الجمعية السريع، وقابلة للتطوير والتحميل من البروتينات النشطة بيولوجيا، وإيمونوستيمولانتس إلى نانوكاريرس الاصطناعية المتنوعة عبر نانوبريسيبيتيشن فلاش

Summary

توفير المواد النانوية تنوعاً آليات التسليم المراقب العلاجي للعلوم الأساسية والتطبيقات متعدية الجنسيات، ولكن على تلفيق غالباً ما تتطلب خبرة غير متوفر في المختبرات الطبية الأكثر. نقدم هنا، بروتوكولات قابلة التصنيع وتحميل العلاجية المتنوعة نانوكاريرس الذاتي تجميعها باستخدام نانوبريسيبيتيشن فلاش.

Abstract

المواد النانوية يقدم مجموعة واسعة من الخيارات لتخصيص التسليم المراقب من حمولات الجزيئية مفردة ومجتمعة للتطبيقات العلاجية والتصوير. يمكن أن يكون هذا التحديد زيادة آثار سريرية هامة، بما في ذلك انخفاض الآثار الجانبية والجرعات المنخفضة بفاعلية أكبر. وعلاوة على ذلك، في الموقع استهداف والتحوير التي تسيطر عليها من مجموعات فرعية خلية معينة يمكن تعزيز التحقيقات في المختبر و في فيفو الظواهر البيولوجية الأساسية والتحقيق في وظيفة الخلية. ولسوء الحظ، الخبرة المطلوبة في علوم النانو والكيمياء والهندسة وكثيراً ما تحظر المختبرات دون خبرة في هذه المجالات من اختﻻق وتخصيص المواد النانوية كأدوات لتحقيقاتها أو المركبات لما الاستراتيجيات العلاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات للتوليف والجمعية قابلة نظام كوبوليمر تنوعاً غير سامة كتلة قابلة لتشكيل السطحية وتحميل مركبات النانو للتطبيقات الطبية الحيوية. ويرد نانوبريسيبيتيشن فلاش كمنهجية للتصنيع السريع من نانوكاريرس متنوعة من poly(ethylene glycol)-bl-البوليمرات الإسهامية بولي (كبريتيد البروبيلين). هذه البروتوكولات سيسمح مختبرات مع مجموعة واسعة من الخبرات والموارد اللازمة لسهولة وتكاثر اختﻻق نظم إيصالها nanocarrier متقدمة للتطبيقات الخاصة بهم. عملية تصميم وتشييد صك المؤتمتة التي تستخدم مضخة الحقن عالية السرعة لتسهيل نانوبريسيبيتيشن فلاش والسماح لتعزيز السيطرة على التجانس، الحجم ومورفولوجيا وتحميل نانوكاريرس بوليميرسومي ووصف.

Introduction

نانوكاريرس تسمح بالتسليم المراقب للشحنات الصغيرة والجزيئات، الكيانات النشطة بما في ذلك، هذا أن لم يكن مغلفة، سيكون أما التحلل بدرجة عالية و/أو مسعور جداً للإدارة في فيفو. مورفولوجيس nanocarrier ملفقة بانتظام، حويصلات البوليمرية يناظر الدهنية (وتسمى أيضا بوليميرسوميس) توفر القدرة على تحميل الشحنات ماء ومسعور^1،2في وقت واحد. على الرغم من مزاياها واعدة، بوليميرسوميس ما زالت نادرة في التطبيقات السريرية يرجع، جزئيا، إلى العديد من التحديات الرئيسية في صنعها. للاستخدام السريري، يلزم تركيبات بوليميرسومي على دفعات على نطاق واسع والعقيمة، ومتسقة.

يمكن استخدام عدد من التقنيات للنموذج بوليميرسوميس من كوبوليمر ديبلوك، مثل poly(ethylene glycol)-كتلة-بولي (كبريتيد البروبيلين) (شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي)، التي تشمل المذيبات التشتت³، رقيقة الإماهة^{1 , 4}، ^5،ميكروفلويديكس⁶، وترطيب مباشرة⁷. تشتت المذيبات تنطوي على حضانة طويلة أوقات حضور المذيبات العضوية، التي قد تؤذي بعض الحمولات النشطة بيولوجيا، مثل البروتينات. لا تقدم الإماهة رقيقة السيطرة على بوليديسبيرسيتي بوليميرسوميس المشكلة، وكثيراً ما تتطلب تقنيات البثق مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لتحقيق مونوديسبيرسيتي مقبولة. وعلاوة على ذلك، يصعب ميكروفلويدس وترطيب مباشرة إلى مقياس لحجم الإنتاج الأكبر. أساليب تصنيع nanocarrier المختلفة، يقدم نانوبريسيبيتيشن فلاش (تزعمت) القدرة على جعل تركيبات واسعة النطاق واستنساخه^8،،من⁹¹⁰. بينما تزعمت تم حجزها من قبل لصياغة جسيمات نانوية النواة الصلبة، لدينا مختبر وسعت مؤخرا استخدام تزعمت تشمل تشكيل متسقة المتنوعة شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي نانوستروكتوري مورفولوجيس^{11، 12}، بما في ذلك بوليميرسوميس¹¹ وبيكونتينووس نانوسفيريس¹². وجدنا أن تزعمت كان قادراً على تشكيل تركيبات مونوديسبيرسي من بوليميرسوميس دون الحاجة لقذف، أسفر عن قيم الفهرس polydispersity متفوقة مقارنة مع بوليميرسوميس غير مقذوف شكلتها تشتت الإماهة والمذيبات رقيقة ¹¹-نانوسفيريس بيكونتينووس، مع نطاقاتها مسعور كبيرة، لم تكن قادرة على أن تتشكل بواسطة الإماهة رقيقة، وعلى الرغم من تشكيل تحت عدد من الشروط المذيبات مع تزعمت¹².

هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للتقرير التوليفي الوتد-bl-PPS ديبلوك كوبوليمر المستخدمة في تشكيل بوليميرسومي، خلاط الطائرات (CIJ) اصطدام يقتصر استخدامها للأغذية، تزعمت البروتوكول نفسه، وتنفيذ النظام الآلي الحد من تقلب المستخدم. وشملت هو المعلومات المتعلقة بكيفية تعقيم النظام بما فيه الكفاية لإنتاج مستحضرات خالية من الذيفان للاستخدام في فيفو، وممثله من البيانات المتعلقة بتوصيف بوليميرسوميس التي تزعمت شكلها. مع هذه المعلومات، سيكون قادراً على اختﻻق بهم تركيبات مونوديسبيرسي العقيمة، مع الاهتمام باستخدام بوليميرسوميس للعمل في المختبر و في فيفو القراء. القراء مع خبرة في تركيبات nanocarrier ومع الخبرة توليف البوليمر سوف تكون قادرة على اختبار سرعة نظمها البوليمر استخدام تزعمت كبديل محتمل لتقنيات الصياغة الحالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تستخدم البروتوكولات المبينة في هذا التقرير كأدوات تعليمية لصياغة نانوكاريرس في دورات مختبر تكنولوجيا النانو.

Protocol

1-تجميع Poly(ethylene glycol)-كتلة-بولي (كبريتيد البروبيلين)-ثيول

1. توليف ميثوكس-poly(ethylene glycol) mesylate (Mn: 750) (ميو-شماعة₁₇-مرض التصلب العصبي المتعدد، وأنا).
   1. حل 10 غم من ميو-شماعة₁₇-OH في 200 مل تولوين 100% داخل قارورة قاع جولة 3-رقبته (المصرف) تحت إثارة المغناطيسية 600 لفة في الدقيقة.
   2. الاتصال المصرف 3-رقبته بجهاز ستارك عميد، نفسها تعلق على مكثف، والحفاظ على النظام بأكمله تحت غاز خامل، أما من النيتروجين أو الأرجون.
   3. مكان المصرف 3-رقبته في حمام زيت، الحرارة إلى 165 درجة مئوية بينما التحريك 600 لفة في الدقيقة.
   4. إزالة المياه تتبع و 100 مل من التولوين استخدام تقطير أزيوتروبي.
   5. إزالة المصرف 3-رقبته من النفط وفصل جهاز ستارك عميد، مع الحفاظ على شروط غاز خامل، والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
   6. إضافة 5.6 مل من إثيل 100% (مكافئ. المولى 3) و 300 مل من اللامائى 100% التولوين إلى ميو-شماعة₁₇-أوه الحل أثناء التحريك 600 لفة في الدقيقة.
   7. نقل المصرف 3-رقبته إلى حمام الثلج، والحفاظ على إثارة في 600 لفة في الدقيقة والظروف غاز خامل.
   8. تمييع 3.1 مل كلوريد ميثانيسولفونيل 100% (مكافئ. المولى 3) في 30 مل تولوين 100%، إضافة ببطء إلى المصرف 3-رقبته عبر قمع إضافة حين إثارة 600 لفة في الدقيقة.
   9. ضجة بين عشية وضحاها 600 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف خاملة.
   10. حل التصفية عن طريق قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد) لإزالة الأملاح.
   11. إزالة التولوين عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 50-100 ميليبار.
   12. حل إعادة المنتج في 200 مل الميثان (DCM) من 100%، وتصفية من خلال قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد).
   13. إزالة DCM عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 450-600 ميليبار.
   14. ماما حل إعادة المنتج في DCM 100% ويعجل ببطء المنتج بإضافته دروبويسي (عبر ماصة باستور) إلى 500 مل من المثلج الاثير ثنائي إثيل 100%. الحفاظ على إثارة 300 لفة في الدقيقة.
   15. صب أو نضح لإزالة إثيل الاثير من سرع المنتج، ميو-شماعة₁₇-Mesylate، ومخزن بين عشية وضحاها في فراغ مجففة لتجف تماما.
   16. استخدام المنتج فورا، أو تخزين تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية لعدة أشهر.
2. توليف ميثوكس-poly(ethylene glycol) ثيواسيتاتي (ميو-شماعة₁₇-تا، ثانيا).
   1. حل 5 غ من ميو-شماعة₁₇-مرض التصلب العصبي المتعدد (ط) في 200 مل ديميثيلفورماميدي اللامائى (DMF) 100% في المصرف 3-رقبته، ويقلب 600 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غاز خامل.
   2. إضافة 2.5 g كربونات البوتاسيوم 100% (مكافئ. المولى 3) إلى إثارة الحل.
      ملاحظة: لا سوف تذوب كربونات البوتاسيوم تماما في الحل.
   3. تمييع 1.3 مل حمض ثيواسيتيك 100% (مكافئ. المولى 3) في 100 مل 100% DMF اللامائى، وإضافة دروبويسي إلى الحل عن طريق قمع إضافة.
      ملاحظة: حمض ثيواسيتيك له رائحة قوية، ويرضي. ويجب الحرص على إبقاء كافة الكائنات المتسخة داخل غطاء الأبخرة الكيميائية بين عشية وضحاها قبل التخلص منها أو التنظيف.
   4. يحرك بقوة (600 أو أكبر لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن بسهولة تعطيل تشكيل الملح إثارة هذا الحل. ويجب الحرص على الحفاظ على إثارة بين عشية وضحاها.
   5. حل التصفية عن طريق قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد).
   6. إزالة DMF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 60 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 5-15 ميليبار.
   7. حل المنتج في 100 مل من رباعي هيدرو الفوران 100% (THF) وإضافة إلى عمود معبأة مع شركة ألومينا محايدة لإزالة الشوائب اللون الأحمر/البرتقالي.
   8. إزالة THF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 200-300 ميليبار.
   9. ماما حل إعادة المنتج في DCM 100%. إذا كان أشكال ترسبات ملح، وحل التصفية عن طريق 6 ميكرومتر المسامية حجم تصفية الورق باستخدام قمع بوخنر.
   10. يعجل ببطء المنتج عن طريق إضافة dropwise عبر ماصة باستور إلى 500 مل من 100% المثلج إثيل الاثير، إثارة 300 لفة في الدقيقة. إثيل الاثير قد تحتاج أن تكون كذلك مبردة إلى-20 درجة مئوية في الثلاجة الانفجار لعدة ساعات إذا لم تحطم متسرعا من الحل في 4 درجات مئوية.
   11. صب أو نضح لإزالة إثيل الاثير من سرع المنتج، ميو-PEG17-ثيواسيتاتي. تخزين المنتج بين عشية وضحاها في مجفف فراغ، وفي وقت لاحق تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية.
3. توليف ديبلوك كوبوليمر poly(ethylene glycol)-كتلة-poly(propylene sulfide)-ثيول (شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش، الثالث).
   1. حل ميو-شماعة₁₇-تا (الثاني) في 10 مل من 100% DMF اللامائى داخل قارورة شلينك تحت الأرجون، بينما التحريك 400 لفة في الدقيقة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة.
   2. إضافة 1.1 مكافئ المولى من ميثوكسيد الصوديوم (0.5 م حل في الميثانول)، السماح لإثارة 400 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
   3. إضافة 35 مكافئ المولى من كبريتيد البروبيلين 100%، سريعاً، إلى الحل. واسمحوا أن يحرك 400 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
   4. إضافة مكافئ مولى 10 من 100% حمض الخليك الجليدية، والسماح لتحريك 400 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
   5. إزالة DMF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 60 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 5-15 ميليبار.
   6. إعادة حل المنتج اقتصد في DCM 100%، ويعجل في 80 مل ميثانول 100%، انقسام بين اثنان أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل.
   7. أنابيب الطرد المركزي المخروطية في 7500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية بعيداً.
   8. تخزين المنتج، شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش، بين عشية وضحاها في مجفف فراغ، وفي وقت لاحق تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية.

2-تجميع شماعة-bl-"ذكر المكتب الصحفي نانوكاريرس" عبر "هاندبوويريد نانوبريسيبيتيشن فلاش"

1. (اختياري) تعقيم في خلاط الطائرات (CIJ) اصطدام المحصورة.
   1. داخل سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، غمر خلاط مع جميع أجزاء مفككة داخل 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم بين عشية وضحاها.
   2. يحشدوا CIJ خلاط، وتتدفق المياه خالية من الذيفان باستخدام المحاقن اللوير لوك.
   3. اختبار الرقم الهيدروجيني للماء، ويستمر تدفق المياه من خلال حتى تسجيلات الأس الهيدروجيني كمحايد.
2. حل شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش البوليمر والشحن مسعور في THF (اصطدام الحل رقم 1).
   1. تزن 20 ملغ شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-SH في أنبوب 1.5 مل.
   2. إضافة الأصباغ مسعور (مثلاً،دي، ICG)، المخدرات (علىسبيل المثال،ربمسن)، أو البضائع الأخرى.
      ملاحظة: قد تكون البضائع الجافة، أو المذابة في مذيب الماء الامتزاج، يفضل أن تكون THF. إذا كانت البضائع غير قابلة للذوبان في THF أو DMF، المذيبات المائية الامتزاج آخر قد تستعمل، لكن ماما، البوليمر من غير المحتمل أن تكون قابلة للذوبان. كمية البضائع التي يمكن تحميل يتوقف على خصائص البضائع نفسها (مثلاً، الوزن الجزيئي، هيدروفوبيسيتي، اعتبارات الفراغية)، وينبغي أن تستكشف على أساس حالة بحالة^11،12.
   3. إضافة 500 ميليلتر من 100% THF البوليمر والشحن، دوامة بقوة حل.
3. حل الشحن ماء في المخزن المؤقت مائي (اصطدام الحل 2). لهذا، حل شحن ماء يتم تحميلها داخل حويصلات البوليمر في 500 ميليلتر لوجود مخزن مائي (مثلاً، الفوسفات مخزنة المالحة، النقي والمياه، إلخ) حسب الحاجة.
4. إضافة المخزن المؤقت إلى الخزان.
   1. إضافة 2.5 مل من وجود مخزن مائي من خيار (مثلاً، 1 x الفوسفات مخزنة المالحة) إلى خزان مناسب حجم (مثلاً قنينة التﻷلؤ زجاج 20 مل). مكان الخزان تحت خلاط CIJ مثل التدفق من خالط يدخل مباشرة في الخزان.
5. تحميل الحلول اصطدام في المحاقن البلاستيكية منفصلة 1 مل.
6. تصطدم الحلول ضد بعضها البعض لتشكل النانو وتحميلها مع الحمولة في الوقت نفسه.
   1. إدراج المحاقن في محولات اللوير لوك في الجزء العلوي من خلاط CIJ.
   2. في حركة واحدة والسلس والسريع، تخفض كلا المحاقن في نفس الوقت وبنفس القوة.
      ملاحظة: إذا كان أداء إيمبينجيمينتس متسلسلة متعددة، أولاً جمع التدفق في خزان فارغ.
   3. (اختياري) أداء إيمبينجيمينتس متعددة. الحل nanostructure الوليدة انقسام بين اثنين من الحقن، وكرر الخطوات 2.6.1-2.6.2 ما يصل إلى 4 مرات أكثر.
   4. جمع التدفق في خزان مائي تعبئة المخزن المؤقت إعداد 2.4.1 ويقلب برفق التأكد من خلط.
7. إزالة تفريغ البضائع والمذيبات العضوية.
   1. (الخيار 1) دياليزي صياغة nanocarrier في نفس المخزن المؤقت المائية المستخدمة لاصطدام وفي الخزان باستخدام أنابيب ميغاواط المناسبة الانقطاع لمدة 24 ساعة على الأقل مع التغييرات المخزن المؤقت على الأقل 2. وهذا يمكن أن يتم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: سيتم الاحتفاظ نانوكاريرس بأنابيب مع قطع ميغاواط < كاتشين 100,000 وقد يحتمل أن يكون الاحتفاظ بسقف أعلى، وكذلك. يحتفظ هذا الخيار العقم عند إجراء عملية في بكالوريوس باستخدام المخزن المؤقت العقيمة.
   2. (الخيار 2) تصفية وضع من خلال حجم الاستبعاد أو الملحي/المخزن المؤقت تبادل العمود (مثلاً، سيفاروسي 6B العمود) باستخدام برنامج تلفزيوني x 1 كمخزن مائي.
      ملاحظة: هذا الخيار يحافظ على العقم عند إجراء عملية في بكالوريوس مع عمود الذي قد تم تعقيمها جيدا.
   3. (الخيار 3) إزالة المذيبات العضوية المتطايرة استخدام جفاف فراغ بين عشية وضحاها.
   4. (الخيار 4) تصفية وضع استخدام نظام ترشيح تدفق عرضية استخدام عامل تصفية كاتشين 50-100 بمعدل تدفق 20-60 مل في دقيقة لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتماداً على الوزن الجزيئي للبضائع الحاسوبية التي يجري تنقية بعيداً (الشحنات الأكبر سوف يستغرق وقتاً أطول).
8. (اختياري) التركيز في صياغة nanocarrier.
   1. (الخيار 1) التركيز على استخدام نظام مركزات تدور (مثلاً، تدور في العمود مع ميغاواط استقطاع > 100,000)، وتستخدم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى أن يكون حراكه بين يدور نانوكاريرس وقد تتطلب عددا من يدور على التركيز وصولاً إلى الحجم المطلوب. قد يقلل من تركيز تدور العقم تركيبات nanocarrier.
   2. (الخيار 2) تقليل حجم استخدام جفاف فراغ.
      ملاحظة: تغيير حجم تصعب السيطرة عليها في ظل هذه الظروف، ويجب الحرص على الحفاظ على الاسموليه قبل وبعد الاعتقال.
9. تخزين نانوكاريرس في 4 درجات مئوية لمدة أسابيع إلى شهور. قبل الاستخدام بعد التخزين، بإيجاز دوامة nanocarrier الصياغات.

3-تميز تركيبات Nanocarrier

1. قياس كفاءة تحميل
   1. إذا كانت البضائع الفلورسنت أو يمتص بشدة على طول موجي معين خارج 260-450 نانومتر، قياس الأسفار/امتصاص استخدام فلوريميتير/جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي يمتص بشدة من 260-310 نانومتر وتركيبات بوليميرسومي استيعاب من 310-450 نانومتر، مما قد يؤدي إلى تعقيد التقدير الكمي للبضائع التي تمتص في موجه مماثلة.
   2. إذا كانت البضائع يمتص داخل نطاق 260-450 نانومتر وهو ماء، تعطيل شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي النانو بإضافة 25 ميكروليتر من الصياغة على حجم تساوي من 1 ٪ ح₂س₂ أو 1% Triton X-100 وبعد ذلك فصل وتمييز مخازن البضائع من امتصاص البوليمر عن طريق عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) باستخدام عمود استبعاد حجم متوافقة مع مائي (مثل عمود 6B سيفاروسي) ¹¹.
   3. إذا كانت البضائع يمتص داخل نطاق 260-450 نانومتر وقابل للذوبان في THF أو DMF، ليوفيليزي الصياغة بتجميد 100 ميكروليتر في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم ضع الأنبوبة إلى حاوية فراغ الزجاج ومكان على ليوفيليزير. السماح لأربع وعشرين ساعة ليوفيليزيشن تحدث، وبعد ذلك إعادة تذوب في 50 ميكروليتر من DMF أو THF قبل الانفصال والكشف عن طريق [هبلك].
2. مورفولوجيا وقياس حجم nanocarrier
   1. استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS)¹¹ أو نانوحبيبات تتبع تحليل¹³ لقياس حجم nanocarrier.
      ملاحظة: نانوكاريرس التي تكونت من شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش يتوقع لها متوسط قطرها بين 100-200 نانومتر، مع polydispersity الفهرس < 0.3.
   2. تحديد مورفولوجيا nanocarrier استخدام النقل المبردة الميكروسكوب الإلكتروني (كريوتيم)¹⁴.
      ملاحظة: نانوكاريرس التي تكونت من شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش من المتوقع أن تكون حويصلات البوليمر (بوليميرسوميس) مع الأغشية البوليمرية واضح ملموس وشكل كروي إلى حد كبير.
3. (اختياري) اختبار تركيبات الذيفان
   1. (الخيار 1) استخدام تحليل يستند إلى الخلية لوجود الذيفان أو خلايا الأزرق الخام مثلاً، أو خلايا TLR4 HEK الأزرق (انظر الجدول للمواد)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة، في أما تحليل الكمي أو النوعي ل lipopolysaccharides (LPS)¹³ .
   2. (الخيار 2) استخدام أدوات تحليل¹⁵ ليساتي ليمولوس أميبوسيتي (ال)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

4-تصنيع مضخة الحقن عالية السرعة للأغذية

1. اصطناع مكونات أداة مخصصة.
   ملاحظة: تتوفر نماذج ثلاثية الأبعاد لجميع أجزاء مخصصة بالقطع في المواد التكميلية.
   1. آلة هيكل الصك متعدد الطبقات من ¾ "ألواح اﻷكريليك وتجميع (انظر ملفات تكميلية 1-5).
      ملاحظة: قد اﻷكريليك ضعف المقاومة الكيميائية. إذا كان الصك ليتم استخدامها مع مذيبات قاسية، وآله القاعدة من معدن تعتبر مناسبة للتطبيق.
   2. طباعة أجزاء الطباعة ثلاثية الأبعاد مع البلاستيك بوليلاكتيدي (جيش التحرير الشعبي).
      1. طباعة على جهاز 2-جزء الطرد (SE) حقنه: سراج الدين الجزء 1-"تزعمت الخلفي" كتلة عقد النقل (5F الشكل، الجزء الرمادي؛ ملف تكميلي 6) وسراج الدين الجزء 2-دليل "طرد الجبهة" (الشكل 5F، جزء السوداء؛ ملف تكميلي 7). انظر 2 ملف تكميلي للخطط.
      2. طباعة الأقواس استشعار الأشعة تحت الحمراء (الشكل 5I، مربعات سوداء؛ الملفات التكميلية 8 و 9).
      3. (اختياري) طباعة قوس المكبس حقنه مزدوجة.
2. ربط طبقات هيكل الصك جنبا إلى جنب مع البراغي عرافة M5 وإضافة أقدام مطاطية للقاعدة.
3. تكوين جهاز كمبيوتر واحد مع نظام التشغيل غنو/لينكس راسببيان 8.0 (جيسي) (استناداً إلى لينكس ديبيان).
   ملاحظة: تتوفر برامج لتشغيل الأداة عند الطلب. أداة برنامج شفرة المصدر متاحة عند الطلب. عند تلقي ملف من نوع zip، تحميل كافة التبعيات المحددة في الملف التمهيدي. ويشمل هذا البرنامج واجهة مستخدم الرسومية بسيطة التي تمكن من السيطرة على أداة عملية، بما في ذلك معلمات التشغيل الأساسية (سرعة موتور، الاتجاه، إلخ). يتم تشجيع المستخدمين على التوسع في التعليمات البرمجية المصدر موجود والبرنامج وحدات مخصصة مصممة خصيصا لاستخدامها في التجارب الخاصة بهم. جميع البرامج تمت كتابته باستخدام بيثون 2.7.12، وهو غير متوافق حاليا مع بيثون 3. وتستخدم RPi، بيكوبورجريف، وكيفي، ووحدات المعالجة. الملف التمهيدي يحتوي على معلومات مفصلة بشأن ترخيص توزيع البرنامج.
4. قم بتثبيت 24 V نحي العاصمة المحرك (الشكل 5A) والشرائح الدقيقة (4.5 "(114.3 مم) السكتة الدماغية؛ المسمار 1.27 ملم يؤدي) (الشكل 5).
   ملاحظة: المحرك V DC 24 المستخدمة هنا له دورة في الدقيقة_{كحد أقصى}، أنا_{كحد أقصى}، وعزم الدوران الكامل-تحميل 4,252 لفة في الدقيقة، 4.83 A، و ~0.2 N * m، على التوالي.
   1. (اختياري) ضع الحشو تحت المحرك لإخماد الاهتزاز أثناء العملية.
      ملاحظة: من المستحسن أن يتم قطع وسادة مطاطية سميكة 2-3 مم تناسب أبعاد قاعدة صك النقل الحركي.
   2. جبل الشريحة الدقة إلى قاعدة الصك.
      1. إزالة الخيوط قضيب مؤقتاً.
      2. جبل شريحة باستخدام آلة المسمارين #8-32 شقة.
   3. المملون موتور DC جبل لشريحة الدقة باستخدام المسمار شعاع اقتران (1-1/4 "طول) تحتوي على 6/16" وقطرها 1/4 ".
      ملاحظة: اعتماداً على سمك اﻷكريليك المستخدمة في آلة طبقات قاعدة الصك، يلزم الحشوات إلى مستوى مهاوي الشريحة الحركية والدقة.
5. تجميع منصة الطرد من لوحات معدنية وأقواس زاوية على شكل L (الشكل 5). جبل معادن منصة لمنصة انزلاق (ترفق بقضيب الخيوط) باستخدام مسامير #6-32. انظر التخطيطي الشريحة الدقة التي توفرها الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل بشأن القيود المتزايدة.
6. تجميع حقنه طرد إعداد النظام.
   1. إرفاق كتل وسادة الحركة الخطية (تركيب منصات + تأثير الحركة الخطية) على M8 مطلي بالكروم الفولاذ المقاوم للصدأ القضبان (القضبان الفولاذية موازية يمكن سهولة ملاحظة في الشكل 5).
   2. مؤشر ترابط القضبان من خلال القضبان دليل الدعم وتأمين رمح الخطية. استخدم ثلاثة أدلة للسكك الحديدية. جبل سراج الدين الأجزاء 1 و 2 على كتل وسادة استخدام مسامير آلة M4.
   3. الانضمام إلى سراج الدين الأجزاء 1 و 2 مع M8 عرافة البراغي فضفاضة. تكوين المساحة بين سراج الدين الجزء 1 و 2 مع ضغط حلزونية الينابيع تغطي كل الترباس التي تم تأمينها بين اثنين إلى الداخل التي تواجه النايلون البطانات (انظر الشكل 5F). جبل هذه البطانات في الخارج سراج الدين الجزء 1 والجزء 2 من سراج الدين.
7. أسلاك الدائرة (انظر الشكل 6 الرسم التخطيطي الأسلاك الأساسية)
   1. قم بتوصيل وحدة تحكم المحرك I2C/حزب العمل الديمقراطي، 3.3 V، ودبابيس GND على الكمبيوتر مجلس واحد.
   2. الاتصال الطرفية موتور DC M-و M + كتل المجلس وحدة تحكم المحرك. الاتصال 24 الخامس، 2.5 بالتيار الكهربائي (الشكل 5B) إلى كتل V + و GND لوحدة تحكم المحرك (هو المغطى التحكم في مربع إلكترونيات بسيطة في التصميم النهائي، انظر الشكل 5 ح).
   3. قم بتوصيل أطراف 3V3 و 5V الهيئة لمراقبة السيارات دبابيس كل منهما على الكمبيوتر مجلس واحد. قم بتوصيل حزب العمل الديمقراطي و SCL دبابيس لوحدة تحكم المحرك دبابيس 3 و 5 من الكمبيوتر مجلس واحد، على التوالي.
      ملاحظة: يتم إصدار الأوامر إلى العاصمة المحرك من الكمبيوتر مجلس واحد من خلال وحدة تحكم محرك. سرعة موتور يسيطر عليه تنظيم الجهد عبر محطات السيارات عن طريق عرض الذبذبات. في هذا الإعداد، الحد الأقصى الحالي من خلال تشغيل المحرك V DC 24 (الكامل-تحميل التيار: 4.83 A) يقتصر على 2.5 ألف من إمدادات الطاقة الخامس 24. من المستحسن أن سلكية على حلبة السيارات من خلال إغلاق عادة (NC) طوارئ وقف (الشكل 5 ياء). القيام بذلك يوفر وسيلة لعرقلة على حلبة السيارات لتمكين عملية إيقاف تشغيل طارئة أساسية.
   4. الاتصال الأمامي والخلفي قرب تحت الحمراء أجهزة الاستشعار (المسافة الرقمية أجهزة الاستشعار، 5I الشكل) بدبابيس جبيو RPi 24 و 23 على التوالي.
      1. مسار الأسلاك الاستشعار من خلال قنوات في قاعدة الصك.
         ملاحظة: أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء عدم الاتصال فاصل-شعاع أجهزة استشعار الحركة بالكشف عن مجموعة من 2-10 سم.
      2. 4.7.4.2 المفاجئة أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء السلكية ضمن أقواس طباعة 3D استشعار الأشعة تحت الحمراء (الشكل 5I، مربعات سوداء) وجبل على قاعدة الصك. عند تعيين بشكل صحيح في القوس، وجه استشعار ينبغي أن تبرز إلى الخارج من 14 مم × 7 مم مستطيلة افتتاح القوس.
         ملاحظة: هذه الأقواس الاستشعار يمكن مؤقتاً تركيبة استخدام Velcro أو مادة لاصقة (تصاعد مؤقت مفيد بشكل مناسب تعديل وتحسين وضع جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء). بدلاً من ذلك، تحميل بشكل دائم بحفر ثقوب دليل صغير في قاعدة الصك وتأمين الأقواس مع مسامير M2.
   5. توصيل شاشة تعمل بلمس شاشات الكريستال السائل 7 "5V، GND، وعرضها دبابيس واجهة تسلسلية (الطبري) من الكمبيوتر مجلس واحد. 7 "RPi وشاشات الكريستال السائل عرض الجمعية ويرد في الشكل 5.

5-افتعال بوليميرسوميس عبر تزعمت استخدام مضخة الحقن عالية السرعة مصنوعة خصيصا

1. (الخيار 1) استخدام الوضع التلقائي تشغيل.
   1. حدد " تشغيل تلقائي " من القائمة الرئيسية. سيقوم النظام بطلب المستخدمين للسماح للمحرك لوضع منهاج طرد حقنه إلى بداية الشريحة الدقة تلقائياً. تأكد من أن المسار أمام وخلف لوحة معدنية واضحة قبل الشروع.
   2. تحميل 1 مل المحاقن البلاستيكية كما هو موضح في المقطع 2.5 والمحاقن جبل على الموصلات اللوير الإناث من خلاط CIJ. تحميل خلاط CIJ (مع المحاقن المرفقة) في افتتاح مستطيلة بنقل طرد الخلفي (انظر الشكل 5E).
   3. تعيين سرعة المحرك المطلوب (وحدات: لفة في الدقيقة) باستخدام شريط التمرير في واجهة المستخدم الرسومية (انظر الملاحظة أدناه للاعتبارات الهامة). سرعة موتور الأمثل سوف تعتمد على ضخ محددة والإعداد ولكن يجب ضمان معدل تدفق على الأقل 1 مل/s لإبعاد قناة خلاط CIJ المقدمة هنا.
      ملاحظة: النظر في المسائل التالية أثناء إعداد معدل التدفق. في التكوين الرأسي تزعمت تعمل باليد، كواشف مختبر يطردون من المحاقن بمعدل مل ~ 1/s، ولكن يمكن أن يكون متغير جداً عندما باليد. وهذا هو ببساطة معدل التدفق من خلال فوهة المحقن، الذي تسيطر عليه المعدل الذي تقدم المستخدم المكبس المحاقن. علما بأن معدل 1 مل/ثانية عدم الإشارة إلى معدل تدفق الخروج من فوهة قطرها أصغر. في ما ورد أعلاه تحديد أبعاد القناة، مل ~ 1/ينبغي الإبقاء على s للتأكد من العدد رينولد المناسبة ل خلط مضطربة¹⁰. ويمكن استخدام معدلات تدفق مختلف ما دامت قطر القناة تبعاً للحفاظ على رقم رينولد يدعم الأوضاع المضطربة. بلونجيرس حقنه متقدمة بصفيحة معدنية عمودي، التحركات على طول شريحة ألمنيوم عالية الدقة بالإضافة إلى 24 ت نحي موتور DC. في هذا التكوين، ومعدل التدفق الأقصى للبرميل يتأثر بعدد من العوامل، بما في ذلك (1) أقصى سرعة موتور (4,252 لفة في الدقيقة) وقيادة المسمار الدقة الشريحة (1.27 مم) الذي يقترن بالمحرك رمح (2) عزم الدوران للمحرك (~0.2 N * m لكامل-l أقام عزم الدوران)، الذي يلزم للتغلب على المقاومة لتدفق المساهمات الضغط الخلفي (3) من دخول السوائل والخروج من خلاط CIJ، و (4) قوة المحاقن المستخدمة (المستخدمين ينبغي أن تضع في اعتبارها القوى الحقن، واستخدام المحاقن من القوة المناسبة). وفيما يتعلق بالنقطة (2)، عند زيادة تدفق معدل كافية عزم الدوران المطلوب لتجنب توقف المحرك مع الحفاظ على طرد مطرد تحت زيادة الضغط الخلفي. معدلات تدفق البرميل – توضيح تدفق البرميل سعر أن النظام المذكور آنفا يمكن تحقيق، والنظر في القضية حيث تزعمت تتم باستخدام كواشف مختبر تم تحميلها في اثنين واحد-المليلتر المحاقن. يجب أن تقدم معدل من خلال البرميل، المحرك تحقيق تدفق مل/s 1 لوحة معدنية المسافة التي تحددها طول المكبس (~ 68 ملم لحقنه مل واحد نموذجي) في ثانية واحدة. شريطة أن يؤدي المسمار 1.27 ملم من الشرائح الدقيقة، وبالتالي أن محرك DC التشغيل 4,252 لفة في الدقيقة القادرة على النهوض المنصة يصل إلى ~ 90 ملم/s (رؤ 71/s * 1.27 مم/rev). هذا يتوافق مع معدل تدفق برميل ~1.3 مل/s، والذي يتجاوز المعدل المستهدف 1 مل/s.
   4. قبل تشغيل الأداة، التحقق من نظام لضمان أن المسار المنهاج الواضح من العراقيل، وأجهزة الأشعة تحت الحمراء قرب كشف الأمامية والخلفية واضحة من العوائق (أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء هي المربعات السوداء الصغيرة قرب الشريحة الدقة المحطات؛ انظر 5I الشكل). أيضا التأكد من أن يتم توجيه مأخذ أنابيب شعرية من خلاط CIJ في حاوية جمع مناسب (مثلاً: زجاج الكأس، إلخ).
   5. لطرد كواشف مختبر من المحاقن وخالط CIJ، اضغط على زر تشغيل في واجهة البرنامج.
2. (الخيار 2) استخدام وضع التشغيل اليدوي. تشير إلى اتجاهات وضع تشغيل السيارات المذكورة أعلاه وملاحظة التغيير التالي خطوة 5.1.5: اضغط الزر الأمام الضغط بشكل مستمر من خلال انتهاء التشغيل (أي المنهاج السلف في الاستجابة إلى حدث في الصحافة، والمحرك سيتم إيقاف استجابة لحدث في الإصدار).
3. (الخيار 3) استخدام منصة دليل المواقع الوضع؛ هذا الوضع يسمح للمستخدمين بوضع منهاج العمل عن طريق تشغيل المحرك على سرعة منخفضة (20% طاقة) ردا على الأزرار الأمامية والعكسية على واجهة البرنامج.

النتائج

وهنا، وقد قدمنا بروتوكول بسيط لصياغة نانوكاريرس قادرة على تحميل الشحنات ماء ومسعور الآمنة للماوس في فيفو والرئيسيات غير البشرية الإدارة^11،13. كما أدرجنا بروتوكول مفصل لتركيب البوليمر المستخدمة في نتائج تمثيلية، جنبا إلى جنب مع وصف لت...

Discussion

وقدمنا الإرشادات التفصيلية لتلفيق السريع من بوليميرسوميس استخدام شماعة₁₇-bl-PPS₃₅-ش كوبوليمر ديبلوك. بوليميرسوميس حويصلية هي مورفولوجية الإجمالية الأولية المجتمعون في هذه النسبة شماعة ماء والوزن الجزيئي كتلة الصحفي مسعور. عندما تمس عدة مرات، لديهم قطره و polydispersity يطابق بولي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition	CanaKit	UPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter	Adafruit	1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric	VXB	kit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter	Adafruit	1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity	McMaster-Carr	5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor	Iron Horse	MTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display	Raspberry Pi	B0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi	PiBorg	BURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm	Pololu	1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque	Ruland	PSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl ether	Sigma Aldrich	202495
Methanesulfonyl chloride	Sigma Aldrich	471259
Toluene	Sigma Aldrich	179418
Toluene, Anhydrous	Sigma Aldrich	244511
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth)	Sigma Aldrich	419931
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269
Diethyl ether	Sigma Aldrich	296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrous	Sigma Aldrich	227056
Potassium carbonate	Sigma Aldrich	791776
Thioacetic acid	Sigma Aldrich	T30805
Tetrahydrofuran	Sigma Aldrich	360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I	Sigma Aldrich	199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol	Sigma Aldrich	403067
Propylene sulfide	Sigma Aldrich	P53209
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283
Methanol	Sigma Aldrich	320390
Sodium hydroxide solution 1.0 N	Sigma Aldrich	S2770
Endotoxin-free water	GE Healthcare Life Sciences	SH30529.01
Paper pH strips	Fisher Scientific	13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	TMS-012
Borosilicate glass scintillation vials	Fisher Scientific	03-337-4
1 mL all-plastic syringe	Thermo Scientific	S75101
Sepharose CL-6B	Sigma Aldrich	CL6B200
Liquid chromatography column	Sigma Aldrich	C4169
CIJ mixer, HDPE	Custom
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Hydrogen peroxide solution	Sigma Aldrich	216763
HEK-Blue hTLR4	InvivoGen	hkb-htlr4
RAW-Blue Cells	InvivoGen	raw-sp
QUANTI-Blue	InvivoGen	rep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Assays	Lonza	N183-125