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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Abstract

Il sistema immunitario opera mantenendo un equilibrio stretto tra coordinamento risposte contro antigeni estranei e mantenere uno stato non rispondono contro autoantigeni come pure gli antigeni derivati da organismi commensali. La rottura di questa omeostasi immunitaria può portare a un'infiammazione cronica e lo sviluppo dell'autoimmunità. Le cellule dendritiche (DCs) sono le cellule presentanti l'antigene professionale del sistema immunitario innato coinvolto nell'attivazione di cellule T naïve per avviare le risposte immunitarie contro antigeni estranei. Tuttavia, DCs possono essere differenziate anche in TolDCs che agiscono per mantenere e promuovere la tolleranza delle cellule T e di sopprimere le cellule effettrici che contribuiscono allo sviluppo di entrambi condizioni di infiammazione cronica o autoimmune. Il recente progresso nella nostra comprensione di TolDCs suggerisce che tolleranza DC può essere realizzato modulando le loro condizioni di differenziazione. Questo fenomeno ha portato ad una crescita enorme nello sviluppo di terapie TolDC per numerosi disturbi del sistema immunitario causati dovuto rompere in tolleranza immunitaria. Studio di successo in modelli murini di autoimmunità preclinici ulteriormente hanno convalidato l'utilità immunoterapia di TolDCs nel trattamento dei disordini autoimmuni. Oggi, TolDCs sono diventati uno strumento promettente immunoterapia nella clinica per reintegrare la tolleranza immunitaria in vari disordini immuni mirando ai patogene risposte autoimmuni mantenendo intatti l'immunità protettiva. Anche se una matrice delle strategie è stato proposto da vari laboratori per indurre TolDCs, c'è alcuna coerenza nel caratterizzare il fenotipo cellulare e funzionale di queste cellule. Questo protocollo fornisce una guida passo passo per lo sviluppo di derivate da midollo osseo DCs in gran numero, un unico metodo utilizzato per differenziarli in TolDCs con un triterpenoide sintetico 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acido-difluoro-propil-ammide (CDDO-DFPA) e le tecniche utilizzate per confermare il loro fenotipo, incluse le analisi di firme molecolari essenziali di TolDCs. Infine, vi mostriamo un metodo per valutare la funzione TolDC testando loro immunosopressiva risposta in vitro e in vivo in un modello preclinico di sclerosi multipla.

Introduzione

Cellule dendritiche (DCs) sono parte integrante del sistema immunitario innato e sono stati scoperti e caratterizzate da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 come antigene professionale primario che presenta cellule1. DCs hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nell'attivazione del sistema immunitario con la presentazione di antigeni processati a cellule T e cellule di B via complessi di istocompatibilità (MHC) negli organi linfoidi secondari per collegare il sistema immunitario innato e adattivo2. Nel sistema immunitario mammifero, ci sono almeno due categorie di DCs che sono stati descritti come DCs mieloidi e plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloidi, noto anche come DCs convenzionali (cDCs), sono caratterizzati dall'espressione di CD11c e possono essere differenziati come immaturi DCs (IDC) in vitro da cellule progenitrici del midollo osseo o monociti del sangue periferico mediante del granulocyte-macrofago-colony-stimulating factor (GM-CSF) e IL-4 in specie murina o umano, rispettivamente4.

Segnali di attivazione «pericolo», come pattern molecolari associati (PAMP) o pattern molecolari associati danni (umido), guiderà iDCs maturazione verso immunogeno DCs come DC mature (MDC) via vincolanti per diversi recettori di riconoscimento di pattern la superficie di DC5. Proliferazione delle cellule T naive e differenziazione con il upregulation di MHCII2, ligandi costimolazione (CD80, CD86 e CD40)6, citochine e altri mediatori solubili7prime immunogeno DCs ulteriormente. Una cascata di produzione mediatore pro-infiammatorio da DCs immunogeno è essenziale per il differenziamento di citochina-mediata delle cellule di T. Ad esempio, sia di IFN-γ e di IL-12 sono necessari per Th1 differenziazione8 e il-1, IL-6 e IL-23 sono critici per ingenuo polarizzazione delle cellule T nei confronti di cellule Th179. Anche se DC mature reagire agli antigeni stranieri, attivazione incontrollata di DC di auto-antigeni può causare ablazione di tolleranza e favorire lo sviluppo delle malattie autoimmuni tramite la generazione di cellule T autoreattive cui attivazione porta alla distruzione del tessuto10 .

I rapporti recenti hanno fornito prove evidenti della plasticità DC, esemplificato dalla loro capacità di interagire con diversi spunti nel loro microambiente di tessuto e di differenziarsi in sottogruppi distinti dell'effettore/soppressore DC. I mediatori anti-infiammatori, quali IL-10,11, TGF-β12e13 di HO-1 hanno dimostrati di giocare un ruolo importante nella soppressione immune inducendo tollerogeniche DCs (TolDCs). Questi TolDCs acquisire funzioni di regolamentazione e sopprimere la proliferazione di cellule T14. Inoltre, la mancanza di co-stimolazione di DCs e la produzione di mediatori anti-infiammatori da TolDCs sia contribuire all'induzione di cellule T regolatorie (Treg) e anche efficacemente inibire la differenziazione e l'espansione sia Th1 e Th1715. In oltre due decenni, il potenziale terapeutico di TolDCs è stato segnalato da parecchi ricercatori. In questi studi, la somministrazione di ex vivo generata TolDCs non solo ha migliorato i sintomi patologici in diversi modelli preclinici di malattie autoimmuni16 ma inoltre ha condotto allo sviluppo della tolleranza immunitaria nei pazienti17 ,18. È interessante notare che, oggi la terapia TolDCs è stata considerata come un approccio alternativo o adjunctive per le malattie autoimmuni in diversi studi clinici, tra cui tipo 1 diabete mellito19, artrite reumatoide20, 21, sclerosi a placche (MS)22,23,24e di malattia di Crohn25.

Ci sono una varietà di protocolli che sono stati impiegati per sviluppare TolDCs e diversi laboratori sono segnalati i metodi per la generazione e caratterizzazione fenotipica di TolDCs. Questi metodi possono essere utilizzati per generare riproducibile TolDCs in vitro da progenitori ematopoietici e per mantenerli stabilmente in un tollerogeniche stato vivo26,27,28,29. Il iDCs può essere convertito in TolDCs tramite l'esposizione ai vari agenti farmacologici immunomodulatori o citochine antinfiammatorie. Ad esempio, la vitamina D3 è un noto agente farmacologico noto per aumentare la produzione di IL-10 e sopprimere la secrezione di IL-12 da DCs e quindi Spinta loro funzione immunosopressiva30. Inoltre, quando DCs sono esposte a stimoli infiammatori potenti, quali i lipopolisaccaridi (LPS), diversi agenti farmacologici quali desametasone31, rapamicina32e corticosteroidi33 sono stati indicati per indurre la Fenotipo TolDC riducendo l'espressione di superficie di CD40, CD80, CD86 e MHCII34DC. IL-10 e TGF-β sono le citochine antinfiammatorie più studiato per indurre tolleranza di DC35 e l'esposizione concomitante ad entrambe queste citochine sono state indicate per indurre un fenotipo tollerogeniche in DCs36.

Dal tollerogeniche DC è definito dalle caratteristiche funzionali piuttosto che di marcatori fenotipici, c'è un grande bisogno di sviluppare un metodo coerente per caratterizzazione cellulare e funzionale di TolDCs. Inoltre, occorre stabilire un protocollo rigoroso e coerenza per la costante valutazione e caratterizzazione del fenotipo di cellule DC tollerogeniche se siamo in modo efficace e riproducibile confrontare la capacità di nuovi agenti di indurre il fenotipo di TolDC nella laboratorio. Qui forniamo un protocollo dettagliato con metodi dettagliati per isolare iDCs da progenitori ematopoietici dei topi e successivamente analizzare l'efficacia di nuovi agenti nell'ambito della valutazione per la loro capacità di convertire iDCs in TolDCs, che fornisce un robusto caratterizzazione fenotipica e funzionale di TolDCs sia in vitro che in vivo. Questa descrizione include un metodo elaborato per caratterizzare il TolDCs da loro leganti di superficie, il profilo di citochina e funzioni immunosoppressive in vitro. Forniamo anche un esempio di un metodo per esplorare il potenziale applicazione terapeutica di questi TolDCs in un modello preclinico di MS, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo stabilito aiuterà i ricercatori a valutare la capacità di nuovi agenti per promuovere l'induzione di TolDCs e faciliterà lo sforzo per ampliare l'ambito di sviluppo terapeutico TolDC.

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Protocollo

Tutti gli studi sono stati effettuati nel rispetto delle procedure approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale della Case Western Reserve University School of Medicine.

1. preparare le cellule dendritiche derivate da midollo osseo (BMDCs)

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.
  2. Eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Asportare le ossa tibia-perone e femore utilizzando una forbice chirurgica e metterli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 10 cm.
  3. Utilizzare lame chirurgiche e forcipe per dissecare tessuto via quanto possibile sul coperchio di 10 cm cultura piatto e isolare delle tibie e femori di inserirli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 6 cm.
  4. Utilizzare lame chirurgiche per tagliare entrambe le estremità delle tibie e femori. Utilizzare 3 mL di PBS in siringa da 3 ml con un ago di 23G per svuotare il contenuto del midollo da un'estremità delle ossa in una provetta conica contenente 12 ml di PBS. Ripetere questo passaggio 3x per ciascuna estremità delle ossa.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.
  6. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di tampone lisante per ACK per 5 minuti rimuovere le cellule di anima rosse.
  7. Aggiungere 9 ml di PBS per diluire il tampone lisante ACK e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
  8. Rimuovere il supernatante e risospendere con 10 ml terreno di coltura (RPMI-1640 plus L-Glutammina, 10% FBS, 1% non essenziali aminoacidi (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanolo e 5% di penicillina/streptomicina).
    Nota: Il livello dell'endotossina dev'essere inferiore a 0,1 EU/ml in FBS.
  9. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 40 μm e prendere 20 µ l di sospensione cellulare e mescolare con 80 µ l di trypan blu per contare il numero di cellule vive di citometro.
  10. Regolare il numero di cellulare a 1 x 106 cellule/ml a 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.
  11. Piastra 3 ml di 1 x 106 cellule/ml in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Le cellule del midollo osseo da un mouse è intorno 3-5 x 107 cellule, indicando che può essere collocato da 2 a 3 piastre da 6 pozzetti.
  12. Il giorno 3, rimuovere tutti i 3 ml di terreno di cultura da ogni pozzetto, aggiungere 2 ml di PBS fresco in ciascun pozzetto e quindi ruotare delicatamente la piastra per garantire la rimozione di tutte le cellule non-aderenti.
  13. Sostituire 3 ml terreno di coltura nuovo con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2.
  14. Il giorno 5, aggiungere direttamente un altro 3 ml terreno di coltura fresco con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37° C, 5% CO2 e 95% di umidità nell'incubatore CO2 .
    Nota: Il volume totale in ciascun pozzetto è ora 6 ml.
  15. Il giorno 7, mettere l'intera piastra in ghiaccio per 10 minuti. Pipettare delicatamente il terreno di coltura in ogni pozzetto per sloggiare il vagamente-aderente BMDCs come iDCs in sospensione.
    Nota: I macrofagi aderenti sono ancora collegati alla piastra. Procedure e delicatamente a bassa temperatura sono la chiave per evitare l'attivazione delle DC per interessare ulteriori esperimenti.
  16. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti e risospendere con terreno di coltura fresco per ulteriori esperimenti.
    Nota: BMDCs può essere identificato con anticorpo marcato con fluorescenza di CD11c tramite flusso cytometry e ci ha mostrato la nostra strategia di gating di BMDCs per ulteriori esperimenti in Figura 1.

2. caratterizzare il Gene TolDC e profilo proteico

  1. Piastra 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 h a 37 ° C e 95% di umidità nell'incubatore CO2 e 5% CO2 .
    Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintetico, è un fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 induttore di fattore (Nrf2) e fattore-κB nucleare (n-f-κB) inibitore. Applicare altri agenti per l'induzione di TolDCs da IDC, quali IL-10, vitamina D3, desametasone o BAY 11-7085 e modificare questo passaggio a una condizione ottima per ogni agente.
  2. Aggiungere 10 o 100 ng/ml di LPS per l'incubazione di 4-24 ore per indurre MDC (tempo di incubazione è diverso a causa della misura di mRNA e proteina).
  3. Delicatamente Pipettare il terreno di coltura in ciascun pozzetto e raccogliere la sospensione cellulare mediante pipetta da 1 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti raccogliere le cellule e il surnatante, rispettivamente.
  4. Analizzare i leganti di superficie dai pellet cellulare mediante citometria a flusso, come stimolatore ligandi: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o inibitori ligandi: PD-L1, L2-PD, ILT3, ILT4.
  5. Isolare il RNA dai pellet cellulare e analizzare il RNA e il surnatante campioni per i livelli di profilo e gene e della proteina di cytokine di PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) ed ELISA, rispettivamente.
    Nota: per esempio, le citochine infiammatorie: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL 23 o anti-infiammatori citochine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.

3. valutare la funzione di TolDCs In Vitro e In Vivo

  1. Analisi di proliferazione Syngeneic della T-cellula
    1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.
    2. Preparare il tampone di Mac utilizzando 0,5% albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA in 500 ml di PBS. Sterilizzare il buffer filtrando attraverso un filtro da 0,2 µm.
      Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante il seguente esperimento.
    3. Per ottenere CD4+ T cellule, eutanasia topi transgenici di OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche.
    4. Mettere la milza con 2 ml di PBS in una piastra di coltura di 6 cm e utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare la milza passando un colino di cella 40 μm.
    5. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
    6. Risospendere il pellet cellulare in 400 μl di tampone di MACS.
    7. Aggiungere 100 μl di CD4 T Cell biotina-anticorpo Cocktail+ a 4° C per 5 minuti.
      Nota: L'anticorpo cocktail lega su altri tipi di cellule tranne CD4+ T cellule, quali CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC di classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.
    8. Aggiungere 300 μl di tampone di MACS e 200 μl di perline anti-biotina (Tabella materiali) a 4° C per 10 minuti.
    9. Luogo la colonna composto di sfere ferromagnetici (Tabella materiali) e filtro pre-separazione insieme in magnetico campo e sciacquarlo con 3 ml di tampone di MACS.
    10. Aggiungere 9 ml di buffer di Mac nelle cellule e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
    11. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone di MACS e applicare sulla colonna. Raccogliere flusso-attraverso CD4 contenenti+ T cellule.
    12. Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone Mac e anche raccogliere il flusso continuo.
    13. Per ottenere il pan splenica DCs, eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche. Mettere la milza in una piastra di coltura 6cm contenente 2 ml di soluzione della collagenosi D (collagenasi 2 mg/ml D disciolto in HBSS contenenti calcio, magnesio).
    14. Iniettare 1 ml di soluzione di collagenasi D alla milza due volte con una siringa da 1 ml e un ago 25G. Tagliate la milza a pezzetti con piccole forbici.
    15. Agitare ed incubare a temperatura ambiente per 25 minuti.
    16. Aggiungere 500 μl di EDTA 0.5 M a temperatura ambiente per 5 minuti.
      Nota: I passaggi da 3.1.13-3.1.14 sono fondamentali per aumentare la resa di DCs.
    17. Ora è possibile utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare il liquame di milza passando un colino di cella 40 μm e raccogliere la sospensione cellulare mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.
    18. Risospendere il pellet cellulare in 350 μl di tampone MACS, 50 μl di Reagente Bloccante FcR e 100 μl di Pan dendritiche cella biotina-anticorpo Cocktail a 4° C per 10 minuti.
      Nota: L'anticorpo cocktail contro gli antigeni che non sono espressi da DCs.
    19. Lavare le cellule con l'aggiunta di 9 ml di buffer di MACS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
    20. Risospendere il pellet cellulare in 800 μl di tampone di MACS e aggiungere 200 μl di anti-biotina perline a 4 ° C per 10 minuti.
    21. Ripetere i passaggi da 3.1.9-3.1.11 per raccogliere DCs.
    22. Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone di MACS due volte e anche raccogliere il flusso continuo.
    23. Trattare il 2 x 105 DCs/ml in presenza o assenza di cellule di T di 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C per 1 ora separatamente, etichetta il CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C per 15 minuti, lavare con PBS e regolare il volume per ottenere la concentrazione finale a 2 x 106 T cellule/ml.
    24. Successivamente, in una piastra a 96 pozzetti, co-cultura 100 μl di cellule dendritiche trattate con lo stesso volume di CFSE-labeled CD4 cellule+ T, entrambi raccolti dai passaggi precedenti per ottenere 01:10 ratio. Ora aggiungere 100 ng/mL ovoalbumina (uova) peptide 323-329 al bene e misura l'intensità CFSE delle T cellule tramite flusso cytometry dopo 2-3 giorni di incubazione.
      Nota: I numeri di cellulare e rapporto di DCs e T cellule sono state ottimizzate dal nostro precedente lavoro37.
  2. Indurre il passivo EAE iniettando BMDCs pulsata con Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) (35-55)
    1. Piastra da 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 ora.
    2. Aggiungere 10 ng/ml di LPS per incubazione 24 hrs.
    3. Aggiungere 100 μg/ml di MOG (35-55) per incubazione 4 hrs.
    4. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
    5. Risospendere il pellet cellulare con PBS e contare le celle.
    6. Iniettare per via sottocutanea 200 μl di 2 x 106 cellule ai topi C57BL/6 femminili di 8-10 settimane vecchio (100 μl in ogni gamba posteriore).
    7. Il giorno dell'iniezione di BMDC e 48 hrs. più tardi, iniettare 200 ng di tossina della pertosse (PTX) in ogni mouse.
    8. Ripetere i passaggi 3.2.6-3.2.7 una volta a settimana per 4 settimane consecutive.
    9. Valutare i sintomi clinici di EAE quotidianamente utilizzando criteri standard37 (0,5-zoppicare coda, coda 1-zoppicare, debolezza dell'arto posteriore di 2-moderato, 3-severa dell'arto debolezza, paralisi dell'arto posteriore 4-completare, stato 5-quadriplegia o moribondo, 6-morte).

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Risultati

La differenziazione e la selezione di BMDCs:

Cellule progenitrici del midollo osseo sono state coltivate in terreno RPMI completo in presenza di GM-CSF e IL-4 di differenziarsi in IDC per 7 giorni (Figura 1A). Il giorno 1, cellule erano di piccole dimensioni ed ha mostrato la morfologia sferica. Lavaggio con PBS prima la sostituzione del mezzo fresco il giorno 3 aiutato cellule ai c...

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Discussione

Questo documento descrive un efficiente protocollo che può essere utilizzato per riproducibile per generare iDCs e successivamente li differenziano in TolDCs, e proponiamo che questo può essere applicato per valutare la capacità di nuovi agenti a bersaglio molecolare per indurre il TolDC fenotipo. Come descritto in questo rapporto, abbiamo seguito una sequenza in cui abbiamo analizzato prima TolDC espressione di leganti di superficie tramite flusso cytometry, seguito da una valutazione del profilo di citochina DC come...

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Divulgazioni

Nessuno

Riconoscimenti

Ringraziamo Reata Pharmaceuticals per la fornitura di CDDO-DFPA. Riconosciamo anche il supporto del Jane e Lee Seidman Chair in innovazione di cancro pediatrico (John Letterio). Questo lavoro è stato sostenuto dal dipartimento della difesa [W81XWH-12-1-0452]; l'iniziativa di ricerca cancro adulti Angie Fowler adolescente e giovane al caso Comprehensive Cancer Center; e il premio di studioso di Callahan laureato per Hsi-Ju Wei da F.J. Callahan Foundation.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house synthesisCell culture
Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC differentiation
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Cell culture
β-mercaptoethanolSigma Aldrich Inc.516732Cell culture
Pertussis toxin (PTX)R&D systems3097EAE induction
MOG (35–55) peptide21stCentury Biochemicalsin house synthesisEAE induction
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Cell culture
Non-essential amino acid (100X)ThermoFisher Scientific11140050Cell culture
HEPESThermoFisher Scientific15630080Cell culture
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140122Cell culture
40 μm cell strainerCorning352340Cell isolation
PE-conjugated CD80BD Biosciences557227Flow cytometry
PE-conjugated CD86BD Biosciences555665Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1BioLegend124307Flow cytometry
APC-conjugated MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Flow cytometry
APC-conjugated CD11cBD Biosciences340544Flow cytometry
Isotype matched PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Flow cytometry
Isotype matched APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Flow cytometry
CFSEBioLegend423801T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
ACK lysing bufferThermoFisher ScientificA1049201BMDC differentiation
1 ml syringeBD Biosciences309626T cell proliferation assay
3 ml syringeBD Biosciences309588BMDC differentiation
25G needleBD Biosciences309626T cell proliferation assay
23G needleBD Biosciences309588BMDC differentiation
BSASigma Aldrich Inc.A2058T cell proliferation assay
EDTAThermoFisher Scientific15575020T cell proliferation assay
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T cell proliferation assay
Pre-Separation FilterMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T cell proliferation assay
collagenase DSigma Aldrich Inc.11088858001T cell proliferation assay
HBSSThermoFisher Scientific14025076T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329Sigma Aldrich Inc.O1641T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR&D systemsDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR&D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR&D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibodyAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actin antibodyAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometry

Riferimenti

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
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