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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Zusammenfassung

Das Immunsystem arbeitet durch ein enge Verhältnis zwischen koordinierenden Antworten gegen fremde Antigene und Pflege einen nicht interaktiver Status gegen selbstantigenen sowie Antigene von Kommensalen Organismen abgeleitet. Die Störung dieser immun Homöostase kann zu chronischen Entzündungen und zur Entwicklung von Autoimmunität führen. Dendritische Zellen (DCs) sind die professionellen Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems beteiligt bei der Aktivierung von naiven T-Zellen um Immunantworten gegen fremde Antigene zu initiieren. DCs können jedoch auch in TolDCs unterschieden werden, die dienen zur Wahrung und Förderung der T-Zell Toleranz und Effektorzellen zur Entwicklung entweder Autoimmun- oder chronischen Entzündungen Bedingungen zu unterdrücken. Die jüngste Weiterentwicklung in unserem Verständnis des TolDCs legt nahe, dass DC Toleranz durch modulieren ihre Differenzierung Bedingungen erreicht werden kann. Dieses Phänomen führte zu enormen Wachstum in den Entwicklungsländern TolDC Therapien für zahlreiche Erkrankungen des Immunsystems verursacht durch Immuntoleranz zu brechen. Erfolgreiches Studium in präklinischen Autoimmunität murinen Modellen haben weiter die Immuntherapie Nützlichkeit des TolDCs bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen bestätigt. Heute haben TolDCs ein viel versprechendes Instrument der Immuntherapie in der Klinik für Wiederherstellung der Immuntoleranz in verschiedenen Erkrankungen des Immunsystems durch gezielte pathogene autoimmune Reaktionen, wobei schützende Immunität intakt bleiben. Obwohl eine Reihe von Strategien von mehreren Labs induzieren TolDCs vorgeschlagen wurde, gibt es keine Einheitlichkeit bei der Charakterisierung des zellulären und funktionale Phänotyps dieser Zellen. Dieses Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung für die Entwicklung von Knochenmark stammenden DCs in großer Zahl, eine einzigartige Methode zur Unterscheidung in TolDCs mit einem synthetischen Triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic Säure-Difluoro-Propyl-Amid (CDDO-DFPA), und die Techniken verwendet, um deren Phänotyp, einschließlich Analyse der wesentlichen Molekulare Signaturen des TolDCs bestätigen. Zu guter Letzt zeigen wir eine Methode, um TolDC Funktion zu beurteilen, indem Sie testen ihre immunsuppressive Antwort in Vitro und in Vivo in einem präklinischen Modell der multiplen Sklerose.

Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) waren sind fester Bestandteil des angeborenen Immunsystems zuerst entdeckt und gekennzeichnet durch Ralph Steinman und Zanvil Cohn 1973 als primäre professionelle Antigen präsentierenden1 Zellen. DCs haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in Immunaktivierung spielen, verarbeitete Antigene an T-Zellen und B-Zellen über große Histocompatibility komplexe (MHC) in sekundären lymphatischen Organe verbinden die angeborenen und der adaptiven Immunsystem2präsentiert. In den Säugetieren Immunsystem gibt es mindestens zwei Kategorien von DCs die myeloische DCs und DCs (pDCs)3plasmazytoide beschrieben sind. Myeloische DCs, auch bekannt als konventionelle DCs (cDCs), zeichnen sich durch die Expression von CD11c und kann als unreif DCs (iDCs) in Vitro aus Vorläuferzellen des Knochenmarks oder peripherem Blut Monozyten mit unterschieden werden Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) und IL-4 in murinen oder menschlichen Arten, bzw.4.

Aktivierung von "Gefahr" signalisiert, wie Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (feucht), fahren iDCs Reifung in Richtung immunogen DCs als Reife DCs (mDCs) über verschiedene Muster Anerkennung Rezeptoren für verbindlich die DC Oberfläche5. Immunogen DCs weitere erstklassige naive T-Zell-Proliferation und Differenzierung durch Hochregulation der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG2, costimulatory Liganden (CD40, CD80 und CD86)6, Zytokine und andere lösliche Mittler-7. Eine Kaskade von Pro-inflammatorischen Mediator Produktion von immunogen DCs ist essentiell für Zytokin-vermittelte T-Zell-Differenzierung. IFN-γ und IL-12 sind notwendig für Th1 Differenzierung8 und IL-1, sind beispielsweise IL-6 und IL-23 für naive T-Zelle Polarisation Richtung Th17 Zellen9von entscheidender Bedeutung. Obwohl Reife DCs auf fremde Antigene reagieren, unkontrollierte DC-Aktivierung von selbstantigenen Toleranz Ablation verursachen und fördern die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen durch die Generierung von autoreaktiven T-Zellen, deren Aktivierung zur Zerstörung des Gewebes10 führt .

Die jüngsten Berichte lieferten eindeutige Beweise für DC Plastizität, veranschaulicht durch ihre Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Queues innerhalb ihrer Mikroumgebung Gewebe und in verschiedenen Effektor/Suppressor DC Teilmengen zu unterscheiden. Die Anti-inflammatorische Mediatoren wie IL-10-11, TGF-β12und HO-113 haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei Immunsuppression durch Induktion tolerogene DCs (TolDCs) zu spielen. Diese TolDCs regulatorische Funktionen erwerben und T-Zell-Proliferation-14zu unterdrücken. Darüber hinaus das Fehlen der Ko-Stimulation von DCs und die Produktion von Anti-inflammatorische Mediatoren aus TolDCs sowohl zur Induktion von regulatorischen T-Zellen (Tregs) beitragen und auch effektiv hemmen Th1 und Th17 Differenzierung und Erweiterung15. In vergangenen zwei Jahrzehnten wurde durch mehrere Untersucher das therapeutische Potenzial von TolDCs berichtet. In diesen Studien die Verwaltung der Ex-Vivo erzeugt nicht nur gelindert TolDCs pathologische Symptome in präklinischen Modellen von Autoimmunerkrankungen16 aber führte auch zur Entwicklung der Immuntoleranz bei Patienten17 ,18. Interessant ist, heute die TolDCs Therapie galt als alternative oder Zusatztherapie Ansatz für Autoimmunerkrankungen in mehreren klinischen Studien, einschließlich 1 Diabetes Mellitus19, rheumatoider Arthritis20, Typ 21, Multiple Sklerose (MS)22,23,24und Crohns Krankheit25.

Es gibt eine Vielzahl von Protokollen, die beschäftigt sind, TolDCs zu entwickeln und mehrere Labore haben Methoden zur Generierung und phänotypischen Charakterisierung des TolDCs berichtet. Diese Methoden können reproduzierbar TolDCs in Vitro aus hämatopoetischen Vorläuferzellen zu generieren und, sie in einem tolerogene Zustand in Vivo26,27,28,29stabil zu halten. Die iDCs kann durch die Einwirkung von verschiedenen immunmodulatorischen pharmakologische Wirkstoffe oder Anti-inflammatorische Zytokine TolDCs umgewandelt. Vitamin D3 ist beispielsweise eine bekannte pharmakologische Agenten bekannt erweitern Produktion von IL-10 und IL-12 Sekretion von DCs zu unterdrücken und damit ihre immunsuppressive Funktion30steigern. Darüber hinaus Wenn DCs starke entzündliche Reize wie Lipopolysacchariden (LPS), ausgesetzt sind mehrere pharmakologische Wirkstoffe wie Dexamethason31, Rapamycin32und Kortikosteroide33 haben gezeigt, dass induzieren die TolDC Phänotyp durch Verringerung der DC oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG34. IL-10 und TGF-β sind die meisten studiert Anti-inflammatorische Zytokine, DC Toleranz35 und die gleichzeitige Exposition gegenüber beide dieser Zytokine induzieren nachweislich zu tolerogene Phänotyp in DCs36zu induzieren.

Seit der tolerogene DC von funktionellen Eigenschaften definiert ist, anstatt durch phenotypische Marker gibt es muss eine große eine einheitliche Methode zur zellulären und funktionelle Charakterisierung des TolDCs zu entwickeln. Darüber hinaus eine strenge und konsequente Protokoll muss für die einheitliche Bewertung und Charakterisierung von tolerogene DC-Phänotyp festgestellt werden, wenn wir effektiv und reproduzierbar die Möglichkeit neuer Wirkstoffe induzieren TolDC Phänotyp in vergleichen sollen die Labor. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll mit schrittweisen Methoden iDCs von hämatopoetischen Vorläuferzellen von Mäusen isolieren und anschließend die Wirksamkeit neuer Wirkstoffe in der Bewertungsphase für ihre Fähigkeit zur TolDCs, iDCs umzuwandeln analysieren bietet eine robuste phänotypische und funktionelle Charakterisierung des TolDCs in Vitro und in Vivo. Diese Beschreibung umfasst eine aufwändige Methode zur Charakterisierung des TolDCs durch ihre Oberfläche Liganden, Cytokine Profil und immunsuppressive Funktionen in Vitro. Wir bieten auch ein Beispiel für eine Methode, um die mögliche therapeutische Anwendung dieser TolDCs in einem präklinischen Modell der MS, Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu erkunden. Dieses etablierte Protokoll hilft Ermittlern auszuwertende die Kapazität der neuen Agenten, die Induktion von TolDCs zu fördern und die Bemühungen um die Ausweitung der therapeutischen Entwicklung TolDC erleichtern.

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Protokoll

Alle Studien wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Verfahren, die von der Case Western Reserve University School of Medicine der institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Vorbereiten des Knochenmarks-abgeleitete dendritischer Zellen (BMDCs)

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.
  2. Einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Verbrauchsteuern Sie Tibia-Fibula und Femur-Knochen mit einer chirurgischen Schere und legen Sie sie mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 10 cm.
  3. Chirurgische Messer und Zange verwenden, um Gewebe entfernt sezieren so weit wie möglich auf dem Deckel des 10 cm Kultur Gericht und Isolierung von Gebeinen und Oberschenkelknochen zu platzieren mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 6 cm.
  4. Verwenden Sie chirurgische Sägeblätter, um beide Enden der Schienbeine und Oberschenkelknochen zu trimmen. Verwenden Sie 3 mL PBS in 3 ml Spritze mit einer Nadel 23G, um den Inhalt von Knochenmark von einem Ende der Knochen auf eine konische Rohr mit 12 ml PBS zu leeren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X für die beiden Enden der Knochen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 X g für 5 min.
  6. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 ml ACK lysiereinrichtung Puffer für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu entfernen.
  7. Fügen Sie 9 ml PBS verdünnen ACK lysiereinrichtung Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
  8. Den überstand zu entfernen und erneut mit 10 ml Kulturmedium (RPMI-1640 plus L-Glutamin, 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäure (100 X), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoethanol und 5 % Penicillin/Streptomycin).
    Hinweis: Endotoxin-Ebene muss weniger als 0,1 EU/ml in FBS.
  9. Die Zellsuspension durch ein 40 μm Zelle Sieb passieren und nehmen 20 µl Zellsuspension und mischen mit 80 µl Trypan blau, um die Anzahl der lebenden Zellen mithilfe Cytometer.
  10. Passen Sie die Anzahl von Zellen, 1 x 106 Zellen/ml mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4.
  11. 3 ml 1 x 106 Zellen/ml in jede Vertiefung des 6-Well-Platte-Platte und die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Die Knochenmarkzellen von einer Maus ist um 3-5 x 107 Zellen, die darauf hinweist, dass es von 2 bis 3 6-Well-Platten platziert werden kann.
  12. Am 3. Tag fügen Sie alle 3 ml Kulturmedium aus jedem Bohrloch entfernen 2 ml frische PBS in jede Vertiefung hinzu und dann schwenken Sie sanft die Platte, um sicherzustellen, entfernen alle nicht-anhaftende Zellen.
  13. 3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung zu ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator.
  14. Am 5. Tag direkt hinzufügen einer anderen 3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37° C, 5 % CO2, und 95 % Luftfeuchtigkeit im CO2 Inkubator.
    Hinweis: Das Gesamtvolumen in jede Vertiefung ist jetzt 6 ml.
  15. Am 7. Tag legte die gesamte Platte für 10 min auf Eis. Pipette vorsichtig das Kulturmedium in jede Vertiefung, die lose anhaftende BMDCs als iDCs in Suspension zu verdrängen.
    Hinweis: Die anhaftenden Makrophagen sind noch an der Platte befestigt. Niedrige Temperatur und sanft Verfahren sind der Schlüssel zur Vermeidung von DC-Aktivierung um weitere Experimente zu beeinflussen.
  16. Die Zellsuspension bei 300 X g für 5 Minuten zentrifugieren und Aufschwemmen mit frischem Nährmedium für weitere Experimente.
    Hinweis: BMDCs durch Durchflusszytometrie mit Fluoreszenz-markierten CD11c Antikörper identifiziert werden können und wir haben unsere gating Strategie des BMDCs für weitere Experimente in Abbildung 1gezeigt.

(2) charakterisieren Sie TolDC gen und Protein-Profil

  1. Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator CO2 1 h.
    Hinweis: CDDO-DFPA, eine synthetische Triterpenoid ist ein nuklearer Faktor (2 erythroiden abgeleitet) - wie - 2 Faktor (Nrf2) Induktor und nuklearer Faktor κB (NF-κB)-Inhibitor. Gelten Sie andere Agenten für die Induktion von TolDCs von iDCs, wie IL-10, Vitamin D3, Dexamethason oder Bucht 11-7085, und ändern Sie diesen Schritt, um eine optimale Voraussetzung für jeden Agenten.
  2. Fügen Sie 10 oder 100 ng/ml von LPS für die Inkubation 4-24 Std., induzieren mDCs (Inkubationszeit unterscheidet sich durch Messung von mRNA oder Protein).
  3. Sanft pipette das Kulturmedium in jede Vertiefung und ernten die Zellsuspension mit 1 ml-Pipette. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 Minuten, die Zellen und überstand, bzw. zu sammeln.
  4. Analysieren der Oberfläche Liganden aus der Zelle Pellets durch Durchflusszytometrie, wie stimulierende Liganden: CD40, CD80 und CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL oder hemmenden Liganden: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Isolierung der RNS aus der Zelle Pellets und analysieren die RNA und überstand Proben für die Cytokine Profil und gen und Protein Ebenen durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA, beziehungsweise.
    Hinweis: zum Beispiel, inflammatorische Zytokine: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 und IL-23 oder Anti-inflammatorische Zytokine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 und HO-1.

3. Beurteilung die Funktion des TolDCs In Vitro und In Vivo

  1. T-Zell-Phänomen Proliferation-Assay
    1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.
    2. Bereiten Sie MACS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 500 ml PBS vor. Sterilisieren Sie den Puffer durch durch einen 0,2 µm-Filter filtern.
      Hinweis: Halten Sie den Puffer auf dem Eis während das folgende Experiment.
    3. CD4 zu+ T Zellen, einschläfern OT-II T-Zell-Rezeptor (TCR) Transgene Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten.
    4. Legen Sie die Milz mit 2 ml PBS in einer Kulturschale 6 cm und mit der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze die Milz Zerkleinern, indem man ein Sieb 40 μm Zelle.
    5. Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
    6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 400 µl des MACS-Puffer.
    7. Fügen Sie 100 μl der CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail bei 4° C für 5 Minuten.
      Hinweis: Der cocktail Antikörper bindet auf andere Zelltypen außer CD4+ T-Zellen, wie z. B. CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-Klasse II, Ter-119 und TCRγ/δ.
    8. Fügen Sie 300 μl des MACS-Puffer und 200 μl des Anti-Biotin Perlen (Table of Materials) bei 4° C für 10 Minuten.
    9. Ort die Spalte aus der ferromagnetischen Sphären (Table of Materials) und Vorabscheidung Filter zusammen in dem magnetischen Feld und spülen Sie ihn mit 3 ml MACS-Puffer.
    10. Fügen Sie 9 ml MACS-Puffer in die Zellen und die Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
    11. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 ml MACS-Puffer und wenden Sie auf die Spalte. Sammeln Durchflussverfahren mit CD4+ T Zellen.
    12. Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer waschen und auch die Durchströmung zu sammeln.
    13. Um Milz Pfanne DCs zu erhalten, einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen mit CO2 Kammer ca. 8-10 Wochen alt. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Setzen die Milz in der 6cm Kulturschale mit 2 ml Kollagenase D-Lösung (2 mg/ml Kollagenase D aufgelöst in HBSS, enthält Kalzium, Magnesium).
    14. Spritzen Sie 1 ml der Kollagenase D Lösung zur Milz zwei Mal eine 1 ml Spritze mit einer Nadel 25G. Schneiden Sie die Milz mit einer kleinen Schere in kleine Stücke.
    15. Schütteln und Inkubation bei Raumtemperatur für 25 Minuten.
    16. Fügen Sie 500 µl 0,5 M EDTA bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
      Hinweis: Die Schritte von 3.1.13-3.1.14 sind entscheidend für die Erhöhung der Ausbeute von DCs.
    17. Jetzt mithilfe der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze mince der Milz Brei durch ein Sieb 40 μm Zelle vorbei und sammeln die Zellsuspension durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 Minuten.
    18. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 350 μl des MACS-Puffer, 50 μl der FcR Blocking Reagenz und 100 μl des Pan Dendritische Zelle Biotin-Antikörper Cocktail bei 4° C für 10 Minuten.
      Hinweis: Der Antikörper gegen Antigene, die nicht von DCs ausgedrückt sind cocktail.
    19. Waschen Sie die Zellen, indem 9 ml MACS-Puffer und Zentrifuge auf 300 X g für 5 Minuten.
    20. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 800 µl des MACS-Puffer und fügen Sie 200 μl des Anti-Biotin Perlen bei 4 ° C für 10 Minuten.
    21. Wiederholen Sie die Schritte aus 3.1.9-3.1.11 DCs zu sammeln.
    22. Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer zwei Mal waschen und auch die Durchströmung sammeln.
    23. 2 x 105 DCs/ml mit 1 μM CFSE bei 37 ° C für 15 Minuten in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA bei 37 ° C für 1 Stunde separat, Beschriftung der CD4+ -T-Zellen (1 x 107/ml) zu behandeln, Waschen mit PBS , und passen Sie die Lautstärke um Endkonzentration bei 2 x 106 T Zellen/ml zu erhalten.
    24. Als nächstes in eine 96-Well-Platte Co Kultur 100 μl der behandelten dendritischen Zellen mit dem gleichen Volumen des CFSE--mit der Bezeichnung CD4+ T-Zellen, beide gesammelt aus den oben genannten Schritte, um 01:10 Verhältnis. Fügen Sie jetzt 100 ng/mL Ovalbumin (OVA) Peptid 323-329 pro Brunnen und messen die Intensität der CFSE-der T-Zellen durch Durchflusszytometrie nach 2-3 Tagen Inkubationszeit.
      Hinweis: Die Zellzahlen und das Verhältnis von DCs und T Zellen aus unserer bisherigen Arbeit37optimiert worden.
  2. Induzieren passiv EAE durch die Injektion von BMDCs gepulst mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) (35-55)
    1. Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation von 1 Stunde.
    2. Fügen Sie 10 ng/ml von LPS für Inkubation 24 hrs.
    3. Hinzufügen von 100 μg/ml MOG (35-55) für die Inkubation 4 Stunden.
    4. Ernte der Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
    5. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit PBS und die Zellen zu zählen.
    6. Subkutan Spritzen Sie 200 μl der 2 x 106 Zellen auf ca. 8-10 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen (100 μl in jedem Hinterbein).
    7. Am Tag der Injektion BMDC und 48 Stunden. später, injizieren 200 ng Pertussis-Toxin (PTX) in jeder Maus.
    8. Wiederholen Sie Schritte 3.2.6-3.2.7 einmal pro Woche für 4 Wochen.
    9. Die klinischen Symptome der EAE täglich mithilfe von Standardkriterien37 (0,5-hinken Endstück, 1-hinken Rute, 2-mäßig Hind Gliedmaßen Schwäche, 3 schwere Hind Gliedmaßen Schwäche, 4 komplette Hind Extremität Lähmung, 5-Tetraplegie oder sterbenden Zustand, 6-Tod) zu bewerten.

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Ergebnisse

Die Differenzierung und die Auswahl von BMDCs:

Vorläuferzellen des Knochenmarks wurden komplette RPMI Medium im Beisein von GM-CSF und IL-4 in iDCs für 7 Tage (Abbildung 1A) differenzieren kultiviert. Am 1. Tag Zellen waren klein und zeigte sphärische Morphologie. Waschen mit PBS, bevor die Ersetzung der frisches Medium am Tag3 Zellen zur Form Cluster beigetragen und auch die Ein...

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Diskussion

Dieses Paper beschreibt ein effizientes Protokoll, das die reproduzierbar iDCs generieren und anschließend Unterscheidung in TolDCs verwendet werden kann, und wir schlagen vor, dies angewendet werden, kann um die Kapazität der neuen molekularen Ziel Agenten induzieren die TolDC bewerten Phänotyp. Wie in diesem Bericht beschrieben, folgten wir eine Sequenz, in der ersten TolDC Ausdruck der Oberfläche Liganden durch Durchflusszytometrie, gefolgt von einer Bewertung der DC Cytokine Profil qRT-PCR und ELISA gemessen anal...

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Offenlegungen

Keine

Danksagungen

Wir danken für die Bereitstellung von CDDO DFPA Reata Pharma. Wir anerkennen auch die Unterstützung von Jane und Lee Seidman Lehrstuhl für Pädiatrie Krebs Innovation (John Letterio). Diese Arbeit wurde unterstützt vom Verteidigungsministerium [W81XWH-12-1-0452]; die Angie Fowler Jugendlichen und jungen Erwachsenen Krebs Forschungsinitiative an dem Fall Comprehensive Cancer Center; und dem Callahan Absolvent Scholar Award for Hsi-Ju Wei von f.j. Callahan-Stiftung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house synthesisCell culture
Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC differentiation
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Cell culture
β-mercaptoethanolSigma Aldrich Inc.516732Cell culture
Pertussis toxin (PTX)R&D systems3097EAE induction
MOG (35–55) peptide21stCentury Biochemicalsin house synthesisEAE induction
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Cell culture
Non-essential amino acid (100X)ThermoFisher Scientific11140050Cell culture
HEPESThermoFisher Scientific15630080Cell culture
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140122Cell culture
40 μm cell strainerCorning352340Cell isolation
PE-conjugated CD80BD Biosciences557227Flow cytometry
PE-conjugated CD86BD Biosciences555665Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1BioLegend124307Flow cytometry
APC-conjugated MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Flow cytometry
APC-conjugated CD11cBD Biosciences340544Flow cytometry
Isotype matched PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Flow cytometry
Isotype matched APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Flow cytometry
CFSEBioLegend423801T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
ACK lysing bufferThermoFisher ScientificA1049201BMDC differentiation
1 ml syringeBD Biosciences309626T cell proliferation assay
3 ml syringeBD Biosciences309588BMDC differentiation
25G needleBD Biosciences309626T cell proliferation assay
23G needleBD Biosciences309588BMDC differentiation
BSASigma Aldrich Inc.A2058T cell proliferation assay
EDTAThermoFisher Scientific15575020T cell proliferation assay
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T cell proliferation assay
Pre-Separation FilterMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T cell proliferation assay
collagenase DSigma Aldrich Inc.11088858001T cell proliferation assay
HBSSThermoFisher Scientific14025076T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329Sigma Aldrich Inc.O1641T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR&D systemsDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR&D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR&D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibodyAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actin antibodyAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometry

Referenzen

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
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