا خلايا CD4 خلايا+ T، مثل CD8a، CD11b، CD11c، CD19، CD25، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC مكافحة الدرجة الثانية، مكررا ثانيا-119، و TCRγ/δ.
    8. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش و 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة (جدول المواد) عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    9. مكان يتألف العمود من المجالات المغناطيسية (جدول المواد) وفصل ما قبل "تصفية" معا في المغناطيسي الميدانية وشطفه مع 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
    10. إضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش في الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    11. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وتطبيقه على العمود. جمع التدفق من خلال خلايا CD4 التي تحتوي على+ تي الخلايا.
    12. أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وجمع أيضا التدفق من خلال.
    13. للحصول على وحدات تحكم المجال Dc عموم الطحال، euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط. وضع الطحال في صحن ثقافة 6 سم يحتوي على 2 مل من محلول كولاجيناز د (2 مغ/مل كولاجيناز د حله في حبس المحتوية على الكالسيوم والمغنيسيوم).
    14. حقن 1 مل من محلول كولاجيناز د إلى الطحال مرتين مع 1 مل حقنه وابرة 25 جرام. قطع الطحال إلى قطع صغيرة مع مقص صغير.
    15. اهتز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    16. إضافة 500 ميكروليتر يدتا 0.5 م في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: الخطوات من 3.1.13-3.1.14 ذات أهمية حاسمة لزيادة العائد من وحدات تحكم المجال Dc.
    17. الآن استخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الملاط الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع تعليق خلية سينتريفوجينج على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    18. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 350 المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، 50 ميكروليتر من كاشف حظر FcR و 100 ميكروليتر من الخلية الجذعية عموم جسم البيوتين "كوكتيل" عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: جسم كوكتيل ضد المستضدات التي لا يتم التعبير عنها بوحدات تحكم المجال Dc.
    19. غسل الخلايا بإضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وأجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    20. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 800 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وإضافة 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    21. كرر الخطوات من 3.1.9-3.1.11 لجمع وحدات تحكم المجال Dc.
    22. أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش مرتين وجمع أيضا التدفق من خلال.
    23. علاج 2 × 105 وحدات تحكم المجال Dc/مل في وجود أو عدم وجود خلايا تي 100-400 نانومتر كدو-مديرة في 37 درجة مئوية للتسمية CD4، بشكل منفصل في الساعة 1+ (1 × 107/ml) مع 1 ميكرومتر كفسي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ، وإعادة ضبط وحدة التخزين للحصول على التركيز النهائي في6 ر 2 x 10 خلايا/مل.
    24. المقبل، في لوحة 96، حسنا، الثقافة شارك 100 ميكروليتر من الخلايا الجذعية تعامل مع نفس الحجم من المسمى كفسي CD4 الخلايا+ T، سواء التي تم جمعها من الخطوات المذكورة أعلاه للحصول على 01:10 نسبة. الآن إضافة 100 نانوغرام/مليلتر الببتيد أوفالبومين (OVA) 323-329 كل بئر وقياس كثافة كفسي الخلايا T بالتدفق الخلوي بعد 2-3 أيام للحضانة.
      ملاحظة: الأرقام الخلية ونسبة من وحدات تحكم المجال Dc و T وقد تم تحسين الخلايا من أن العمل السابق37.
  2. حمل السلبي ع عن طريق حقن بمدكس نابض بروتين سكري Oligodendrocyte المايلين (موج) (35-55)
    1. لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة 1 ساعة.
    2. إضافة 10 نانوغرام/مل من لبس تحضين 24 ساعة.
    3. إضافة 100 ميكروغرام/مل من موج (35-55) تحضين 4 ساعات.
    4. الحصاد في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني وحساب الخلايا.
    6. تحت الجلد حقن 200 ميكروليتر من 2 × 106 خلايا للفئران C57BL/6 الإناث 8-10 أسابيع من العمر (100 ميكروليتر في كل الساق الخلفية).
    7. في اليوم من حقن بمدك و 48 ساعة. في وقت لاحق، ضخ 200 نانوغرام من السعال الديكي السمية (PTX) في كل الماوس.
    8. كرر الخطوات 3.2.6-3.2.7 مرة كل أسبوع لمدة 4 أسابيع متتالية.
    9. تقييم الأعراض السريرية من ع يوميا باستخدام المعايير القياسية37 (0.5-يعرج ذيل، الذيل 1-يعرج، ضعف أطرافهم هند 2-معتدلة، أطرافهم هند 3-شديدة الضعف، والشلل أطرافهم هند 4 كاملة، الدولة 5-الرباعي أو تحتضر، 6-وفاة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بالتمايز واختيار بمدكس:

كانت مثقف خلايا السلف نخاع العظام في إكمال المتوسطة ربمي حضور GM-CSF، وايل-4 تفرق في البلدان الجزرية النامية لمدة 7 أيام (الشكل 1A). في اليوم 1، كانت صغيرة في حجم الخلايا وأظهرت مورفولوجيا كروية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتصف هذه الورقة على بروتوكول فعالة التي يمكن استخدامها لتكاثر لتوليد البلدان الجزرية النامية وبعد ذلك التفريق بينهم في تولدكس، ونقترح أن هذا يمكن تطبيقها على تقييم قدرة وكلاء الهدف جزيئية جديدة للحث تولدك النمط الظاهري. وكما هو مبين في هذا التقرير، تابعنا تسلسل التي نحن أولاً تحليل التع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgements

ونحن نشكر "ريتا المستحضرات الصيدلانية" لتوفير كدو-مديرة. كما نعترف بالدعم لجين ولي الرئاسة سيدمان في "طب السرطان الابتكار" (جون ليتيريو). هذا العمل كان تدعمها وزارة الدفاع [W81XWH-12-1-0452]؛ مبادرة بحوث السرطان الكبار فاولر إنجي المراهقين والشباب في مركز السرطان الشامل في القضية؛ وجائزة الباحث خريج كالاهان وي جو الجمعيتان من مؤسسة كالاهان إف جي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house synthesisCell culture
Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC differentiation
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Cell culture
β-mercaptoethanolSigma Aldrich Inc.516732Cell culture
Pertussis toxin (PTX)R&D systems3097EAE induction
MOG (35–55) peptide21stCentury Biochemicalsin house synthesisEAE induction
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Cell culture
Non-essential amino acid (100X)ThermoFisher Scientific11140050Cell culture
HEPESThermoFisher Scientific15630080Cell culture
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140122Cell culture
40 μm cell strainerCorning352340Cell isolation
PE-conjugated CD80BD Biosciences557227Flow cytometry
PE-conjugated CD86BD Biosciences555665Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1BioLegend124307Flow cytometry
APC-conjugated MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Flow cytometry
APC-conjugated CD11cBD Biosciences340544Flow cytometry
Isotype matched PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Flow cytometry
Isotype matched APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Flow cytometry
CFSEBioLegend423801T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
ACK lysing bufferThermoFisher ScientificA1049201BMDC differentiation
1 ml syringeBD Biosciences309626T cell proliferation assay
3 ml syringeBD Biosciences309588BMDC differentiation
25G needleBD Biosciences309626T cell proliferation assay
23G needleBD Biosciences309588BMDC differentiation
BSASigma Aldrich Inc.A2058T cell proliferation assay
EDTAThermoFisher Scientific15575020T cell proliferation assay
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T cell proliferation assay
Pre-Separation FilterMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T cell proliferation assay
collagenase DSigma Aldrich Inc.11088858001T cell proliferation assay
HBSSThermoFisher Scientific14025076T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329Sigma Aldrich Inc.O1641T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR&D systemsDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR&D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR&D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibodyAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actin antibodyAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometry

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved