Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione

Riepilogo

Nanomateriali forniscono meccanismi versatili di consegna controllata terapeutico per scienza di base e traslazionale applicazioni, ma spesso la loro fabbricazione richiede competenze che non sono disponibile in più biomedical laboratories. Qui, presentiamo i protocolli per la fabbricazione scalabile e terapeutico carico di diversi nanovettori auto-assemblati utilizzando flash nanoprecipitazione.

Abstract

Nanomateriali presentano una vasta gamma di opzioni per personalizzare il rilascio controllato di payload molecolare singolo e combinato per applicazioni terapeutiche e imaging. Questa specificità aumentata può avere implicazioni cliniche significative, tra cui una riduzione di effetti collaterali e i dosaggi più bassi con potenza superiore. Inoltre, in situ di mira e modulazione controllata dei sottoinsiemi delle cellule specifiche può migliorare le indagini in vitro e in vivo dei fenomeni biologici fondamentali e sonda la funzione delle cellule. Purtroppo, le competenze necessarie in nanoscala scienza, chimica e ingegneria spesso vietare laboratori senza esperienza in questi campi da fabbricare e personalizzazione dei nanomateriali come strumenti per i loro studi o veicoli per loro strategie terapeutiche. Qui, forniamo i protocolli per la sintesi e l'assemblaggio scalabile di un sistema di copolimero versatile non tossico blocco suscettibile alla formazione facile e carico di veicoli su scala nanometrica per applicazioni biomediche. Flash nanoprecipitazione si presenta come una metodologia per la fabbricazione rapida di nanovettori varia da poly(ethylene glycol) -bl-copolimeri di poly (solfuro di propilene). Questi protocolli permetterà laboratori con una vasta gamma di competenze e risorse per facilmente e riproducibile fabbricare nanocarrier avanzati sistemi di consegna per le loro applicazioni. Processo di progettazione e costruzione di uno strumento automatizzato che impiega una pompa a siringa ad alta velocità per facilitare la nanoprecipitazione flash e per consentire un controllo maggiore sull'omogeneità, dimensione, morfologia e caricamento dei nanovettori polymersome è descritto.

Introduzione

Nanovettori consentono per la consegna controllata di merci piccole e macromolecolare, tra cui entità attive che, se non incapsulato, sarebbe troppo idrofobico per somministrazione in vivoe/o altamente degradabili. Delle morfologie di nanocarrier regolarmente fabbricate, polimeriche vescicole analoghe a liposomi (chiamati anche polymersomes) offrono la possibilità di caricare contemporaneamente idrofile e idrofobe cargo^1,2. Malgrado i loro vantaggi promettenti, sono ancora rari in applicazioni cliniche polymersomes dovuta, in parte, alle diverse sfide chiave nella loro produzione. Per uso clinico, polymersome formulazioni devono essere effettuate in batch su vasta scala, sterile e coerente.

Una serie di tecniche può essere utilizzato per polymersomes forma da un copolimero diblock, ad esempio poly(ethylene glycol) -block-poli (solfuro di propilene) (PEG -bl- PPS), che includono dispersione solvente³, film sottile reidratazione^{1 , 4}, microfluidica ^5,6e idratazione diretta⁷. Dispersione di solvente comporta tempi di incubazione lungo in presenza di solventi organici, che possono denaturare alcuni payload bioattivi, come le proteine. Reidratazione di film sottile non offrono controllo sopra la polidispersità del formato polymersomes, spesso richiedono tecniche di estrusione costoso e richiede tempo per ottenere monodispersity accettabile. Inoltre, sia microfluidica e idratazione diretta sono difficili da scala per grandi volumi di produzione. Dei metodi di fabbricazione diversi nanocarrier, flash nanoprecipitazione (FNP) offre la possibilità di fare su larga scala e riproducibile formulazioni^8,9,10. Mentre FNP precedentemente era riservata per la formulazione di nanoparticelle solid-core, il nostro laboratorio ha recentemente esteso l'utilizzo di FNP per includere la costante formazione di diversi PEG -bl- PPS nanostruttura morfologie^{11, 12}, tra cui polymersomes¹¹ e bicontinue nanosfere¹². Abbiamo trovato che FNP era in grado di formare monodispersi formulazioni di polymersomes senza la necessità di estrusione, determinando i valori di indice di polidispersione superiore rispetto ai non-estruso polymersomes formata da dispersione di reidratazione e solvente di film sottile ¹¹. bicontinue nanosfere, con loro grande domini idrofobici, non erano in grado di essere formata da reidratazione di film sottile, nonostante la formazione nell'ambito di una serie di condizioni solvente con FNP¹².

Qui, forniamo una descrizione dettagliata per la sintesi di PEG -bl- PPS diblock Copolimero utilizzato nella formazione di polymersome, il mixer di getti (CIJ) di impingement confinati utilizzato per FNP, il FNP protocollo stesso e l'applicazione di un sistema automatizzato per ridurre la variabilità di utente. Sono disponibili informazioni su come sterilizzare il sistema sufficientemente per produrre privo di endotossina formulazioni per uso in vivoe dati rappresentativi riguardanti la caratterizzazione di polymersomes formata da FNP. Con queste informazioni, i lettori con interesse che utilizza polymersomes per lavoro in vitro e in vivo saranno in grado di fabbricare le proprie formulazioni monodispersi sterile. Lettori con esperienza nelle formulazioni di nanocarrier e con competenze di sintesi del polimero sarà in grado di testare rapidamente i propri sistemi di polimero usando FNP come un'alternativa potenziale alle loro tecniche di formulazione attuale. Inoltre, i protocolli descritti nel presente documento possono essere utilizzati come strumenti didattici per la formulazione dei nanovettori in corsi di laboratorio di nanotecnologia.

Protocollo

1. sintesi di Poly(Ethylene Glycol) -block-poli (solfuro di propilene)-tiolo

1. Sintetizzare metossi-poly(ethylene glycol) mesylate (Mn: 750) (MeO-PEG₁₇-Ms, io).
   1. Sciogliere 10 g di MeO-PEG₁₇-OH in 200 mL di toluene 100% all'interno di un pallone a fondo tondo 3-collo (RBF) sotto agitazione magnetica a 600 giri/min.
   2. Collegare il RBF 3-collo a un apparato di Dean-Stark, si è collegato ad un condensatore, mantenere l'intero sistema sotto gas inerte, azoto o argon.
   3. Posto il RBF 3-collo in bagno d'olio, calore a 165 ° C mescolando a 600 giri/min.
   4. Rimuovere tracce di acqua e 100 mL di toluene mediante distillazione azeotropica.
   5. Rimuovere il RBF 3-collo da olio, staccare l'apparato di Dean-Stark, mantenendo condizioni di gas inerte e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.
   6. Aggiungere mL 5,6 di 100% trietilammina (3 molare EQ.) e 300 mL di toluene 100% anidro MeO-PEG₁₇-OH soluzione mescolando a 600 giri/min.
   7. Spostare il RBF 3-collo in un bagno di ghiaccio, mantenere agitazione a 600 giri/min e condizioni di gas inerte.
   8. Diluire 3,1 mL di cloruro di methanesulfonyl 100% (3 molare EQ.) in 30 mL di toluene 100%, aggiungere lentamente il RBF 3-collo tramite imbuto gocciolatore mescolando a 600 giri/min.
   9. Agitazione per una notte a 600 giri/min a temperatura ambiente in condizioni inerti.
   10. Filtro soluzione attraverso un imbuto di Buchner imballato con la terra di diatomee (Vedi Tabella materiali) per rimuovere i sali.
   11. Rimuovere toluene tramite un evaporatore rotante con bagno d'acqua a 40 ° C, rotazione a 120 giri/min e pressione impostata tra 50-100 millibar.
   12. Ri-sciogliere il prodotto in 200 mL di diclorometano (DCM) di 100% e filtrare attraverso un imbuto di Buchner imballato con la terra di diatomee (Vedi Tabella materiali).
   13. Rimuovere DCM tramite un evaporatore rotante con bagno d'acqua a 40 ° C, rotazione a 120 giri/min e pressione impostata tra 450-600 millibar.
   14. Con parsimonia ri-sciogliere il prodotto in 100% DCM e lentamente precipitare prodotto aggiungendolo goccia a goccia (tramite una pipetta di Pasteur) a 500 mL di etere di etilico 100% ghiacciata. Mantenere sotto agitazione a 300 giri/min.
   15. Decantare o aspirare per eliminare l'etere etilico da prodotto precipitato, MeO-PEG₁₇- Mesylate e negozio di pernottamento in un essiccatore sotto vuoto ad asciugare completamente.
   16. Utilizzare il prodotto immediatamente, o memorizzare sotto gas inerte a-20 ° C per diversi mesi.
2. Sintetizzare il metossi-poly(ethylene glycol) Tio acetato (MeO-PEG₁₇-TA, II).
   1. Sciogliere 5 g di MeO-PEG₁₇-Ms (I) in 200 mL di 100% anidro dimetilformammide (DMF) in un 3-collo RBF, mescolare a 600 giri/min a temperatura ambiente sotto gas inerte.
   2. Aggiungere 2,5 g 100% di carbonato di potassio (3 molare EQ.) mescolando la soluzione.
      Nota: carbonato di potassio non si dissolve completamente in soluzione.
   3. Diluire 1,3 mL di acido thioacetic 100% (3 molare EQ.) in 100 mL di 100% anidro DMF e aggiungere goccia a goccia soluzione tramite un imbuto gocciolatore.
      Nota: L'acido Thioacetic ha un odore forte e sgradevole. Deve prestare attenzione per mantenere tutti gli oggetti sporchi all'interno della cappa chimica durante la notte prima di smaltimento o di pulizia.
   4. Mescolare energicamente (giri/min 600 o superiore) durante la notte a temperatura ambiente.
      Nota: Formazione di sale può facilmente compromettere l'agitazione di questa soluzione. Cura deve essere presa per mantenere mescolando durante la notte.
   5. Filtro soluzione attraverso un imbuto di Buchner imballato con la terra di diatomee (Vedi Tabella materiali).
   6. Rimuovere DMF tramite un evaporatore rotante con bagno d'acqua a 60 ° C, rotazione a 120 giri/min e pressione impostata tra 5-15 millibar.
   7. Sciogliere il prodotto in 100 mL di 100% tetraidrofurano (THF) e aggiungere una colonna imballata con allumina neutro per rimuovere le impurità di colore rosso/arancione.
   8. Rimuovere THF tramite un evaporatore rotante con bagno d'acqua a 40 ° C, rotazione a 120 giri/min e pressione impostata tra 200-300 millibar.
   9. Con parsimonia ri-sciogliere il prodotto in 100% DCM. Se forma un precipitato sale, filtro soluzione attraverso carta filtro del formato del poro μm 6 utilizzando un imbuto di Buchner.
   10. Lentamente precipitare prodotto aggiungendo goccia a goccia tramite pipetta Pasteur a 500 mL di etere di etilico 100% ghiacciata, mescolando a 300 giri/min. Etere etilico può essere necessario essere ulteriormente raffreddato a-20 ° C in un congelatore antideflagrante per diverse ore se precipitato non bloccarsi dalla soluzione a 4 ° C.
   11. Decantare o aspirare per eliminare l'etere etilico da prodotto precipitato, MeO-PEG17-Tio acetato. Conservare il prodotto durante la notte in un essiccatore sotto vuoto e successivamente sotto gas inerte a-20 ° C.
3. Sintetizzare diblock Copolimero poly(ethylene glycol) -blocco -poly(propylene sulfide)-tiolo (PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, III).
   1. Sciogliere MeO-PEG₁₇-TA (II) in 10 mL di 100% anidro DMF all'interno di un pallone Schlenk sotto argon, mescolando a 400 giri/min in un bagno di acqua temperatura ambiente.
   2. Aggiungere 1,1 eq molare di metossido di sodio (soluzione 0,5 M in metanolo), permettono di mescolare a 400 giri/min per 5 minuti.
   3. Aggiungere rapidamente, eq 35 molare del solfuro di propilene 100%, soluzione. Permettono di mescolare a 400 rpm per 10 minuti.
   4. Aggiungere 10 eq molare del 100% di acido acetico glaciale, permettono di mescolare a 400 giri/min per 5 minuti.
   5. Rimuovere DMF tramite un evaporatore rotante con bagno d'acqua a 60 ° C, rotazione a 120 giri/min e pressione impostata tra 5-15 millibar.
   6. Ri-sciogliere il prodotto con parsimonia in 100% DCM, precipitare in 80 mL di metanolo al 100%, diviso tra due provette di centrifuga a fondo conico da 50 mL.
   7. Provette coniche da centrifuga a 7500 x g per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante assente.
   8. Conservare il prodotto, PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, pernottamento in un essiccatore sotto vuoto e successivamente sotto gas inerte a-20 ° C.

2. assemblare PEG -bl -PPS nanovettori via Hand-Powered Flash nanoprecipitazione

1. (Opzionale) Sterilizzare il mixer di getti (CIJ) di impingement confinati.
   1. All'interno di una cappa di sicurezza biologica (BSC), immergere il mixer con tutte le parti smontate durante la notte all'interno di 0.1 M NaOH.
   2. Rimontare il miscelatore CIJ e fluire attraverso acqua esente da endotossine utilizzando siringhe luer-lock.
   3. Verificare il pH dell'acqua e continuare a flusso d'acqua attraverso fino a pH registri come neutrale.
2. Sciogliere PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH polimero e idrofobo cargo in THF (soluzione urto 1).
   1. Pesare 20 mg di PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH in una provetta da 1,5 mL.
   2. Aggiungere idrofobi coloranti (ad es.,DiI, ICG), farmaci (ad es.,rapamicina), o altri carichi.
      Nota: Cargo può essere secco o disciolto in un solvente miscibile in acqua, preferibilmente THF. Se il carico è insolubile in DMF o THF, un altro solvente miscibile in acqua può essere utilizzato, ma con parsimonia, come il polimero è improbabile da essere solubili. La quantità di carico che possa essere caricato è dipenda sulle proprietà del carico stesso (ad esempio, il peso molecolare, l'idrofobicità, sterici considerazioni) e dovrebbe essere esplorato su un caso per caso^11,12.
   3. Aggiungere 500 µ l di 100% THF al polimero e cargo, vortice vigorosamente a dissolversi.
3. Sciogliere idrofilo carico in tampone acquoso (soluzione urto 2). Per questo, sciogliere idrofilo carico per essere caricato all'interno di vescicole di polimero in 500 µ l di un tampone acquoso (ad es., tampone fosfato salino, acqua pura, ecc.) come necessario.
4. Aggiungere tampone serbatoio.
   1. Aggiungere 2,5 mL di un tampone acquoso di scelta (ad es., 1 x tamponato fosfato salino) ad un serbatoio di dimensionato adeguate (ad es., un flaconcino di scintillazione di vetro da 20 mL). Posizionare il serbatoio sotto miscelatore CIJ tale che il deflusso dal mixer entra direttamente nel serbatoio.
5. Caricare soluzioni di urto in siringhe monouso in plastica separata da 1 mL.
6. Incidono soluzioni contro l'altro per formare nanostrutture e caricarli con il payload contemporaneamente.
   1. Inserire siringhe adattatori Luer-lock nella parte superiore del mixer CIJ.
   2. In un movimento unico, agevole e rapido, è necessario premere entrambi siringhe simultaneamente e con la stessa forza.
      Nota: Se si esegue più impingements sequenziale, in primo luogo raccogliere deflusso in un serbatoio vuoto.
   3. (Opzionale) Eseguire più impingements. Soluzione di nanostruttura nascente suddivisa tra due siringhe e 2.6.1-2.6.2 di ripetere i passaggi fino a 4 volte di più.
   4. Raccogliere il deflusso nel serbatoio tampone-riempito acquoso preparato in 2.4.1 e mescolare delicatamente per garantire la miscelazione.
7. Rimuovere il carico scaricato e solvente organico.
   1. (Opzione 1) Dializzare nanocarrier formulazione nello stesso tampone acquoso utilizzato per urto e nel serbatoio, utilizzando tubi di un appropriato MW cut-off per almeno 24 ore con almeno 2 cambi di buffer. Questa operazione può essere eseguita a temperatura ambiente.
      Nota: Nanovettori saranno trattenuta da tubazione con un cut-off MW < 100.000 kDa e potenzialmente possono essere conservati da tagli superiori pure. Questa opzione mantiene la sterilità quando eseguita in una BSC mediante tampone sterile.
   2. (Opzione 2) Filtrare la formulazione attraverso una dimensione esclusione o dissalazione/buffer cambio colonna (ad es., Sepharose 6B) utilizzando 1X PBS come il tampone acquoso.
      Nota: Questa opzione mantiene la sterilità quando eseguita in una BSC con una colonna che è stato accuratamente sterilizzata.
   3. (Opzione 3) Rimuovere il solvente organico volatile mediante essiccazione sotto vuoto durante la notte.
   4. (Opzione 4) Filtrare la formulazione utilizza un sistema di filtrazione tangenziale flusso utilizzando un filtro di kDa di 50-100 ad una portata di 20-60 mL/min per 15 minuti a 1 ora, a seconda del peso molecolare del carico unencapsulated essendo purificato distanza (il più grande carico richiederà più tempo).
8. (Opzionale) Concentrare la formulazione di nanocarrier.
   1. (Opzione 1) Concentrarsi utilizzando un sistema di concentratore di spin (ad es., colonna con MW taglio > 100.000), usato come descritto dal produttore.
      Nota: Nanovettori potrebbero essere necessario essere risospesi tra spin e possono richiedere un numero di giri di concentrare fino a volume desiderato. Concentrazione di spin può ridurre la sterilità di nanocarrier formulazioni.
   2. (Opzione 2) Ridurre il volume mediante essiccazione sotto vuoto.
      Nota: La variazione di Volume è difficile da controllare in queste condizioni, e cura deve essere presa per mantenere osmolarità prima e dopo la concentrazione.
9. Conservare nanovettori a 4 ° C per settimane o mesi. Prima dell'uso dopo il deposito, brevemente formulazioni di nanocarrier di vortice.

3. caratterizzare Nanocarrier formulazioni

1. Misurare l'efficienza di caricamento
   1. Se il carico è fluorescente o assorbe fortemente a una determinata lunghezza d'onda di fuori di 260-450 nm, misurare la fluorescenza/assorbanza usando un fluorimetro/spettrofotometro.
      Nota: PEG -bl- PPS assorbe fortemente da 260-310 nm e polymersome formulazioni assorbono da 310-450 nm, che può complicare la quantificazione del carico che assorbe alla lunghezza d'onda simile.
   2. Se il carico assorbe all'interno della gamma di 260-450 nm ed è idrofilo, perturbare PEG -bl- PPS nanostrutture aggiungendo 25 μL della formulazione di un volume uguale di 1% H₂O₂ o 1% Triton X-100 e successivamente separare e distinguere carico da assorbanza polimero tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna di esclusione di formato compatibile con acquosa buffer (ad esempio, una colonna di Sepharose 6B) ¹¹.
   3. Se il carico assorbe all'interno della gamma di 260-450 nm ed è solubile in DMF o THF, lyophilize la formulazione mediante congelamento 100 μL in un tubo di plastica da 1,5 mL a-80 ° C durante la notte. Quindi porre la provetta in un contenitore vuoto di vetro e posto su un liofilizzatori. Attendere 24 ore per liofilizzazione per verificarsi e successivamente ri-sciogliere in 50 μL di DMF o THF prima del rilevamento tramite HPLC e separazione.
2. Misura nanocarrier dimensioni e morfologia
   1. Utilizzare diffusione dinamica della luce (DLS)¹¹ o nanoparticle tracking analysis¹³ per misurare dimensioni nanocarrier.
      Nota: Nanovettori formano da PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH sono attesi hanno un diametro medio compreso tra 100-200 nm, con un polidispersità Indice < 0,3.
   2. Determinare nanocarrier morfologia mediante criogenico trasmissione microscopia elettronica (cryoTEM)¹⁴.
      Nota: Nanovettori formano da PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH si pensano che siano le vescicole di polimero (polymersomes) con una membrana polimerica chiaramente percepibile e forma in gran parte sferica.
3. (Opzionale) Formulazioni di questa prova per endotossina
   1. (Opzione 1) Utilizzare un'analisi basata sulle celle per la presenza di endotossine, ad esempio, le cellule blu crudo o cellule HEK blu TLR4 (Vedi Tabella materiali), come descritto dal fabbricante, in entrambi un'analisi quantitativa o qualitativa per lipopolisaccaridi (LPS)¹³ .
   2. (Opzione 2) Utilizzare un kit di test¹⁵ Limulus metodo Lysate (LAL), come descritto dal produttore.

4. realizzazione di una pompa a siringa ad alta velocità per FNP

1. Fabbricare componenti dello strumento personalizzato.
   Nota: modelli 3D per la lavorazione di tutte le parti su ordinazione sono disponibili in materiali supplementari.
   1. Macchina telaio multistrato strumento da ¾" lastre acriliche e assemblare (Vedi File supplementari 1-5).
      Nota: L'acrilico ha scarsa resistenza chimica. Se lo strumento deve essere utilizzato con solventi aggressivi, macchina della base da un metallo ritenuta idonea per l'applicazione.
   2. Parti di stampa 3D con stampato con plastica polilattide (PLA).
      1. Stampare l'apparato di siringa espulsione (SE) in 2 parti: parte 1 - blocco posteriore FNP holding carrozza (Figura 5F, parte grigia; File complementare 6) e SE parte 2 - Guida di espulsione frontale (Figura 5F, parte nera; File complementare 7). Per schemi, vedere complementare File 2 .
      2. Stampare le graffe di sensore a infrarossi (Figura 5I, scatole nere; File supplementari 8 e 9).
      3. (Opzionale) Stampare il tutore di pistone siringa doppia.
2. Fissare strumento telaio strati insieme con bulloni a testa esagonale M5 e aggiungere i piedini in gomma alla base.
3. Configurare un computer monoscheda con il sistema operativo Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (basato su Linux Debian).
   Nota: Il Software per il funzionamento dello strumento è disponibile su richiesta. Strumento codice sorgente del software disponibile su richiesta. Dopo aver ricevuto il file zippato, scaricare tutte le dipendenze specificate nel file Leggimi. Questo software include una semplice interfaccia grafica che consente un controllo funzionamento dello strumento, compresi i parametri di esecuzione base (velocità del motore, direzione, ecc.). Gli utenti sono incoraggiati a espandere il codice sorgente esistente e moduli personalizzati del programma su misura per utilizzano nei propri esperimenti. Tutto il software è stato scritto utilizzando Python 2.7.12 e non è attualmente compatibile con Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy e moduli di elaborazione multipla sono utilizzate. Il file README contiene informazioni dettagliate per quanto riguarda la licenza di distribuzione del software.
4. Installare un 24 V spazzolato motore di CC (Figura 5A) e slitta di precisione (4,5"(114,3 mm) colpo; vite di 1,27 mm piombo) (Figura 5).
   Nota: Il motore a 24 V DC usato qui ha un RPM_max, sono_maxe la coppia a pieno carico di 4.252 giri/min, 4,83 A e ~0.2 N * m, rispettivamente.
   1. (Opzionale) Posto imbottitura sotto il motore per smorzare le vibrazioni durante il funzionamento.
      Nota: È consigliabile che un pad di gomma di spessore di 2-3 mm viene tagliato per adattarsi alle dimensioni del carrello del motore della base dello strumento.
   2. Montare il vetrino di precisione alla base dello strumento.
      1. Rimuovere temporaneamente la barra filettata.
      2. Montare il vetrino utilizzando due viti a macchina piatta #8-32.
   3. Motore di CC di Monte alla diapositiva di precisione mediante accoppiamento di fascio a vite (1-1/4" lunghezza) contenente 6/16" e 1/4" diametro fori.
      Nota: A seconda dello spessore di acrilico usato per gli strati di base dello strumento della macchina, spessori possono essere necessario per livellare gli alberi motore e precisione diapositiva.
5. Assemblare la piattaforma di espulsione da piastre di metallo e ganci a forma di L angolo (Figura 5). Montare il metallo base piattaforma a piattaforma scorrevole (allegata alla barra filettata) utilizzando viti #6-32. Vedere schema diapositiva precisione fornita dal produttore per informazioni dettagliate per quanto riguarda i vincoli di montaggio.
6. Assemblare la configurazione del sistema siringa per espulsione.
   1. Allegare i blocchetti di cuscino di movimento lineare (piattaforme di montaggio + cuscinetto di movimento lineare) sulle rotaie di acciaio cromato di M8 (le rotaie d'acciaio parallele possono essere facilmente osservate nella Figura 5).
   2. Rotaie di filettatura passante lineare guida/supporto e bloccare le rotaie. Utilizzare tre guide per la guida. Mount SE parti 1 e 2 sul cuscino blocchi usando viti M4.
   3. Senza bloccare Iscriviti SE parti 1 e 2 con bulloni a testa esagonale M8. Configurare lo spazio tra parte SE 1 e 2 con compressione elicoidale molle che copre ogni bullone che sono fissate tra due boccole di nylon rivolto verso l'interno (Vedi Figura 5F). Montare queste boccole all'esterno della parte 1 e parte 2.
7. Circuito del legare (vedere la Figura 6 per il diagramma di cablaggio di nucleo)
   1. Collegare il controller del motore per l'I2C/SDA, 3.3 V, e pin GND sul computer monoscheda.
   2. Collegare terminali del motore DC M - e M + blocchi della centralina motore. Connettersi a 24 V, 2,5 A di alimentazione (figura 5B) i blocchi V + e GND del controller del motore (il controller è racchiuso in una scatola semplice elettronica nel progetto finale, vedere la Figura 5 H).
   3. Collegare i pin 3V3 e 5V del Comitato di controllo del motore ai rispettivi pin sul single board computer. Collegare i pin SDA e SCL del controller del motore ai pin 3 e 5 del computer monoscheda, rispettivamente.
      Nota: I comandi sono eseguiti per il motore DC dal computer monoscheda tramite un regolatore del motore. Velocità del motore è controllata regolando la tensione tra i terminali del motore tramite modulazione di larghezza di impulso. In questa configurazione, la massima corrente che attraversa il motore 24 V DC (amperaggio a pieno carico: 4.83 A) è limitata a 2,5 A di alimentazione a 24 V. È consigliabile che il circuito del motore è collegato attraverso una normalmente chiusa (NC) di arresto di emergenza (Figura 5J). In questo modo fornisce un mezzo per interrompere il circuito del motore per consentire un funzionamento di base di arresto di emergenza.
   4. Collegare sensori anteriore e posteriore di prossimità ad infrarossi (sensori di distanza digitale, Figura 5I) al pin GPIO RPi 24 e 23, rispettivamente.
      1. Cablaggio del sensore di rotta attraverso condotti in base dello strumento.
         Nota: I sensori IR sono sensori di movimento senza contatto pausa-fascio con un range di 2-10 cm.
      2. 4.7.4.2 far scattare i sensori IR cablati in parentesi graffe stampa 3D sensore a infrarossi (Figura 5I, scatole nere) e montano sulla base dello strumento. Quando è correttamente impostato il tutore, la faccia del sensore dovrebbe sporgere verso l'esterno da 14 mm x 7 mm rettangolare apertura della ginocchiera.
         Nota: tali parentesi graffe del sensore possono essere temporaneamente montate utilizzando un adesivo o Velcro (supporto temporaneo è utile per regolare in modo appropriato e di ottimizzare il posizionamento del sensore IR). In alternativa, montare in maniera permanente Guida piccoli fori nella base dello strumento e fissando le parentesi graffe con viti M2.
   5. Collegare un display LCD touchscreen da 7" a 5V, GND e visualizzare PIN di interfaccia seriale (DSI) del computer monoscheda. 7" LCD visualizzazione assembly e RPi è illustrato nella Figura 5.

5. fabbricare Polymersomes via FNP utilizzando la pompa a siringa ad alta velocità su misura

1. (Opzione 1) Utilizzare la modalità di esecuzione automatica.
   1. Selezionare Auto Run dal menu principale. Il sistema richiederà agli utenti di lasciare il motore posizionare automaticamente la piattaforma di espulsione siringa all'inizio della diapositiva precisione. Assicurarsi che il percorso di fronte e dietro la piastra metallica sia chiaro prima di procedere.
   2. Caricare 1 mL siringhe in plastica come descritto nella sezione 2.5 e Monte siringhe su connettori Luer femmina del mixer CIJ. Caricare CIJ mixer (con siringhe allegate) nell'apertura rettangolare del carrello posteriore espulsione (Vedi Figura 5E).
   3. Impostare la velocità del motore desiderata (unità: giri/min) utilizzando il dispositivo di scorrimento nella GUI (Vedi nota sotto per considerazioni importanti). La velocità del motore ottima dipenderà la pompa specifica e installazione ma deve garantire una portata di almeno 1 mL/s per la CIJ Miscelatore canale dimensioni fornite qui.
      Nota: Considerare quanto segue durante la portata di impostazione. Nella configurazione FNP manuale verticale, reagenti vengono espulsi dalle siringhe ad un tasso di ~ 1 mL/s, ma può essere estremamente variabile mano guidata. Questo è semplicemente la portata attraverso il corpo della siringa, che è controllata dal tasso a cui l'utente fa avanzare lo stantuffo della siringa. Si noti che il tasso di 1 mL/s è non riferendosi alla portata di uscita dall'ugello del diametro più piccolo. A quanto sopra specificato dimensioni canale, ~ 1 mL/s dovrebbe essere mantenuta per garantire numero di un'appropriata Reynold per miscelazione turbolenta¹⁰. Diverse portate possono essere utilizzate fino a quando il diametro del canale è regolato di conseguenza per mantenere il numero di un Reynold che supporta condizioni turbolente. Lo stantuffo della siringa è avanzato da una placchetta metallica perpendicolare, che si muove lungo una diapositiva di alta precisione in alluminio accoppiati a 24 V DC motore spazzolato. In questa configurazione, la portata massima del barilotto è influenzata da una serie di fattori, tra cui (1) la velocità massima del motore (4.252 giri/min) e il passo della vite di precisione diapositiva (1,27 mm) che è accoppiato al motore (2) la coppia del motore del pozzo (~0.2 N * m di pieno-l OAD torque), che è necessaria per superare la resistenza per flusso (3) contributi di contropressione da fluido entrata e uscita dal mixer CIJ e (4) la forza delle siringhe usate (gli utenti devono essere consapevoli delle forze che agiscono sulle siringhe e usare siringhe di resistenza adatta). Per quanto riguarda il punto (2), quando si aumenta il flusso è richiesta per evit diare arrestarsi il motore mantenendo costante espulsione sotto la crescente pressione posteriore coppia sufficiente di tasso. Portate barile – per illustrare il flusso di canna valuta che il suddetto sistema può ottenere, si consideri il caso in cui il FNP è eseguito utilizzando reagenti caricati in due uno-millilitro siringhe. Per ottenere un flusso di 1 mL/s tasso attraverso la canna, il motore deve avanzare la piastra metallica la distanza definita dalla lunghezza dello stantuffo (~ 68 mm per una siringa di un tipico mL) in un secondo. Purché il passo della vite di 1,27 mm della diapositiva precisione, ne consegue che un motore di CC operanti a 4.252 giri è in grado di far avanzare la piattaforma fino a ~ 90 mm/s (71 giri/secondo * 1.27 mm/giro). Ciò corrisponde ad una portata di canna di ~1.3 mL/s, che supera la velocità di destinazione 1 mL/s.
   4. Prima dell'esecuzione dello strumento, controllare il sistema per garantire che il percorso della piattaforma sia ostruita, e che i rilevatori di prossimità IR anteriori e posteriori sono libere da ostruzioni (i sensori IR sono piccole scatole nere accanto alla diapositiva di precisione terminali; vedere Figura 5I). Inoltre assicurarsi che la presa di tubazione capillare dal mixer CIJ è indirizzata in un recipiente di raccolta appropriata (ex: vetro bicchiere, ecc.).
   5. Per espellere i reagenti dalle siringhe e nel mixer CIJ, premere il pulsante Run nell'interfaccia del software.
2. (Opzione 2) Modalità di esecuzione manuale di utilizzo. Fare riferimento alla Modalità di esecuzione automatica come indicato sopra e notare la seguente modifica al passo 5.1.5: premere il pulsante avanti continuamente pressato attraverso il completamento dell'esecuzione (cioè, la piattaforma avanza in risposta a un evento durante la stampa e il motore si fermerà in risposta a un evento il rilascio).
3. (Opzione 3) Piattaforma manuale uso posizionamento modalità; Questa modalità consente agli utenti di posizionare la piattaforma di funzionamento del motore a bassa velocità (20% di potenza) in risposta ai pulsanti avanti e indietro sul software di interfaccia.

Risultati

Qui, abbiamo presentato un semplice protocollo per la formulazione dei nanovettori in grado di caricare merci idrofilici e idrofobici che sono sicuri per in vivo mouse e primate non umano amministrazione^11,13. Abbiamo anche incluso un protocollo dettagliato per la sintesi del polimero utilizzato nei nostri risultati rappresentativi, insieme a una descrizione per la realizzazione di uno strumento personalizzato per l'urto ...

Discussione

Abbiamo fornito dettagliate istruzioni per la realizzazione rapida di polymersomes utilizzando PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH come il copolimero diblock. Polymersomes vescicolare sono la morfologia di aggregata primaria assemblata con questa proporzione di PEG idrofili e idrofobi PPS blocco molecolare peso. Quando impinged più volte, hanno un diametro e polidispersità che corrisponde polymersomes estruso attraverso una membrana nm 200 dopo essere stata formata tramite idratazione a film sott...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition	CanaKit	UPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter	Adafruit	1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric	VXB	kit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter	Adafruit	1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity	McMaster-Carr	5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor	Iron Horse	MTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display	Raspberry Pi	B0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi	PiBorg	BURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm	Pololu	1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque	Ruland	PSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl ether	Sigma Aldrich	202495
Methanesulfonyl chloride	Sigma Aldrich	471259
Toluene	Sigma Aldrich	179418
Toluene, Anhydrous	Sigma Aldrich	244511
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth)	Sigma Aldrich	419931
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269
Diethyl ether	Sigma Aldrich	296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrous	Sigma Aldrich	227056
Potassium carbonate	Sigma Aldrich	791776
Thioacetic acid	Sigma Aldrich	T30805
Tetrahydrofuran	Sigma Aldrich	360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I	Sigma Aldrich	199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol	Sigma Aldrich	403067
Propylene sulfide	Sigma Aldrich	P53209
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283
Methanol	Sigma Aldrich	320390
Sodium hydroxide solution 1.0 N	Sigma Aldrich	S2770
Endotoxin-free water	GE Healthcare Life Sciences	SH30529.01
Paper pH strips	Fisher Scientific	13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	TMS-012
Borosilicate glass scintillation vials	Fisher Scientific	03-337-4
1 mL all-plastic syringe	Thermo Scientific	S75101
Sepharose CL-6B	Sigma Aldrich	CL6B200
Liquid chromatography column	Sigma Aldrich	C4169
CIJ mixer, HDPE	Custom
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Hydrogen peroxide solution	Sigma Aldrich	216763
HEK-Blue hTLR4	InvivoGen	hkb-htlr4
RAW-Blue Cells	InvivoGen	raw-sp
QUANTI-Blue	InvivoGen	rep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Assays	Lonza	N183-125