Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتصنيع لوحات نانوباتيرن التدرج عبر نانويمبرينتينج الحرارية وطريقة فحص استجابات الخلايا البشرية السلف بطانية للنانو. باستخدام هذه التكنولوجيا الموصوفة، من الممكن لإنتاج سقالة التي يمكن التعامل مع سلوك الخلية بالمحفزات المادية.

Abstract

نانوتوبوجرافي يمكن العثور عليها في مختلف المصفوفات خارج الخلية (ECMs) في جميع أنحاء الجسم، ومن المعروف أن لديها الإجراءات التنظيمية الهامة عليها التفاعلات الخلوية. ومع ذلك، من الصعب تحديد العلاقة بين حجم نانوستروكتوري والردود الواردة من الخلايا نظراً لعدم وجود أدوات الفحص السليم. وهنا نعرض وضع لوحات نانوباتيرن التدرج استنساخه وفعالة من حيث التكلفة للتلاعب بالاستجابات الخلوية. استخدام أكسيد الألومنيوم انوديك (AAO) كقالب رئيسي، لوحات نانوباتيرن التدرج مع نانوبيلارس لزيادة قطرها يتراوح [120-200 نانومتر (GP 120/200) و 200-280 نانومتر (سباق الجائزة الكبرى 200/280) 280-360 نانومتر (GP 280/360)] كانت ملفقة من حرارية ولﻷخذ تقنية. هذه اللوحات نانوباتيرن التدرج صممت لتحاكي مختلف الأحجام من نانوتوبوجرافي في إدارة المحتوى في المؤسسة واستخدمت لفحص استجابات الخلايا البطانية البشرية تشكيل مستعمرة (هيكفكس). في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء خطوة بخطوة من اختﻻق لوحات نانوباتيرن التدرج للخلية الهندسة وتقنيات زراعة هيكفكس من الدم المحيطي البشري، واستزراع هيكفكس على لوحات نانوباتيرن.

Introduction

في الآونة الأخيرة، قد تم الأضواء استجابة الخلايا بالتحفيز المادي لتضاريس السطح في مجال الخلية الهندسة1،2،،من34. ولذلك، انصب الاهتمام أكثر في النانو ثلاثية الأبعاد في الخلية السطحية المرفق5. وأفيد أن إنتغرين، الذي هو الجهاز التعرف على سطح الخلية، ويحيل الحافز المادي مدفوعا بهياكل نانو الصغيرة لإدارة المحتوى في المؤسسة من خلال توصيل mechano6. ينظم سلوك الخلية من خلال التوجيه الاتصال7 هذا التحفيز الميكانيكي والحث على إعادة تنظيم سيتوسكيليتال تغيير الشكل، بالإضافة إلى التنسيق الالتصاقات وتصلب الخلايا8.

الخلايا البشرية السلف غشائي (هيبكس) في الجسم التفاعل عن كثب مع المكروية ECM المحيطة بها9. وهذا يشير إلى أن الحالة المادية لإدارة المحتوى في المؤسسة مثابة معياراً هاما للخلية المحددة-المصفوفة المعقدة التصاق تشكيل قدر إجهاد القص المستمدة من تدفق الدم10. وأفيد أن نانوتوبوجرافي السطحية ويعزز تشكيل شبكات أنابيب شعرية واسعة من هيبكس11 في المختبر وأن عاملاً لذوبان ECM/بيو مجتمعة نظام يتيح هيبكس الاعتراف بركائز مختلة ويعزز الجرح الشفاء12،13. ومع ذلك، لا يفهم وضوح العلاقة بين إدارة المحتوى في المؤسسة وهيبكس.

على الرغم من أن العديد من الباحثين حاولوا توضيح العلاقة بين استجابات الخلية والرموز المادية من ركائز مختلفة14،،من1516، هذه الدراسات تستخدم فقط في حجم ثابت من نانوستروكتوري أو نانوباتيرنس مع الترتيبات غير النظامية التي لها حد توضيح العلاقة بين حجم السلوك نانوستروكتوري وخلية. والمشكلة هنا هو الافتقار إلى الأدوات المناسبة لفحص الاستجابات الخلوية التي يمكن استبدال النهج القائمة مملة ومتكررة لإيجاد الحجم الأمثل نانوستروكتوري. ولذلك، مطلوب تقنية مباشرة لفحص ردود الفعل خلية على التحفيز الجسدي دون تكرار.

هنا، يمكننا وصف أسلوب يستخدم في أعمالنا السابقة تقارير18،،من1719 لإنتاج نانوباتيرن تدرج فيها قطر نانوبيلارس مرتبة يزيد تدريجيا. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف كيفية زراعة وتحليل سلوك هيكفكس في لوحات نانوباتيرن التدرج لتحديد تأثير المحفزات المادية على الخلايا. واستخدمت anodization معتدل، والنقش تدريجيا، وأسلوب طلاء طبقة اللصق المضادة اختﻻق التدرج AAO العفن. وباعتماد حرارية ولﻷخذ تقنية الطباعة الحجرية، أنتجت نانوباتيرنس التدرج البوليستيرين متطابقة بطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة. استخدام التدرج نانوباتيرنس، أنه من الممكن لتحديد حجم نانوستروكتوري له تأثير كبير على سلوك الخلية في مجموعة واحدة من التجربة. ونحن نتوقع أن هذا التدرج نانوباتيرن سوف تكون مفيدة في فهم آليات التفاعل بين هيكفك المستمدة من الدم أو الخلايا الأخرى وأحجام مختلفة من النانو.

Protocol

وأقر "مجلس المراجعة المؤسسية" في مستشفى أنام جامعة كوريا (رقم الكندي هذه الدراسة ED170495). وأجريت جميع الإجراءات وفقا "إعلان هلسنكي" وتعديلاته اللاحقة.

1-إعداد الركازة الألومنيوم (Al) من اليكتروبوليشينج

تنبيه: اليكتروبوليشينج والحل التآكل والسامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك النتريل قفازات ونظارات واقية ومعطف المعمل. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان.

  1. إعداد حل اليكتروبوليشينج بخلط إيثيل الكحول (2ح ج5أوه، 99.9 ٪) وحمض بيرتشلوريك (هكلو4، 60 في المائة) في كوب سترة مزدوجة 1 لتر (ج2ح5OH:HClO4 = 4:1).
  2. الاتصال الكأس سترة مزدوجة مدوار وضبط درجة الحرارة عند 7 درجة مئوية. وضعت الكأس سترة مزدوجة محرض مغناطيسية. اترك الحل تحت التحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 7 درجات مئوية.
  3. تزج لوحة بن عالي النقاوة (99.999%، 20 × 50 × 1 مم3) والكربون العداد الكهربائي في اليكتروبوليشينج الحل باستخدام مقاطع التماسيح والأسلاك النحاسية. ضبط موضع لوحة ال ومسرى الكربون مضادة لمواجهة بعضها البعض.
    ملاحظة: من الضروري تثبيت القصاصات بعناية حتى لا تتعرض للمس الحل. عند اتصال مع الحل، يمكن أن تلوث الشوائب المتدفقة من القصاصات لوحة ال.
  4. توصيل لوحة ال إلى محطة إيجابية، والكربون العداد الكهربائي إلى المحطة الطرفية السلبية، التيار المباشر (DC) إمدادات الطاقة.
  5. إيقاف محرض المغناطيسية وتطبيق جهد 20 ف الحفاظ على هذا الوضع لمدة 4 دقائق.
  6. تشغيل محرض المغناطيسية، والسماح للتيار بالتدفق لآخر دقيقة 6.
    ملاحظة: إزالة شرط ثابت معظم الشوائب وخشونة من لوحة ال، والشرط الحيوي يحسن نوعية اليكتروبوليشينج النهائية.
  7. إيقاف الإمداد بالطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. دقة تغسل لوحة ال مع المياه لإزالة جميع الحلول المتبقية.
  8. الجاف للوحة ال مع النيتروجين وتخزين تحت غاز خامل. إجراء عملية التجفيف هذه في نهاية كل التجارب في الخطوة 1 و 2.
    ملاحظة: عندما حقن الهواء المضغوط، وجعل تدفق الهواء من الجزء المصقول إلى الجانب الآخر. وفي حالة العكس، يمكن الهروب من الجزء غير مصقول الشوائب وتلويث لوحة ال.

2-تلفيق العفن AAO التدرج مع حمض الفوسفوريك المنحل بالكهرباء

تنبيه: الدخان والكحول الميثيل هي العين السامة. يمكن أن يؤدي التعرض المستمر للكروم للتسمم بالكروم خطيرة. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان.

  1. أنوديزيشن الأساسي
    1. لتحضير 1 لتر من حامض الفوسفوريك المنحل بالكهرباء، تحميل مل 590 من المياه في زجاجة زجاج.
    2. إضافة 400 مل الكحول الميثيل (CH3أوه، 99 في المائة) و 10 مل حامض الفوسفوريك (ح3ص4، 85 في المائة) في زجاجة زجاج. مزيج الحل كذلك بالهز يدوياً أو بإثارة المغناطيسية.
    3. صب 500 مل الكهرباء في كوب سترة مزدوجة 1 لتر. تزج Al مصقول لوحة والكربون مسرى العداد في الحل مع مقاطع التماسيح والأسلاك النحاسية.
    4. صب اﻻلكتروﻻيت إضافية لتحديد حدود اليكتروبوليشينج 2-3 مم فوق سطح الحل.
      ملاحظة: إذا نفذ أنوديزيشن مع حدود اليكتروبوليشينج لمس الحل، لوحة ال يميل إلى حرق خلال أنوديزيشن.
    5. تثبيت رمح عمودي على شكل U قاعدة التمثال. إرفاق محرض علوية، والمكره استخدام المشابك المعدنية. موقف المكره بالقرب من نهاية السفلي من كل أقطاب المروحة. تعيين سرعة دوران محرض النفقات العامة بين 200 و 300 دورة في الدقيقة.
    6. الاتصال الكأس سترة مزدوجة مدوار وضبط درجة حرارة في-10 درجة مئوية. ترك نظام على الأقل 1 ح تحت إثارة حتى تنخفض درجة الحرارة إلى-10 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا تستخدم الماء كالمبرد. نظراً لأن الماء يتجمد عند درجات حرارة منخفضة، لن تعمل على تداول عادة. من المستحسن استخدام خليط من الماء والكحول الاثيلي بنسبة 1:1 كالمبرد.
    7. تطبيق جهد 195 الخامس تحت التحريك ح 16.
      ملاحظة: إذا الحالي ارتفع أكثر من 50 mA ضمن 2 أو 3 ح بعد تطبيق الجهد، احتمال حدوث حرق مرتفع جداً. توقف العملية فورا واستبدال لوحة شركة واحدة جديدة. إذا كانت هذه المشكلة تحدث بشكل متكرر, تحقق من أن ليس هناك أي شذوذ في التحكم في درجة الحرارة مدوار. إذا لم يكن هناك لا شذوذ، تغيير الكهرباء.
    8. وقف إمدادات الطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. أغسل لوحة ال المؤكسد مع المياه لإزالة جميع الحلول المتبقية.
  2. شركة ألومينا النقش
    1. تحضير حمض الكروميك النقش الحل بتذويب ز 9.0 من أكسيد الكروم (CrO3) و 20.3 مل من حامض الفوسفوريك (ح3ص4، 85 في المائة) في 500 مل مياه.
    2. من أجل الحل النقش في الكأس سترة مزدوجة 1 لتر. تعيين درجة الحرارة عند 65 درجة مئوية.
    3. تزج لوحة ال المؤكسد في الحل النقش لمالا يقل عن 10 ح تحت التحريك. ختم الجزء العلوي من الكأس مع رقائق الألومنيوم.
    4. شطف لوحة ال محفوراً عدة مرات مع المياه.
  3. أنوديزيشن الثانوية
    1. تعيين نفس الشروط التجريبية كخطوة 2.1.1 إلى 2.1.7.
    2. تحميل لوحة ال محفوراً على اﻷنود للنظام وتطبيق جهد 195 الخامس ح 6. ثم إيقاف الإمداد بالطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. فورا أغسل لوحة ال المؤكسد مع المياه.
      ملاحظة: عندما تأخر الوقت للغسيل، زيادة حجم المسام AAO عن غير قصد نتيجة لحمض الفوسفوريك المتبقية.
  4. توسيع المسام التدرج
    1. تحضير حلاً اتساع مسام بتذويب 5.765 ز حامض الفوسفوريك في 500 مل مياه. صب الحل أخلطه سترة مزدوجة 1 لتر.
    2. الاتصال مدوار الكأس سترة مزدوجة وضبط درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية. ضع مرحلة الانتقال خطي عمودياً بجوار الكأس. إرفاق قوس للجزء المتحرك من المرحلة الخطية.
    3. تعيين الجزء المتحرك من مرحلة الخطي إلى موقع المنزل. إرفاق المقطع القوس وتحميل لوحة ال المؤكسد.
    4. التعامل مع موقف لوحة ال يدوياً حيث أن لوحة ال سيأتي الحق فوق السطح للحل.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يجب أن لا تلمس اللوحة الحل. يبدأ المسام اتساع عملية أسرع لوحة يصل إلى الحل.
    5. تزج تدريجيا لوحة ال في الحل بسرعة 4.86 ميكرومتر/s لمدة 120 دقيقة لجعل العفن AAO 35 ملم مع حجم التدرج من 120 نانومتر إلى 200 نانومتر (GP 120/200). بدء تشغيل ساعة توقيت في هذه اللحظة لوحة ال يمس سطح الحل.
    6. جعل قوالب سباق 200/280 و GP 280/360، تزج المنطقة بأكملها من العفن GP 120/200 في المسام توسيع الحل ح 2 أو 4، على التوالي.
    7. شطف لوحة ال التدرج عدة مرات مع المياه.

3-ترسيب طبقة مضادة الشائكة على العفن AAO التدرج مع تجميع ذاتي أحادي الطبقة

ملاحظة: نفذ الخطوات 3.2.1 إلى 3.3.3 في صندوق القفازات. توصيل مضخة فراغ وحاقن غاز النيتروجين الجاف إلى مربع القفازات. ضع جميع العينات والكاشفات والأجهزة في مربع القفازات قبل عملية إزالة الرطوبة. تكرار دورة حقن الغاز الإجلاء والنيتروجين أكثر من ثلاث مرات إزالة الرطوبة الكافية من مربع القفازات. واسمحوا النيتروجين الجاف التدفق من خلال التجربة.

  1. تعديل هيدروكسيل العفن AAO مع العلاج البيرانا
    1. صب 140 مل حامض الكبريتيك (ح2هكذا4, 95%) في كوب تترافلوروايثيلين (PTFE). إضافة 60 مل بيروكسيد الهيدروجين دروبويسي (ح2س2، 30%). اتركه لمدة 30 دقيقة حتى يبرد الحل.
      تنبيه: كن حذراً للغاية عند إجراء الحل البيرانا. قوة الحل يغلي من لحظة إضافة فوق أكسيد الهيدروجين، ويولد ارتفاع درجات الحرارة. إجراء التجربة في غطاء دخان.
    2. تزج العفن AAO في الحل ل 30 s استخدام الملاقط غير معدنية.
    3. شطف العفن AAO عدة مرات مع المياه. نقع العفن في المياه لمدة 30 دقيقة ووضعها في الكحول الميثيل لآخر 30 دقيقة.
      تنبيه: عندما تجاهل الحل البيرانا المستخدمة، تمييع الحل مع كمية وفيرة من ماء الصنبور.
    4. جاف تماما العفن AAO تحت الفراغ ح 3.
  2. إعداد 20 × هي الحل الأسهم
    ملاحظة: هي عبارة عن اختصار ل (heptadecafluoro-1,1,2,2-تيتراهيدروديسيل) ديميثيلتشلورو-سيلاني
    1. ملء ثلث زجاجة الهكسين ن 1 لتر مع ثقب سيتا الجزيئية. ختم الزجاجة مع الفيلم البارافين وتخزينها تحت النيتروجين الجاف ح 24.
    2. تصفية 200 مل من n-الهكسين استخدام المحاقن زجاجية و 0.2 ميكرون PTFE حقنه التصفية.
    3. صب 80 مل الهكسين ن التي تمت تصفيتها في زجاجة زجاج 100 مل. إضافة 2 مل هي.
  3. ترسب تجميع ذاتي أحادي الطبقة
    1. تحميل 57 مل الهكسين ن التي تمت تصفيتها في كوب 100 مل. تزج العفن AAO في المذيب.
    2. أضف 3 مل من محلول الأسهم هي ن الهكسين جعل 2.9 مم هي الحل. انتظر 10 دقائق لرد الفعل على المضي قدما.
    3. نقل القالب AAO إلى الهكسين ن جديدة. إغلاق وختم كل كاشف زجاجات. إغلاق صمام النيتروجين، ثم سحب عينات من مربع القفازات.
      ملاحظة: هي حساس جداً للرطوبة. تخزين جميع المواد الكاشفة التي تحتوي على هي في مجفف.
    4. نقع العفن AAO في 60 مل ميثوكسينونافلوروبوتاني (ج10ح6و18س2، 99%). يتم تنظيف العفن AAO في كوب لمدة 10 ثانية لكل مرة واحدة لإزالة جسديا تمتز الجزيئات هي. كرر الإجراء تنظيف 10 مرات.
      ملاحظة: تعريض العفن AAO بالموجات فوق الصوتية لفترة طويلة دون فترات سيضر على طبقة أكسيد.
    5. جاف تماما العفن AAO تحت الفراغ ح 24.
      ملاحظة: طبقة مضادة الشائكة المودعة بنجاح سوبر طارد المياه ومستقرة لمدة أشهر عند تخزينها في مجفف. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-تصنيع لوحات نانوباتيرن التدرج بالطباعة الحرارية

ملاحظة: نفذ الخطوات 4.2 إلى 4.7 في غرفة نظيفة.

  1. خفض 1.1 مم سميكة البوليستيرين ورقة بحجم 2.9 مم طويلة باستخدام دوائر المطبوعة مجلس (PCB) قاطع 3.7 ملم.
  2. قص العفن AAO 35 ملم من أسفل باستخدام القراص. وضع علامة باسم العينة وتاريخ الصنع على ظهره.
  3. تنظيف يفر 8، 0 "مع جرعة صغيرة من الكحول الاثيلي. وضع ألواح البوليسترين على يفر، ثم تحميل القالب AAO.
  4. وضع الفيلم أسفل الدرج طابعة حرارية. إرفاق الفيلم الأعلى طوقا.
  5. وضعت يفر على الفيلم أسفل. وضع طوقا على يفر. تأكد من أن هناك لا غبار على يفر.
  6. قم بإغلاق الدرج طابعة حرارية. تطبيق 165 درجة مئوية من الحرارة والكوري 620.52 للضغط من أجل 100 s.
  7. تبريد العينة لدرجة حرارة الغرفة. تطور الورقة البوليستيرين بالإفراج عن العفن AAO برفق.

5-التعقيم والتعديل ماء من لوحات نانوباتيرن التدرج

  1. وضع لوحات نانوباتيرن على صحن مربع. من أجل 100 مل كحول الاثيلي 70% وتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
  2. لوحات نانوباتيرن مع النيتروجين الجاف. نقل لوحات نانوباتيرن لمولد بلازما الأوكسجين.
  3. إخلاء الدائرة حتى تصل إلى 1.33 السلطة الفلسطينية. ثم ضخ الأكسجين بمعدل 30 سم3/دقيقة تطبيق قوة ترددات الراديوية من 60 دبليو الحفاظ على البلازما الأوكسجين ل 90 ثانية.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام ألواح المعالجة بالبلازما نانوباتيرن في غضون 14 يوما.
  4. إرفاق لوحة نانوباتيرن إلى الجزء السفلي من صحن ثقافة الخلية باستخدام قطره تولوين.
  5. ختم العينات في حقيبة وتعقيم مع معقم البلازما درجات الحرارة المنخفضة.

6-زراعة هيكفكس

ملاحظة: إجراء كافة الإجراءات سينتريفوجينج في 4 درجات مئوية إلا إذا ذكر خلاف ذلك.

  1. قبل عزل الدم المحيطي احتضان الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)، طبق المغلفة بالكولاجين ثقافة 12-جيدا في 37 درجة مئوية ح 1.
  2. أغسل الطبق الثقافة 12-جيدا باستخدام الفوسفات العقيمة × 1 مخزنة المالحة (PBS).
  3. جمع 50 مل دم البشري باستخدام أنبوب الهيبارين المانع.
  4. وضعت 6 مل من محلول السكاريد ماء في أنبوب 15 مل وإضافة 8 مل دم إلى الحل السكاريد ماء.
    ملاحظة: ببطء "الماصة؛" الدم في المحلول السكاريد ماء.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 20 دقيقة بيليه الخلايا.
  6. الحصاد في طبقة الخلية معتمة، ونقل إلى أنبوب 15 مل جديدة.
  7. إضافة 10% مصل بقرى الجنين (FBS)--يتضمن برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 10 دقيقة بيليه الخلايا.
  8. إزالة المادة طافية وإضافة المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق.
  9. إضافة 10% FBS-يتضمن برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
  10. إزالة المادة طافية وإضافة 10% FBS-يتضمن برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
  11. إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من الخلية البطانية التوسع المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS. بذور 8.0 × 106 خلايا كل بئر لكل طبق المغلفة بالكولاجين.
  12. تغيير ثقافة المتوسط كل يوم لمدة أسبوع واحد. ثم تغيير المتوسطة الثقافة كل يومين.
    ملاحظة: هيكفكس ويمكن الاطلاع على بعد الثقافة اليوم 10-14. إظهار نموذجية حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا هيكفكس وتشكل مستعمرة التي يمكن ملاحظتها في الطوري. الفلورة تلطيخ كادهيرين بطانية والأوعية الدموية (CD144) وعامل فون ويليبراند (vWF) يمكن أيضا إجراء لتوصيف هيكفكس بعد التوسع في الخلية.
  13. لزراعتها في هيكفكس، استخدم المتوسطة توسيع الخلية البطانية تستكمل مع 5% FBS والبنسلين/ستريبتافيدين في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2. استبدال في المتوسط مرة واحدة في يوم.
  14. بعد التعريفي هيكفك، تنمو الخلايا لمرور 7 لإجراء مزيد من التجارب.

7-الخلية البذر والثقافة على لوحات نانوباتيرن التدرج

ملاحظة: الخطوة 7 يصف ثقافة هيكفكس على لوحة نانوباتيرن التدرج، ولكن يمكن استخدام مصادر خلية أخرى أيضا.

  1. معطف لوحات نانوباتيرن التدرج مع 1 مل من 0.1% بروتين طلاء الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: طلاء البروتين 0.1% لا تشمل الميزات نانوبيلار.
  2. جعل تعليق هيكفكس من طبق الثقافة بأسلوب تقسيم الخلية قياسي باستخدام التربسين.
  3. تمييع تعليق خلية لتحقيق التقاء المرجوة. البذور هيكفكس على لوحات نانوباتيرن التدرج والتحكم مسطح (على سبيل المثال، 1.0 × 104 خلايا/سم2).
    ملاحظة: عندما يتم المصنف هيكفكس في 1.0 × 104 خلايا/سم2 على لوحات نانوباتيرن التدرج، كونفلوينسي خلية عادة ما يصل إلى 70-80% بعد يومين.
  4. ثقافة الخلايا على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن لمدة يومين في الحاضنة.

8-رصد وتحليل

  1. فحص التصوير بالمجهر الإلكتروني (SEM)
    1. فيكس هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن مع glutaraldehyde 2.5% عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
    2. معالجة أكسيد الاوزميوم 1% ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل العينات مع برنامج تلفزيوني.
    3. يذوي عينات مع الكحول الاثيلي من انخفاض إلى تركيزات عالية (50% و 70%، 80%، 90% و 100%) لمدة 10 دقائق في كل خطوة.
    4. علاج هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك، غسل العينات مع همدس الطازجة وترك العينات تحت غطاء الدخان يوم واحد على الأقل حتى يتبخر همدس المتبقية تماما.
    5. معطف العينات مع الرش البلاتين المغطى لمدة 5 دقائق وفحص العينات مع sem.
  2. التصوير بالمجهر الإلكتروني (TEM) انتقال
    1. فيكس هيكفكس مثقف لوحات نانوباتيرن مسطحة أو التدرج مع 2% بارافورمالدهيد و 2.5 ٪ glutaraldehyde المخلوط في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية على ليلة وضحاها.
    2. إجراء التثبيت بعد استخدام أكسيد الاوزميوم 1% ويذوي العينات باستخدام الأسلوب في 8.1.3.
    3. تضمين عينات في راتنج الإيبوكسي. جعل 60 نانومتر أبواب سميكة من كتل ومكان مقطع على شبكة TEM.
    4. وصمة عار المقطع مع المزيج من خلات اليورانيل 10 ملغ في 100 مل الكحول الميثيل وسترات الرصاص 0.1 ملغ في 100 مل مقطر من الماء. الحصول على صور ذات ال.
  3. تلوين الأسفار
    1. فيكس هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن مع بارافورمالدهيد 4% في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. بيرميبيليزي وكتلة عينات مع الماعز 5% 0.1% والمصل أوكتيلفينول اثوكسيلاتي في "برنامج تلفزيوني" (ببست) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. احتضان عينات مع جسم فينكولين المضادة الإنسان الأولية (1: 500 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لعينات شطف حاء 2 ثلاث مرات مع ببست.
    4. احتضان عينات مع فالويدين fluorescence مترافق (1:1، 000 في ببست)، مترافق fluorescence جسم الثانوي (1:1، 000 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لعينات شطف حاء 2 ثلاث مرات مع ببست.
    5. احتضان عينات مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1:1,000 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. إسقاط 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة على سطح نانوباتيرن التدرج. مكان ساترة في المتوسط المتصاعدة.
    7. ضع العينة رأسا على المسرح عينة والحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار [كنفوكل].
  4. تحليل الصور
    1. نقل الصور التي تم التقاطها من هيكفكس لنظام تحليل صورة.
    2. اختر حقل عشوائي لتلطيخ صورة فالويدين. ضبط العتبة وخلق صورة ثنائية الخلايا التي تكون متميزة عن الخلفية.
    3. رسم معالم حول الخلايا قياس المساحة الخلية والمحيط، وحساب عدد فيلوبوديا كل خلية يدوياً.
    4. اختر حقل عشوائي لتلطيخ صورة فينكولين. ضبط العتبة وخلق صورة ثنائية للمجالات المحورية الالتصاق.
      ملاحظة: ضبط عتبة الصورة على نحو مناسب لتجنب اصطناعية أكثر-أو وكيل-فيلينج من المجالات المحورية الالتصاق.
    5. عد التصاق المحورية لكل خلية.

