Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، هو بروتوكول يستخدم صبغ جيمي كارتر-1 لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا بعد التعرض لنقص/ريوكسيجينيشن مع أو بدون عامل واقية.

Abstract

ضخه في الوقت المناسب والفعال للشريان التاجي المغطى أفضل استراتيجية لتقليل حجم احتشاء عضلة القلب في المرضى الذين يعانون من قطعة ST مرتفعة احتشاء عضلة القلب. ومع ذلك، ضخه في حد ذاته يمكن أن يؤدي إلى الوفاة كارديوميوسيتي كذلك، ظاهرة المعروفة باسم الإصابة ضخه. فتح المسام الانتقال نفاذية المتقدرية (mPTP)، مع انخفاض للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP)، أو depolarization الميتوكوندريا، معترف به عالمياً كخطوة نهائية للإصابة ضخه وهي المسؤولة عن الميتوكوندريا والموت كارديوميوسيتي. جيمي كارتر-1 هو صبغة محبتين الموجبة التي تتراكم في الميتوكوندريا استناداً إلى قيمة نظام التمثيل التناسبي المختلط. أعلى نظام التمثيل التناسبي المختلط، كلما تتراكم JC-1 في الميتوكوندريا. يمكن أن تنعكس كميات متزايدة من JC-1 في الميتوكوندريا بانتقال انبعاث الأسفار من الأخضر (~ 530 نانومتر) إلى اللون الأحمر (~ 590 nm). ولذلك، يمكن أن تشير إلى الحد نسبة كثافة ومضان أحمر/أخضر ديبولاريزيشن الميتوكوندريا. ونحن هنا، نلقي الاستفادة من JC-1 لقياس نظام التمثيل التناسبي المختلط، أو فتح mPTP في myocytes القلب البشري بعد نقص/ريوكسيجينيشن، تم الكشف عن طريق التدفق الخلوي.

Introduction

أمراض القلب والشرايين هو السبب الرئيسي للوفاة في العالم. العلاج الأمثل للحد من الإصابات الدماغية، والحد من حجم احتشاء في المرضى الذين يعانون من ش-الجزء رفع احتشاء عضلة القلب يتم ضخه احتشاء عضلة القلب في الوقت المناسب والفعال عن طريق التدخل التاجي عن طريق الجلد الأولية (PCI)1، 2. ومع ذلك، ضخه تسبب ضررا إضافيا، التي يمكن أن تصل إلى 30 في المئة من حجم احتشاء النهائي3. من المسلم به عالمياً أن المسام الانتقال نفاذية المتقدرية (mPTP) ليس فقط المركزية في المتقدرية الأضرار وخلية الموت أثناء الاسكيمية/ضخه (أنا/R)، بل أيضا هدف متقاربة من كارديوبروتيكتيفي مما يشير إلى4 , 5-كما سوف يحقق افتتاح mPTP depolarization غشاء الميتوكوندريا الداخلية المحتملة (MMP)4، اكتشفنا افتتاح mPTP استخدام 5، 5، 6، 6-تيتراتشلورو-1، 1، 3، المقايسة 3-إيثيل-إيميداكاربوسيانينيوديدي (JC-1).

والرزن جيمي كارتر-1 هو طريقة سيتوفلوريميتريك أن النوعية والكمية على حد سواء، وأنه تم التحقق من المزيد من خلال تحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط على مستوى الميتوكوندريا واحدة6. جيمي كارتر-1 موجود كشكل تجميعي، تدر حمراء للانبعاثات الملونة البرتقالي (590 ± 17.5 nm) في المصفوفة من الميتوكوندريا مع MMP العادي؛ مع فقدان نظام التمثيل التناسبي المختلط، جيمي كارتر-1 يتم تحويلها إلى شكل أحادي التي تعطي ومضان أخضر مع انبعاثات من 530 ± 15 نانومتر. ولذلك، انخفاضا في نسبة كثافة fluorescence الحمر/الخضر يمكن أن تشير إلى الحد من نظام التمثيل التناسبي المختلط في ظروف مثل الاسكيمية/ضخه (أنا/R).

بالإضافة إلى JC-1، درست أيضا نظام التمثيل التناسبي المختلط مع الكاتيونات محبتين نفاذية الغشاء مثل 123 والرودامين و 3, 3-ديهيكسيلوكساديكاربوسيانيني يوديد [DiOC6(3)]. ومع ذلك، بالمقارنة مع هذه المسابر اثنين، جيمي كارتر-1 أكثر موثوقية لتحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط. وقد والرودامين 123 حساسية ضعيفة نسبيا (لا سيما في تبريد الوضع7،8) وخصوصية الفقراء. في بعض الأحيان التحول في والرودامين 123 صغيرة جداً لدرجة أنه من الصعب للباحثين أو معدات لمراقبة/كشف. وإلى جانب ذلك، في خلية واحدة، هناك مواقع الربط ميتوكندريا مختلفة والرودامين 123 وحتى أنه قد يكون للأسفار المختلفة الانبعاثات9. لا ينصح DiOC6(3) للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط أما كما أنه يتفاعل depolarization غشاء البلازما10مع إحساس مرهف.

ولذلك، هنا نستخدم المقايسة جيمي كارتر-1 لتقييم "نظام التمثيل التناسبي المختلط الموطن" بعد تعرضهم لنقص/ريوكسيجينيشن مع أو بدون عامل واقية.

Protocol

1-إعداد الكواشف والحلول

  1. إعداد متوسطة كاملة myocytes القلب البشري (الموطن) بإضافة 25 مل مزيج الملحق "ميوسيتي النمو المتوسطة" إلى 500 مل من "ميوسيتي النمو المتوسطة" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. مخزن في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدام.
  2. إعداد حل تونجكسينلو (TXL) بإذابة مسحوق TXL أظهرت في المصل/الجلوكوز-الحرة دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) وضبط تركيز لاند إلى 400 ميكروغرام/مل بإضافة دميم (لمزيد من التفاصيل، انظر11). مخزن في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدام.
  3. إعداد 5 مل من محلول العامل المشترك-1 بإضافة 25 ميليلتر حل الأسهم (200 x) جيمي كارتر--1، 4 مل من الماء عالي النقاوة و 1 مل من مخزون تلوين المخزن المؤقت (5 س) في أنبوب الطرد مركزي 15 مل في الظلام. "الماصة؛" الخليط صعودا وهبوطاً عدة مرات والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدام.
  4. إعداد 30 مل من العمل المصبوغة المخزن المؤقت عن طريق إضافة 24 مل من الماء عالي النقاوة إلى 6 مل مخزون تلوين المخزن المؤقت (5 س) في أنبوب الطرد مركزي 50 مل. استخدام هذا الحل المثلج.

2. إنشاء نموذج نقص/ريوكسيجينيشن

  1. لوحة 1.0 × 105 الخلايا الواحدة وكذلك مع HCM المتوسطة كاملة في صفيحة جيدا 6. تنمو لتصل إلى كونفلوينسي من حوالي 70% في حاضنة خلية التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95% عند 37 درجة مئوية.
  2. أغسل الموطن مع الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS). يعرضهم للعلاجات المختلفة (400 ميكروغرام/مل TXL أو لا) في 2 مل من مصل الجلوكوز خالية/دميم لمدة 30 دقيقة قبل نقص في حاضنة خلية التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95% عند 37 درجة مئوية.
  3. احتضان الموطن في جرة محكم والتاكسج (2.5 لتر) مزودة بعامل حفاز مسح الأكسجين الحرة وتؤدي إلى نقص ح 18 (الشكل 1A)، ومؤشر اللاهوائية لقياس التوتر الأكسجين في المتوسط11،12، 13، في حاضنة خلية التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95% عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يستغرق حوالي 1.5 ح للعامل الحفاز مسح الأكسجين الحرة في الجرة. لذلك، يتم الاحتفاظ الموطن في الجرة ح 19.5 قبل فتح الجرة. تغيير لون مؤشر اللاهوائية من الضوء الأزرق في البيئة نورموكسيك إلى اللون الأبيض الشاحب في حالة التاكسج (الشكل 1B).
  4. ريوكسيجيناتي الموطن بتحريك لوحة جيدا 6 إلى حاضنة في 37 درجة مئوية التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95% ح 2.

3-إعداد الموطن للتدفق الخلوي

  1. الحارة 0.25% التربسين-الإيثيلين حمض (يدتا) الحل وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية.
  2. نضح المتوسطة من كل بئر وشطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل التربسين 0.25% على طول جدار البئر.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى الموطن كل فصل تقريبا (حوالي 1 دقيقة).
  4. أضف 1 مل من دميم كاملة المتوسطة (المتوسطة دميم مع 10% مصل بقرى الجنين) إلى الآبار لتحييد التربسين. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل وبيليه الموطن التي سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه.
  6. إضافة 0.5 مل متوسطة كاملة HCM و 0.5 مل من محلول العامل المشترك-1 لكل أنبوبة. ريسوسبيند الموطن واسطة بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  7. تغطية الأنابيب كلها مع رقائق الألومنيوم لمنع تبييض المؤشر الفلورسنت واحتضان الموطن في ظروف عادية (عند 37 درجة مئوية التي تحتوي على 5% CO2 و 95% الهواء) لمدة 20 دقيقة.
  8. الموطن بيليه سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. شطف الموطن مرتين مع 2 مل من المثلج جيمي كارتر-1 المصبوغة في المخزن المؤقت.
  10. ريسوسبيند الموطن في وحدة تخزين نهائي من 300 ميليلتر من المخزن المؤقت المصبوغة المثلج في أنبوب عينة (12 مم × 75 مم) واستخدام الخلايا للتحليل في غضون 30 دقيقة.
    ملاحظة: استخدم الكربونيل السيانيد كلوروفينيل م هيدرازوني (CCCP)، مثبط قوي لسلسلة نقل الإلكترون الجهاز التنفسي، لعلاج الموطن ح 1 بتركيز 20 ميكرومتر، لمراقبة إيجابية.

4-تدفق الإعداد سيتوميتير

  1. بدء cytometer تدفق والتأكد من أن البرنامج متصل بذلك.
  2. إجراء بدء تشغيل فلويديكس وبدء تشغيل الدفق وإعداد بريكوف.
  3. فتح نافذتين الأرض دوت في البرنامج التدفق الخلوي.
    1. حدد الأمام متناثرة الضوء (FSC) على المحور س، والجانب متناثرة الضوء (SSC) على المحور Y في المؤامرة دوت الأولى لتمثيل خصائص الخلايا من حيث حجمها وعلى مستوى، على التوالي.
    2. قم بتحديد القناة PE الكشف (575 ± 26 nm) للمحور Y وفيتك (530 ± 30 نانومتر) للمحور X باستخدام مقياس لوغاريتمي في المؤامرة النقطة الثانية، والذي يستخدم لقياس كثافة fluorescence صبغ JC-1 في الخلايا.

5. التدفق الخلوي قياس وتحليل البيانات

  1. انقر فوق إلغاء التحميل للسماح بالانبوب دعم الذراع والموقف فارغ (الموطن قد لا تم مصبوغ مع جيمي كارتر-1) عينة الأنبوبة على ذلك. انقر فوق تحميل لإرجاع الذراع الدعم الأنبوبة إلى موضعه العامل.
  2. انقر فوق سجل لجمع جزيئات من تعليق في أنبوب عينة فارغة ومن ثم بوابة السكان خلية (P1) لمزيد من التحليل في المؤامرة النقطة الأولى (الشكل 3).
  3. جمع الموطن في أنابيب العينات الأخرى وتحسين القياس عن طريق ضبط الفولتية قنوات الأسفار، للتأكد من أن النقطة خلية يقع في المنطقة الوسطى من المؤامرة النقطة الثانية.
  4. عرض الإحصائيات لكل أنبوبة العينة وحساب يتولى كل عينة بقسمة نسبة كثافة ومضان أحمر من شدة الفلورية الخضراء.

النتائج

قبل إجراء الفحص JC-1 لتقييم التغييرات في نظام التمثيل التناسبي المختلط، ينصح بشدة أن التجارب تجري إلى تأكيد الشروط بنجاح مجموعة من الباحثين. كما هو موضح بالتدفق الخلوي النتائج (الشكل 2)، بالمقارنة مع مجموعة طبيعية، ونقص/ريوكسيجينيشن (H/R) إلى حد كبير التي يسب...

Discussion

هنا، نقدم هو بروتوكول يستخدم صبغ جيمي كارتر-1 لتقييم نظام التمثيل التناسبي المختلط الخلايا بعد التعرض "الكشف عن" ر. ح بمقايسة جيمي كارتر-1، ونظام التمثيل التناسبي المختلط خلايا مستقلة عن عوامل مثل حجم الميتوكوندريا والشكل والكثافة التي قد تؤثر على الأسفار مكون واحد إشارات14. ون...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذه الدراسة كانت تدعمها المنح "البحوث الوطنية بالمفتاح" وبرنامج التنمية في الصين (رقم 2017YFC1700503)، "البرنامج الوطني للبحوث الأساسية" (برنامج 973) الصين (No.2012CB518602)، "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (رقم 81370223 ورقم 81573957)، ومؤسسة البحوث الابتكارية لطلاب الدراسات العليا من كلية طب الاتحاد بكين (2016-1002-01-02).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1Beyodtime, ChinaC2006In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powderShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China071201
Annexin V-FITC/PI KitBecton-Dickinson, USA556547
DMEMLife Technologies, Grand Island Biological Company, USA11966-025
Human cardiac myocytePromocell, GermanyC-12810
Myocyte Growth Medium
(SupplementMix)		Promocell, GermanyC-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)Promocell, GermanyC-22070used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENboxBioMérieux, Marcy l’Etoile, France961272.5L
Catalyst (AnaeroPack)MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan C-1
Anaerobic indicatorBioMérieux, Marcy l’Etoile, France96118
Flow cytometerBecton-Dickinson, USAFACSAria 2
BD FACSDiva SoftwareBecton-Dickinson, USAVersion8.0.1
Sample tubeCorning science, USA35205412*75mm
PBSHyclone, USASH30256.01

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
  3. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
  4. Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
  5. Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
  6. Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
  7. Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
  8. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  9. Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
  10. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
  11. Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
  12. Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
  13. Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
  14. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
  15. Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
  16. Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
  17. Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
  18. Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
  19. Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
  20. Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
  21. Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
  22. Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
  23. El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
  24. Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Mitochondrial 137 1 myocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved