Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

요약

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

초록

관상동맥 폐색된의 신속 하 고 효율적인 reperfusion ST 세그먼트를 가진 환자에서 심근 경색 크기를 감소에 대 한 최선의 전략 상승 심근 경색 이다. 그러나, reperfusion 라기보다 발생할 수 있습니다 추가 cardiomyocyte 죽음, reperfusion 상해로 알려진 현상. (MMP), 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 감소와 미토 콘 드리 아의 도발은 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)의 오프닝 reperfusion 상해의 마지막 단계로 보편적으로 인식 되 고에 대 한 책임은 미토 콘 드리 아와 cardiomyocyte 죽음. JC-1 MMP의 값에 따라 미토 콘 드리 아에서 축적 되는 질 성 양이온 염료 이다. MMP, JC-1는 미토 콘 드리 아에서 축적 하는 더 높은. 미토 콘 드리 아에서 JC-1의 증가 금액에서 녹색 형광 방출 변화에 의해 반영 될 수 있다 (~ 530 nm) 빨강 (~ 590 nm). 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율의 감소는 미토 콘 드리 아의 도발은 나타낼 수 있습니다. 여기, 우리 걸릴 JC-1 MMP, 측정을 활용 또는 산소/reoxygenation, cytometry에 의해 감지 후 인간의 심장 myocytes에서 mPTP의 오프닝.

서문

관상 동맥 심장 질환 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 치료의 선택의 허 혈 성 상해를 줄이고 ST 세그먼트를 가진 환자에서 경색 크기 제한 상승 심근 경색 주 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI)^{1를 통해 신속 하 고 효과적인 심근 reperfusion는 2}. 그러나, reperfusion 최종 경색 크기³의 30%를 위한 계정을 수 있습니다 추가 손상이 발생 합니다. 그것은 보편적으로 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)가 뿐만 아니라 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 동안 미토 콘 드 리아 손상과 세포 죽음에 중앙 인정 (I / R), cardioprotective 신호⁴ 의 수렴 대상 이기도 하지만 ^{, 5}. 우리 mPTP 오프닝 5 ', 5를 사용 하 여 감지 mPTP 오프닝 안 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)⁴의 도발은 대해가지고 것, 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) 분석 결과.

JC-1 분석 결과 cytofluorimetric 메서드를 질적, 양적, 그리고 단일 미토 콘 드리 아⁶의 수준에서 MMP를 분석 하 여 추가 검증 되었습니다. JC-1 오렌지 색깔된 방출에 (590 ± 17.5 nm) 매트릭스에서 정상적인 MMP;와 미토 콘 드리 아의 빨간색 저조한, 집계 된 형태로 존재 MMP의 손실, JC-1 530 ± 15 nm의 방출 함께 녹색 형광을 생성 하는 단위체 양식으로 변환 됩니다. 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율 감소 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 같은 조건에서 MMP의 감소를 나타낼 수 있습니다 (I / R).

JC-1, 이외에 MMP Rhodamine 123 등 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine 요오드 화물 [DiOC6(3)] 막 투과성 질 성 양이온으로 공부도 했다. 그러나, 이러한 두 프로브에 비해, JC 1 MMP를 분석 하기 위한 더욱 안정적입니다. Rhodamine 123 (특히 냉각 모드^7,8)에서 상대적으로 빈약한 감도 있으며 가난한 특이성. Rhodamine 123에에서 변화 때로는 작습니다 그래서 그것은 관찰/감지 하 연구원 또는 장비에 대 한 하드. 게다가, 단일 셀에서 rhodamine 123에 대 한 다른 mitochondrion 바인딩 사이트 하 고 그래서 그것이 다른 형광 방출⁹있을 수 있습니다 키를 누릅니다. DiOC6(3) MMP 감지에 대 한 권장 하지 않습니다도 플라즈마 막¹⁰의 도발은에 민감하게 반응 하는 그것.

따라서, 여기에 우리가 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 HCMs MMP를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 사용 합니다.

프로토콜

1입니다. 시 약 및 솔루션의 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 Myocyte 성장 매체의 500 ml Myocyte 성장 매체 보충 믹스의 25 mL를 추가 하 여 인간의 심장 myocytes (HCMs) 완전 한 매체를 준비 합니다. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.
2. Tongxinluo (광장) 솔루션 준비 혈 청/포도 당-무료 광장 ultrafine 분말을 용 해 하 여 Dulbecco의이 글의 중간 (DMEM)를 수정 하 고 (자세한 내용은 참조¹¹)에 대 한 DMEM을 추가 하 여 400 µ g/ml 광장의 농도 조정. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.
3. JC-1 재고 솔루션 (200 x), 초순, 4 mL 및 재고 버퍼 (5 배) 15 mL 원심 분리기 튜브 어둠 속에 얼룩의 1 mL의 25 µ L을 추가 하 여 제 1 작업 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 여러 번 왔다 갔다 혼합 플라스틱 고 37 ° C를 사용 하기 전에 따뜻한.
4. 30 mL 얼룩 버퍼 초순의 24 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 버퍼 (5 배) 얼룩 재고의 6 mL에 추가 하 여 작업을 준비 합니다. 얼음 처럼 차가운이 솔루션을 사용 합니다.

2입니다. 저 산소 증/Reoxygenation 모델의 설립

1. 호치민시 6 잘 플레이트에 전체 매체와 당 판 1.0 x 10⁵ 셀. 37 ° c.에 5% CO₂ 와 95% 공기를 포함 하는 셀 인큐베이터에 약 70%의 confluency에 도달 성장
2. 씻어 HCMs 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 다른 치료에 그들을 노출 (400 µ g/mL 광장 안) 2 mL 혈 청/포도 당 자유로운 DMEM 37 ° c.에 5% CO₂ 와 95% 공기를 포함 하는 셀 인큐베이터에서 hypoxia 이전 30 분에
3. 무료 산소 청소 18 h (그림 1A), 저 산소 증 및 중간^11,12, 에서 산소 긴장을 측정 하는 혐 기성 표시기를 유도 하는 밀폐 및 hypoxic 항아리 (2.5 L) 촉매 장착에 HCMs 품 어 ¹³, 5% CO₂ 와 95% 공기에서 37 ° c.를 포함 하는 셀 인큐베이터에서
   참고: 그것은 약 1.5 h 항아리에 무료 산소 청소를 촉매에 대 한 걸립니다. 따라서, 단지 열 전에 HCMs 19.5 h 항아리에 보관 됩니다. 혐 기성 표시기의 색 옅은 흰색 hypoxic 조건 (그림 1B)에 normoxic 환경에서 밝은 파란색에서 변경합니다.
4. 6 잘 플레이트 인큐베이터 2 h 5% CO₂ 와 95% 공기를 포함 하는 37 ° C에서 설정으로 이동 하 여 HCMs reoxygenate.

3입니다. Cytometry HCMs의 준비

1. 37 ° c는 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 및 PBS를 따뜻한
2. 각 우물에서 매체를 발음, 1 mL의 PBS로 세포를 씻어 하 고 우물의 벽을 따라 0.25 %trypsin 0.5 mL를 추가 합니다.
3. 모든 HCMs 거의 분리 (약 1 분) 때까지 37 ° C에서 품 어.
4. 중화는 트립 신을 우물에 DMEM 완전 한 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청으로 DMEM 매체)의 1 mL를 추가 합니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 HCMs centrifuging 실내 온도에 3 분 동안 500 x g에 의해 작은.
5. 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음.
6. 각 튜브를 0.5 mL 호치민시 완전 한 매체의 작품 및 JC-1 작업 솔루션의 0.5 mL를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 HCMs resuspend.
7. 전체 튜브 형광 표시기의 표백 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 커버 하 고 20 분 동안 HCMs (5% CO₂ 와 95% 공기를 포함 하는 37 ° C)에서 정상적인 조건에서 품 어.
8. 펠 릿 HCMs centrifuging 500 x g 4 ° c.에 3 분에 의해
9. 얼음 처럼 차가운 JC-1 얼룩 버퍼의 2 개 mL 두번 HCMs 린스 합니다.
10. 샘플 튜브 (12 x 75 mm)에 얼음 처럼 차가운 얼룩 버퍼의 300 µ L의 최종 볼륨에서 HCMs resuspend 고 30 분 이내 분석에 대 한 셀을 사용 합니다.
    참고: 카보닐기 시안 m chlorophenyl hydrazone (CCCP), 호흡 전자 수송 체인의 강력한 억제제를 사용 하 여 긍정적인 통제에 대 한 20 µ M의 농도에서 1 h HCMs 치료.

4. 교류 Cytometer 설치

1. 교류 cytometer 시작 하 고 소프트웨어에 연결 되어 있는지 확인.
2. 응용 시작 수행, 스트림을 시작 하 고는 breakoff를 설정.
3. 교류 cytometry 소프트웨어에서 두 점 플롯 윈도우를 엽니다.
   1. 선택 앞으로 각각 그들의 크기 및 그들의 단위 셀의 특성을 표현 하기 위해 첫 번째 점 플롯에서 Y 축에 X 축에 빛 (FSC)과 측면 흩어져 빛 (SSC) 흩어져.
   2. X 축 눈금을 사용 하 여 셀에 JC 1 염료의 형광 강도 측정 하는 데 사용 되는 두 번째 점 플롯에 대 한 PE (575 ± 26 nm) 탐지 채널 Y 축과 FITC (530 ± 30 nm)에 대 한 선택 합니다.

5. 흐름 Cytometry 측정 및 데이터 분석

1. 튜브 밖으로 팔을 지원 하 고는 빈 (HCMs 하지 염색 하는 JC-1) 위치에 있도록 언로드 클릭 그것에 튜브 샘플. 튜브 지원 팔 작업 위치로 반환 부하 를 클릭 합니다.
2. 레코드 빈 샘플 튜브에서 현 탁 액에서 입자를 수집 하 고 다음 셀 인구 (P1) 첫 도트 작 (그림 3)에서 추가 분석을 위해 게이트를 클릭 합니다.
3. 다른 샘플 튜브에서 HCMs를 수집 하 고 셀 점 두 번째 점 플롯의 중심 지역에 위치 하 고 있는지 확인을 형광 채널의 전압을 조정 하 여 측정을 최적화.
4. 각 샘플 튜브의 통계를 표시 하 고 녹색 형광 강도의 빨간 형광 강도의 비율을 분할 하 여 각 샘플의 MMPs 계산.

결과

MMP의 변화를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 수행 하기 전에 실험 실시 성공적으로 조건을 확인 하는 연구자에 의해 설정 것이 좋습니다. 정상 그룹에 비해 교류 cytometry 결과 (그림 2)와 같이 산소/reoxygenation (H/R)는 크게 HCMs (Annexin V + /PI±)의 apoptosis 유도 우리 나의 세포 기반 모델을 설립 했다 나타내는 / R (45.00 ± 2.13 %vs. 11.50 p 일반 그룹에서 ± 0.1...

토론

여기, 선물이 JC-1 분석 결과 의해 H/R. 검색에 노출 되 고 후 셀의 MMP를 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜, 세포의 MMP는 미토 콘 드리 아의 크기, 모양, 및 형광 단일 구성 요소에 영향을 미칠 수 밀도 같은 요인의 독립 ¹⁴신호. 따라서, JC-1 분석 결과의 결과 상대적으로 안정적 이다. 게다가, 그것은 편리 하 고 JC-1 시험 수행에 시간 절약입니다. 이 분석 결과 재료 및 시 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Beyodtime, China	C2006	In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powder	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Human cardiac myocyte	Promocell, Germany	C-12810
Myocyte Growth Medium (SupplementMix)	Promocell, Germany	C-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell, Germany	C-22070	used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENbox	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96127	2.5L
Catalyst (AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan	C-1
Anaerobic indicator	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96118
Flow cytometer	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Version8.0.1
Sample tube	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01