النتائج


ويبين الشكل 1 الصور SEM قوالب AAO التدرج ملفقة وفقا لنوع والموقف. ويبين الشكل 2 الصور SEM لوحات نانوباتيرن التدرج مع تقريب العادية نانوبيلارس، و الرقم 3 بيانات القياس الكمي لقطر نانوبيلار. يسرد الجدول 1 خصائص نانوبيل?...

Discussion

تصنيع AAO غالباً ما يعاني من عيوب مثل الشقوق، والأشكال غير النظامية من المسام، وحرق. والسبب الرئيسي لهذه العيوب يسمى تفصيل كهربائياً، التي تتأثر بشدة بطبيعة الركازات المعدنية يجري أكسيد والمقاومة ل الكهرباء21. نظراً للمقاومة للكهرباء تختلف تبعاً لدرجة الحرارة، القضاء على الح?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة التربية والتعليم، والعلوم والتكنولوجيا (MEST) [جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A01060397] والحيوية وتطوير التكنولوجيا الطبية برنامج تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل [جبهة الخلاص الوطني-2017M3A9C6029563] جبهة الخلاص الوطني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Perchloric acid 60%Daejung Chemicals & Metals6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9%Daejung Chemicals & Metals4118-4100
Phosphoric acid 85%Daejung Chemicals & Metals6532-4400
Methyl alcohol 99.5%Daejung Chemicals & Metals5558-4400
Chromium(VI) oxideDaejung Chemicals & Metals2558-4400
Sulfuric acid 95%Daejung Chemicals & Metals7781-4100
Hydrogen peroxide 30%Daejung Chemicals & Metals4104-4400
n-hexane 95%Daejung Chemicals & Metals4081-4400
Toluene 99.5%Daejung Chemicals & Metals8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilaneGelestSIH5840.4Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99%Sigma aldrich464309
Collagen solutionStemcell#4902
GelatinSigma aldrichG1890Protein coating solution
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MVLonzaCC-3202Endothelial cell expansion medium
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Phosphate buffered salineGibco10010031
Fetal bovine serumGibco12483-020
ParaformaldehydeSigma aldrichP6148
GlutaraldehydeSigma aldrichG5882-100ML
Osmium tetroxideSigma aldrich201030-1G
HexamethyldisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctylphenol ethoxylate 
Goat serumGibco26050-088
anti-human vinculin primary antibody Sigma aldrichV9131
F-actin probeMolecular ProbesA12379Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibodyMolecular ProbesA11001Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole Sigma aldrichD9542
Mounting mediumDAKOS3023
Anti-human vWF primary antibody DAKOA0082
Anti-human CD144 primary antibody BD Biosciences#555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMATed Pella18012Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25gTed Pella19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10gTed Pella19312
Ultra pure aluminum plateGoodfellow26050-088
Polystyrene sheetGoodfellowST313120
8.0" silicon waferSiltron29-01024-03Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 LKartellKA.230
Vacuum pumpVacuumerV3.VOP100
Power supplyUnicorntechUDP-3003
Magnetic stirrerDaihan scientificSL.SMS03022
Overhead stirrerDaihan scientificHT120DX
CirculatorDaihan scientificWCR-P12
Linear moving stageZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degreesZaberAB90MAccessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mmVitlab67995Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mLCowieCW007.25
Ultrasonic cleanerBransonB2510MTH
PCB cutterHozan Tool IndustrialK-110
Nanoimprint deviceNanonexNX-2000
Oxygen plasma generatorFemto ScienceCUTE
Low temperature sterilizerLowtemCrystal 50
CO2 IncubatorPanasonicMCO-18AC
Confoal laser scanning microscopeCarl ZeissLSM700
Scanning electron microscopeJEOLJSM6701
Transmission electron microscopeHitachiH-7500

References

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved