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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di piastre gradiente GNSM via nanoimprinting termica e il metodo di screening risposte di cellule progenitrici endoteliali umane alle nanostrutture. Utilizzando la tecnologia descritta, è possibile produrre un ponteggio che può manipolare il comportamento delle cellule di stimoli fisici.

Abstract

Nanotopography può essere trovato in varie matrici extracellulari (ECMs) intorno al corpo ed è conosciuto per avere importanti atti normativi su reazioni cellulari. Tuttavia, è difficile da determinare la relazione tra le dimensioni di una nanostruttura e le risposte delle cellule a causa della mancanza di un'adeguata selezione di strumenti. Qui, ci mostra lo sviluppo delle piastre GNSM gradiente riproducibile ed economica per la manipolazione delle risposte cellulari. Utilizzando ossido di alluminio anodico (AAO) come uno stampo master, gradiente GNSM piastre con nanopillars delle gamme di diametro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] sono stati fabbricati da una termica imprinting tecnica. Queste piastre di gradiente GNSM sono state progettate per imitare le varie dimensioni dei nanotopography in ECM e sono state utilizzate per lo screening delle risposte delle cellule formanti colonie endoteliali umane (hECFCs). In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata di fabbricare gradiente GNSM piastre per ingegneria, tecniche di coltivazione hECFCs da sangue periferico umano e hECFCs il GNSM piastre di coltura delle cellule.

Introduzione

Recentemente, la risposta delle cellule dalla stimolazione fisica della topografia superficiale è stato messo in luce nel campo della cella ingegneria1,2,3,4. Di conseguenza, si è concentrati più su nanostrutture tridimensionali al superficie cellulare allegato5. È stato segnalato che l'integrina, che è il dispositivo di riconoscimento superficie della cella, trasmette lo stimolo fisico guidato dalle strutture micro-nano di ECM a Meccano-trasduzione6. Questa stimolazione meccanica regola il comportamento delle cellule attraverso contatto Guida7 e induce la riorganizzazione del citoscheletro di cambiare forma, oltre alle adesioni focali e la rigidità delle cellule8.

Cellule progenitrici endoteliali umane (hEPCs) del corpo interagiscono strettamente con il microambiente circostante ECM9. Questo indica che lo stato fisico del ECM si comporta come un parametro importante per la formazione di complessi di adesione cellula-matrice specifica come shear stress derivato da sangue flusso10. È stato riferito che nanotopography superficie migliora la formazione in vitro di vasto tubo capillare reti di hEPCs11 e che un fattore solubile di ECM/bio sistema combinato consente hEPCs di riconoscere substrati disfunzionale e promuove Wound healing12,13. Tuttavia, il rapporto tra ECM e hEPCs non è chiaro.

Anche se molti ricercatori hanno cercato di chiarire il rapporto tra le risposte delle cellule e fisici spunti da diversi substrati14,15,16, questi studi utilizzati solo la dimensione fissa di una nanostruttura o nanopatterns con regime irregolare che hanno una limitazione per chiarire la relazione tra le dimensioni del comportamento delle cellule e nanostrutture. Il problema qui è una mancanza di idonei strumenti per lo screening delle risposte cellulari che possono sostituire approcci esistenti noiosi e iterativi per trovare la dimensione ottimale della nanostruttura. Di conseguenza, una tecnica semplice è richiesta per le reazioni di cella su stimolazioni fisiche senza ripetizione della selezione.

Qui, descriviamo un metodo utilizzato nella nostra precedente report17,18,19 per produrre un gradiente GNSM in cui il diametro della nanopillars organizzato aumenta progressivamente. Inoltre, abbiamo anche descritto come coltivare e analizzare il comportamento del hECFCs il gradiente GNSM piastre per determinare l'effetto di stimoli fisici sulle cellule. Un lieve anodizzazione, acquaforte graduale e metodo di rivestimento antiaderente strato sono stati utilizzati per fabbricare il gradiente della muffa AAO. Adottando una termica imprinting tecnica di Litografia, identico in polistirolo nanopatterns gradiente sono state prodotte in modo conveniente e facile. Utilizzando nanopatterns gradiente, è fattibile per determinare quale dimensione di nanostruttura ha un grande effetto sul comportamento delle cellule in un unico set di esperimento. Ci aspettiamo che questo gradiente GNSM sarà utile nella comprensione dei meccanismi di interazione tra hECFC derivate dal sangue o altre cellule e varie misure di nanostrutture.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Board presso ospedale di Corea Università Anam (IRB No. ED170495). Tutte le procedure sono state effettuate conformemente alla dichiarazione di Helsinki e sue modifiche successive.

1. preparazione del substrato di alluminio (Al) di elettrolucidatura

Attenzione: Soluzione di elettrolucidatura è corrosivo e tossico. Indossare indumenti protettivi, compresi guanti di nitrile, occhiali e camice da laboratorio. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.

  1. Preparare l'elettrolucidatura soluzione mescolando etilico alcol (C2H5OH, 99,9%) e l'acido perclorico (HClO4, 60%) in un becher di intercapedine di 1 L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Collegare il becher giacca doppio a un circolatore e impostare la temperatura a 7 ° C. Porre il becher giacca doppio su un agitatore magnetico. Lasciare la soluzione sotto agitazione per almeno 30 min fino a quando la temperatura scende a 7 ° C.
  3. Immergere la piastra Al ultrapura (99.999%, 20 × 50 × 1 mm3) e carbonio contatore elettrodo nella soluzione di elettrolucidatura utilizzando pinze a coccodrillo e filo di rame. Regolare la posizione della piastra Al e il controelettrodo di carbonio di fronte a altro.
    Nota: È necessario installare le clip con attenzione per non toccare la soluzione. Quando a contatto con la soluzione, le impurità che scorre fuori dalle clip possono contaminare la piastra Al.
  4. Collegare la piastra Al polo positivo e l'elettrodo contatore carbonio al terminale negativo, di una corrente continua (DC) tensione di alimentazione.
  5. Spegnere l'agitatore magnetico e applicare una tensione di 20 V. mantenere questo stato per 4 min.
  6. Accendere l'agitatore magnetico e permettere alla corrente di fluire per altri 6 min.
    Nota: La condizione statica rimuove le impurità e rugosità dalla piastra Al, e la condizione dinamica migliora la qualità finale di elettrolucidatura.
  7. Spegnere l'alimentazione e separare manualmente la piastra dalla clip. Rigorosamente lavare la piastra Al con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di soluzione.
  8. Asciugare la piastra Al con azoto e store sotto gas inerte. Condurre questo processo di essiccazione alla fine di tutti gli esperimenti nel passaggio 1 e 2.
    Nota: Quando si inietta aria compressa, rendere il flusso d'aria dalla parte lucida verso il lato opposto. In caso contrario, le impurità possono sfuggire dalla parte non-lucido e contaminare la piastra Al.

2. fabbricazione di stampo AAO gradiente con elettrolita acido fosforico

Attenzione: Alcool metilico e ai suoi fumi sono tossici oculari. Continua esposizione a cromo può portare ad avvelenamento grave cromo. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.

  1. Anodizzazione primario
    1. Per preparare 1 L di elettrolita acido fosforico, caricare 590 mL di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro.
    2. Aggiungere 400 mL di alcool metilico (CH3OH, 99%) e 10 mL di acido fosforico (H3PO4, 85%) nella bottiglia di vetro. Miscelare la soluzione bene agitando manualmente o con agitazione magnetica.
    3. Versare 500 mL di elettrolita in un becher di intercapedine 1 L. Immergere la piastra e carbonio elettrodo contatore Al lucido nella soluzione con pinze a coccodrillo e filo di rame.
    4. Versare ulteriore elettrolito per individuare il limite di elettrolucidatura 2-3 mm sopra la superficie della soluzione.
      Nota: Se anodizzazione è effettuato con il contorno di elettrolucidatura toccando la soluzione, la piastra Al tende a bruciare durante l'anodizzazione.
    5. Installare un pozzo verticale su un piedistallo a forma di U. Allegare un agitatore e girante utilizzando fascette metalliche. Posizionare l'elica della girante vicino l'estremità inferiore di entrambi gli elettrodi. Impostare la velocità di rotazione dell'agitatore overhead tra 200 e 300 giri/min.
    6. Collegare il becher giacca doppio a un circolatore e impostare la temperatura a-10 ° C. Lasciare il sistema per almeno 1 h sotto agitazione fino a quando la temperatura scende a-10 ° C.
      Nota: Non utilizzare acqua come refrigerante. Poiché l'acqua si ghiaccia a basse temperature, la circolazione non funziona normalmente. Si consiglia di utilizzare una miscela di acqua e alcol etilico con un rapporto di 1:1 come refrigerante.
    7. Applicare una tensione di 195 V sotto agitazione per 16 h.
      Nota: Se la corrente aumenta più di 50 mA entro 2 o 3 h dopo l'applicazione della tensione, la probabilità che si verifichi la masterizzazione è molto alta. Immediatamente interrompere il processo e sostituire la piastra Al con uno nuovo. Se questo problema si verifica ripetutamente, verificare che non esiste nessuna anomalia nel controllo di temperatura della pompa di circolazione. Se non c'è nessuna anomalia, cambiare l'elettrolita.
    8. Interrompere l'alimentazione elettrica e separare manualmente la piastra dalla clip. Lavare la piastra Al anodizzato con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di soluzione.
  2. Acquaforte di allumina
    1. Preparare l'acido cromico acquaforte soluzione sciogliendo 9,0 g di ossido di cromo (CrO3) e 20,3 mL di acido fosforico (H3PO4, 85%) in 500 mL di acqua deionizzata.
    2. Versare la soluzione di incisione nel 1 L giacca doppio contenitore. Impostare la temperatura a 65 ° C.
    3. Immergere la piastra Al anodizzato nella soluzione acquaforte per almeno 10 h sotto agitazione. Sigillare la parte superiore del bicchiere con carta stagnola.
    4. Sciacquare la piastra Al incisa parecchie volte con acqua deionizzata.
  3. Anodizzazione secondario
    1. Impostare le stesse condizioni sperimentali come passo 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Caricare la piastra Al acidato all'anodo del sistema e applicare una tensione di 195 V per 6 h. Spegnere l'alimentazione, quindi separare manualmente la piastra dalla clip. Lavare immediatamente la piastra Al anodizzato con acqua deionizzata.
      Nota: Quando il tempo di lavaggio è ritardato, il formato del poro di AAO involontariamente aumenta a causa del residuo acido fosforico.
  4. Ampliamento di gradiente poro
    1. Preparare una soluzione di allargamento dei pori sciogliendo 5,765 g di acido fosforico in 500 mL di acqua deionizzata. Versare la soluzione in un becher di intercapedine 1 L.
    2. Collegare il becher di intercapedine per la pompa di circolazione ed impostare la temperatura a 30 ° C. Luogo una fase di movimento lineare verticalmente accanto al bicchiere. Fissare una staffa alla parte mobile della fase lineare.
    3. Impostare la parte mobile della fase lineare nella posizione iniziale. Fissare la clip alla staffa e caricare la piastra Al anodizzato.
    4. Modificare manualmente la posizione della piastra Al modo che la piastra Al arriverà proprio sopra la superficie della soluzione.
      Nota: In questo passaggio, la piastra Al non dovrebbe toccare la soluzione. Il poro ampliamento processo inizia non appena la piastra Al raggiunge la soluzione.
    5. Immergere gradualmente la piastra nella soluzione ad una velocità di 4,86 µm/s per 120 min fare uno stampo AAO di 35mm con una dimensione di sfumatura da 120 nm ai 200 nm (GP 120/200). Avviare un cronometro al momento che la piastra Al contatto con la superficie della soluzione.
    6. Per fare stampi GP 200/280 e 280/360 GP, immergere l'intera area di GP 120/200 muffa nel poro ampliamento soluzione per 2 o 4 h, rispettivamente.
    7. Sciacquare la piastra Al gradiente più volte con acqua deionizzata.

3. deposizione dello strato antiaderente su gradiente AAO stampo con Self-Assembled Monolayer

Nota: Eseguire passaggi 3.2.1 a 3.3.3 in un vano portaoggetti. Collegare una pompa a vuoto e iniettore gas azoto secco per il vano portaoggetti. Posizionare tutti i campioni, reagenti e apparati in glove box prima del processo di deumidificazione. Ripetere il ciclo di iniezione gas evacuazione e azoto più di tre volte per rimuovere adeguatamente l'umidità dalla casella di guanto. Lasciate che l'azoto secco flusso attraverso l'esperimento.

  1. Modifica dell'idrossile di stampo AAO con trattamento Piranha
    1. Versare 140 mL di acido solforico (H2SO4, 95%) in un becher di politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere 60 mL di perossido di idrogeno goccia a goccia (H2O2, 30%). Lasciare per 30 minuti fino a quando la soluzione si è raffreddato.
      Attenzione: Essere estremamente attenti quando si effettua la soluzione Piranha. Dal momento dell'aggiunta di perossido di idrogeno, la soluzione vigorosamente bolle e genera temperature elevate. Eseguire l'esperimento in una cappa aspirante.
    2. Immergere lo stampo AAO nella soluzione per 30 s utilizzando una pinzetta non metallica.
    3. Lavare lo stampo AAO più volte con acqua deionizzata. Immergere lo stampo in acqua deionizzata per 30 min e metterlo in alcool metilico per altri 30 min.
      Attenzione: Quando scartare dalla soluzione Piranha, diluire la soluzione con una copiosa quantità di acqua di rubinetto.
    4. Asciugare completamente lo stampo AAO sotto vuoto per 3 h.
  2. Preparazione della soluzione di riserva HDFS × 20
    Nota: HDFS è l'abbreviazione di (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-Silano
    1. Riempire un terzo di una bottiglia di n-esano 1 L con setacci molecolari. Tappare la bottiglia con la pellicola di paraffina e conservarlo sotto azoto secco per 24 h.
    2. Filtrare i 200 mL di n-esano utilizzando una siringa di vetro e 0,2 µm PTFE siringa filtro.
    3. Versare 80 mL di n-esano filtrato in un flacone di vetro da 100 mL. Aggiungere 2 mL di HDFS.
  3. Deposizione di monostrato auto-assemblato
    1. Caricare 57 mL di n-esano filtrato in un becher da 100 mL. Immergere lo stampo AAO in solvente.
    2. Aggiungere 3 mL di soluzione madre HDFS n-esano per rendere la soluzione HDFS 2,9 mM. Attendere 10 minuti per la reazione di procedere.
    3. Trasferire lo stampo AAO fresco n-esano. Chiudere e sigillare tutti i flaconi di reagente. Chiudere la valvola dell'azoto, poi tirare fuori i campioni da glove box.
      Nota: HDFS è estremamente sensibile all'umidità. Conservare tutti i reagenti che contengono HDFS in un essiccatore.
    4. Immergere lo stampo AAO in 60 mL di methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Pulizia con ultrasuoni lo stampo AAO in un becher per 10 s per una sola volta per rimuovere fisicamente adsorbite molecole HDFS. Ripetere la procedura di pulizia 10 volte.
      Nota: Esponendo la muffa AAO a ultrasuoni per lungo tempo senza intervalli danneggiano lo strato di ossido.
    5. Asciugare completamente lo stampo AAO sotto vuoto per 24 h.
      Nota: Un strato antiaderente correttamente depositato è super idrorepellente e stabile per mesi se conservato in un essiccatore. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. fabbricazione di gradiente GNSM piastre di stampa termica

Nota: Eseguire passaggi 4.2 a 4.7 in una camera pulita.

  1. Tagliare un foglio di polistirene spessore 1,1 mm a una dimensione di 2,9 mm di larghezza da 3,7 mm di lunghezza con un cutter di circuito stampato (PWB).
  2. Tagliare la muffa AAO 35 mm dal fondo utilizzando un taglierino. Contrassegnare il campione nome e data di produzione sul retro.
  3. Pulire una cialda 8.0" con una piccola dose di alcool etilico. Mettere i fogli di polistirolo sul wafer, quindi montare lo stampo AAO.
  4. Mettere il film inferiore nel cassetto di una stampante termica. Fissare la pellicola superiore per la guarnizione.
  5. Mettere la cialda sulla pellicola inferiore. Posizionare la guarnizione sul wafer. Assicurarsi che non ci sia polvere sul wafer.
  6. Chiudere il cassetto dell'unità di stampa termica. Applicare 165 ° C di calore e 620.52 kPa di pressione per 100 s.
  7. Raffreddare il campione a temperatura ambiente. Ruotare delicatamente il foglio di polistirolo per rilasciare lo stampo AAO.

5. sterilizzazione e modifica idrofila del gradiente GNSM piastre

  1. Posizionare le piastre GNSM su un piatto quadrato. Versare 100 mL di alcool etilico al 70% ed esporre ai raggi ultravioletti per 30 min.
  2. Asciugare le piastre GNSM con azoto. Trasferire le piastre GNSM a un generatore di plasma di ossigeno.
  3. Evacuare la camera fino a 1.33 PA. Quindi, inietti l'ossigeno ad un tasso di 30 cm3/min applica una radio frequenza potenza di 60 w. Mantieni il plasma di ossigeno per 90 s.
    Nota: Si consiglia di utilizzare piastre trattate al plasma GNSM entro 14 giorni.
  4. Fissare la piastra di GNSM alla parte inferiore di una piastra di coltura cellulare utilizzando una goccia di toluene.
  5. Sigillare i campioni in un sacchetto e sterilizzare con sterilizzatore del plasma a bassa temperatura.

6. coltura di hECFCs

Nota: Effettuare tutte le procedure di centrifugazione a 4 ° C se non specificato diversamente.

  1. Prima di isolare il sangue periferico (PBMCs), le cellule mononucleari Incubare una piastra di coltura di 12-pozzetti rivestite con collagene a 37 ° C per 1 h.
  2. Lavare il piatto 12-pozzetti cultura utilizzando 1 × tamponata sterile di fosfato salino (PBS).
  3. Raccogliere 50 mL di sangue umano, utilizzando un tubo di inibitore dell'eparina.
  4. Mettere 6 mL di soluzione di polisaccaride idrofila in una provetta da 15 mL e aggiungere 8 mL di sangue per la soluzione di polisaccaride idrofila.
    Nota: Pipettare lentamente il sangue nella soluzione polisaccaride idrofila.
  5. Centrifugare la provetta a 1020 x g per 20 min agglomerare le cellule.
  6. Raccogliere lo strato opaco delle cellule e trasferimento in un nuovo tubo da 15 mL.
  7. Aggiungere 10% siero bovino fetale (FBS)-contenute PBS e centrifugare la provetta a 1020 x g per 10 min agglomerare le cellule.
  8. Rimuovere il supernatante e aggiungere buffer di lisi di globuli rossi. Tenere il ghiaccio per 5 min.
  9. Aggiungere 10% FBS-contenute PBS e centrifugare la provetta a 1020 x g per 5 min agglomerare le cellule.
  10. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10% FBS-contenute PBS. Centrifugare la provetta a 1020 x g per 5 min agglomerare le cellule.
  11. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di medium di espansione delle cellule endoteliali supplementato con 10% FBS. Semi di 8,0 × 106 cellule per pozzetto per ogni piatto rivestite con collagene.
  12. Cambiare il terreno di coltura ogni giorno per 1 settimana. Quindi, modificare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
    Nota: hECFCs può essere trovato dopo cultura giorno 10-14. hECFCs visualizzare tipica acciottolato-come la morfologia e formare una colonia che può essere osservata in microscopia di contrasto di fase. Colorazione di immunofluorescenza di cadherin endothelial vascolare (CD144) e fattore di von Willebrand (vWF) può essere eseguita anche per la caratterizzazione della hECFCs dopo l'ulteriore espansione delle cellule.
  13. Per coltivare la hECFCs, utilizzare supplementato di espansione delle cellule endoteliali con 5% di FBS e penicillina/streptavidina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2. Sostituire il mezzo una volta al giorno.
  14. Dopo induzione di hECFC, crescere le cellule a passaggio 7 per ulteriori esperimenti.

7. cellula semina e cultura sulle piastre GNSM gradiente

Nota: Passaggio 7 descrive la cultura del hECFCs sulla piastra gradiente GNSM, ma altre fonti di cellule possono anche essere utilizzati.

  1. Rivestire le piastre GNSM gradiente con 1 mL di soluzione di rivestimento di proteine 0,1% in PBS per 10 min a temperatura ambiente.
    Nota: Il rivestimento di proteine 0,1% non copre le caratteristiche nanopillars.
  2. Fare una sospensione di hECFCs dalla piastra di coltura di un metodo standard per la divisione delle cellule con tripsina.
  3. Diluire la sospensione cellulare per raggiungere la confluenza desiderata. Seme del hECFCs sul gradiente GNSM piastre e controllo piatto (ad esempio, 1,0 × 104 cellule/cm2).
    Nota: Quando hECFCs sono seminate ad 1,0 × 104 cellule/cm2 il gradiente GNSM piastre, il confluency di cella raggiunge solitamente al 70-80% dopo 2 giorni.
  4. Coltura le cellule su piastre piane o gradiente GNSM per 2 giorni nell'incubatrice.

8. osservazione e analisi

  1. Formazione immagine del microscopio elettronico a scansione (SEM)
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con glutaraldeide 2,5% a 4 ° C per una notte.
    2. Trattare il tetrossido di osmio 1% per 1 h a temperatura ambiente. Campioni di lavaggio con PBS.
    3. Disidratare i campioni con alcol etilico da bassa ad alta concentrazione (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 10 min per ogni passo.
    4. Trattare esametildisilazano (HMDS) per 15 min a temperatura ambiente. Dopo di che, lavare campioni con HMDS fresco e lasciare i campioni sotto la cappa con almeno 1 giorno fino a quando il residuo HMDS evapora completamente.
    5. Rivestire i campioni con platino sputter coater per 5 min ed esaminare i campioni con un SEM
  2. Formazione immagine del microscopio elettronico (TEM) di trasmissione
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con miscela 2% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide in PBS a 4 ° C per una notte.
    2. Eseguire post-fissazione utilizza tetrossido di osmio 1% e disidratare campioni usando il metodo in 8.1.3.
    3. Incorporare i campioni in resina epossidica. Fanno 60 sezioni spesse nm da blocchi e posizionare una sezione su una griglia TEM.
    4. Macchia la sezione con la miscela di acetato di uranile 10 mg in 100 mL di alcole metilico e citrato di piombo di 0,1 mg in 100 mL di acqua distillata. Ottenere immagini con un TEM.
  3. Macchiatura di fluorescenza
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Permeabilize e bloccare i campioni con 5% di capra del siero e 0,1% Ottilfenolo etossilato in PBS (PBST) a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Incubare i campioni con l'anticorpo primario anti-umani vinculina (1: 500 in PBST) a temperatura ambiente per 2 h. risciacquo campioni tre volte con PBST.
    4. Incubare i campioni con falloidina fluorescenza-coniugati (1:1, 000 in PBST), fluorescenza-coniugato anticorpo secondario (1:1, 000 in PBST) a temperatura ambiente per 2 h. risciacquo campioni tre volte con PBST.
    5. Incubare i campioni con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 in PBST) a temperatura ambiente per 5 min.
    6. Goccia 10 µ l di soluzione di montaggio sulla superficie del gradiente GNSM. Porre un coprivetrino sul mezzo di montaggio.
    7. Posizionare il campione upside-down sul palco campione e acquisire immagini utilizzando il microscopio a fluorescenza confocale.
  4. Analisi dell'immagine
    1. Trasferire le immagini acquisite dell'hECFCs a un sistema di analisi di immagine.
    2. Scegliere il campo casuale della falloidina colorazione immagine. Regolare la soglia e creare un'immagine binaria in cui le cellule sono distinte dallo sfondo.
    3. Disegnare contorni intorno alle cellule per misurare l'area di cella e il perimetro e contare manualmente il numero di filopodi per cella.
    4. Scegliere il campo casuale del vinculin colorazione immagine. Regolare la soglia e creare un'immagine binaria delle zone di adesione focale.
      Nota: Regolare la soglia di immagine in modo appropriato per evitare artificiale sopra - o sotto - filling delle zone di adesione focale.
    5. Contare il numero di adesione focale di ogni cella.

Risultati


La figura 1 Mostra immagini di SEM degli stampi AAO gradienti fabbricati secondo il loro tipo e la posizione. La figura 2 Mostra immagini di SEM di gradiente GNSM piastre con nanopillars regular-arrotondato, e nella figura 3 è dati di quantificazione del diametro nanopillars. La tabella 1 elenca le caratteristiche della nanopillars fabbricato.

Discussione

Fabbricazione di un AAO spesso soffre di difetti quali cricche, forme irregolari di pori e la masterizzazione. La ragione principale di questi difetti è chiamata un breakdown elettrolitico, che è fortemente influenzata dalla natura dei substrati metallici essendo anodizzato e la resistività del elettroliti21. Poiché la resistività dell'elettrolito varia a seconda della sua temperatura, eliminando calore continuamente dagli elettrodi è il punto critico per mantenere la temperatura tra piazze ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione, scienza e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & Medical Technology Development Programma della NRF finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione [NRF-2017M3A9C6029563].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Perchloric acid 60%Daejung Chemicals & Metals6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9%Daejung Chemicals & Metals4118-4100
Phosphoric acid 85%Daejung Chemicals & Metals6532-4400
Methyl alcohol 99.5%Daejung Chemicals & Metals5558-4400
Chromium(VI) oxideDaejung Chemicals & Metals2558-4400
Sulfuric acid 95%Daejung Chemicals & Metals7781-4100
Hydrogen peroxide 30%Daejung Chemicals & Metals4104-4400
n-hexane 95%Daejung Chemicals & Metals4081-4400
Toluene 99.5%Daejung Chemicals & Metals8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilaneGelestSIH5840.4Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99%Sigma aldrich464309
Collagen solutionStemcell#4902
GelatinSigma aldrichG1890Protein coating solution
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MVLonzaCC-3202Endothelial cell expansion medium
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Phosphate buffered salineGibco10010031
Fetal bovine serumGibco12483-020
ParaformaldehydeSigma aldrichP6148
GlutaraldehydeSigma aldrichG5882-100ML
Osmium tetroxideSigma aldrich201030-1G
HexamethyldisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctylphenol ethoxylate 
Goat serumGibco26050-088
anti-human vinculin primary antibody Sigma aldrichV9131
F-actin probeMolecular ProbesA12379Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibodyMolecular ProbesA11001Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole Sigma aldrichD9542
Mounting mediumDAKOS3023
Anti-human vWF primary antibody DAKOA0082
Anti-human CD144 primary antibody BD Biosciences#555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMATed Pella18012Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25gTed Pella19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10gTed Pella19312
Ultra pure aluminum plateGoodfellow26050-088
Polystyrene sheetGoodfellowST313120
8.0" silicon waferSiltron29-01024-03Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 LKartellKA.230
Vacuum pumpVacuumerV3.VOP100
Power supplyUnicorntechUDP-3003
Magnetic stirrerDaihan scientificSL.SMS03022
Overhead stirrerDaihan scientificHT120DX
CirculatorDaihan scientificWCR-P12
Linear moving stageZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degreesZaberAB90MAccessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mmVitlab67995Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mLCowieCW007.25
Ultrasonic cleanerBransonB2510MTH
PCB cutterHozan Tool IndustrialK-110
Nanoimprint deviceNanonexNX-2000
Oxygen plasma generatorFemto ScienceCUTE
Low temperature sterilizerLowtemCrystal 50
CO2 IncubatorPanasonicMCO-18AC
Confoal laser scanning microscopeCarl ZeissLSM700
Scanning electron microscopeJEOLJSM6701
Transmission electron microscopeHitachiH-7500

Riferimenti

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