JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ננו מספקות מנגנונים מגוונים של משלוח טיפולית מבוקרת מדע בסיסי ויישומים translational, אך ייצור שלהם לעתים קרובות דורשת מומחיות שאינו זמין במעבדות ביותר ביו. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור ייצור מדרגי של טעינת טיפוליות מגוונות nanocarriers התאספו עצמית באמצעות nanoprecipitation פלאש.

Abstract

ננו מציגים מגוון רחב של אפשרויות להתאמה אישית של מסירת מטענים מולקולרית יחיד ומשולבים ליישומים טיפוליים הדמיה מבוקרת. סגוליות מוגבר זה יכול להיות השלכות קליניות משמעותיות, כולל תופעות לוואי ירידה במינונים נמוכים עם מינון גבוה יותר. יתר על כן, בחיי עיר מיקוד אפנון מבוקר של תאים מסוים קבוצות משנה יכול לשפר את החקירות בתוך חוץ גופית ו ויוו התופעות ביולוגיים בסיסיים, לחקור את תפקוד התא. למרבה הצער, המומחיות הנדרשת בתחום הננומטרי המדע, כימיה, הנדסה לעיתים קרובות לאיסור מעבדות ללא ניסיון בתחומים אלה בדיית והתאמה של ננו-חומרים כלים החקירות שלהם או כלי הרכב שלהם אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור סינתזה ו הרכבה מדרגי של מערכת רב תכליתי רעיל בלוק קופולימר נוטה היווצרות נתיישב וטעינה של כלי רכב הננומטרי ביו יישומים. Nanoprecipitation פלאש מוצג מתודולוגיה להרכבת מהירה מגוונות nanocarriers מ- poly(ethylene glycol) -bl-copolymers פולי (פרופילן גופרתי). פרוטוקולים אלה לאפשר מעבדות עם מגוון רחב של מומחיות ומשאבים כדי בקלות, reproducibly הרכיבו מערכות nanocarrier מתקדמות על היישומים שלהם. תכנון וביצוע של כלי נגינה אוטומטיות המעסיקה משאבת מזרק במהירות גבוהה כדי להקל על nanoprecipitation פלאש את התהליך, כדי לאפשר שליטה משופרת על אחידות, גודל, מורפולוגיה הטעינה של polymersome nanocarriers הוא תיאר.

Introduction

Nanocarriers לאפשר למסירה מבוקרת של מטען קטן, macromolecular, כולל ישויות פעיל כזה, אם לא אנקפסולציה, יהיה מאוד מתכלה או גם הידרופוביות עבור ניהול ויוו. של מורפולוגיות nanocarrier באופן קבוע מפוברק, מקביל ליפוזומים (הנקראת גם polymersomes) פולימריים שלפוחית מציעים את היכולת לטעון בו-זמנית הידרופיליות, הידרופובי מטען1,2. למרות יתרונם מבטיח, polymersomes הם עדיין נדירים יישומים קליניים נובע, בין השאר, מספר אתגרים מרכזיים בייצור שלהם. לשימוש קליני, ניסוחים polymersome צריכים להיעשות בקבוצות בקנה מידה גדול, סטרילי, ועקבית.

מספר טכניקות יכולות לשמש polymersomes טופס של קופולימר diblock, כגון poly(ethylene glycol) -בלוק-פולי (פרופילן גופרתי) (פג -bl- PPS), זה כוללות נפיצה הממס3, סרט דק התייבשות1 , 4, 5,מיקרופלואידיקה6והידרציה ישירה7. פיזור החומר הממיס כרוך פעמים זמן דגירה בנוכחות ממיסים אורגניים, אשר ייתכן denature כמה מטענים ביו, כמו חלבונים. התייבשות סרט דק אינו מציע שליטה polydispersity של polymersomes בנוי, הדורשות לעיתים קרובות ההבלטה יקרים ולגזול הטכניקות להשגת monodispersity מקובל. יתר על כן, הן microfluids והן הידרציה ישירה קשים לקנה המידה עבור אחסון ייצור גדולים יותר. שיטות ייצור שונות nanocarrier, nanoprecipitation פלאש (FNP) מציע את היכולת לבצע ניסוחים בקנה מידה גדול, לשחזור8,9,10. בעוד FNP נשמרה בעבר ניסוח של חלקיקים מוצקים-core, המעבדה שלנו הרחיבה לאחרונה את השימוש FNP לכלול היווצרות עקבית של מגוון פג -bl- PPS ננו-מבנה מורפולוגיות11, 12, כולל polymersomes11 ו- bicontinuous nanospheres12. מצאנו כי FNP היה מסוגל להרכיב ניסוחים monodisperse של polymersomes ללא צורך שחול, וכתוצאה מכך שערכי האינדקס polydispersity מעולה בהשוואה ללא-extruded polymersomes שהוקמה על ידי פיזור התייבשות, הממס סרט דק 11. nanospheres Bicontinuous, עם תחומים הידרופובי גדול שלהם, לא יכלו להיווצר על ידי התייבשות סרט דק, למרות ויוצרים תחת מספר תנאים הממס עם FNP12.

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט לסינתזה של פג ה -bl- PPS diblock קופולימר משמש במבנה polymersome, מיקסר מטוסי (CIJ) impingement סגור המשמש FNP, FNP הפרוטוקול עצמו, ושל היישום של מערכת אוטומטית כדי להפחית את השתנות המשתמש. כלול מידע אודות אופן לחטא את מערכת מספיק כדי לייצר אנדוטוקסין ללא ניסוחים שימוש ויוו, נציג נתונים בדבר אפיון polymersomes הנוצרת על-ידי FNP. עם המידע הזה, הקוראים עם עניין ניצול polymersomes לעבודה במבחנה , ויוו יוכלו ליצור משלהם סטרילי, ניסוחים monodisperse. הקוראים עם ניסיון ניסוחים nanocarrier, עם מומחיות סינתזה פולימר יוכלו לבחון במהירות מערכות פולימר שלהם באמצעות FNP כחלופה אפשרית טכניקות ניסוח הנוכחי שלהם. בנוסף, הפרוטוקולים המתוארים במסמך זה עשוי לשמש ככלים חינוכיים על ניסוח של nanocarriers בקורסים מעבדות ננוטכנולוגיה.

Protocol

1. סינתזה של Poly(ethylene glycol) -בלוק-פולי (פרופילן גופרתי)-תיול

  1. לסנתז מתוקסי-poly(ethylene glycol) מסילייט (Mn: 750) (מיאו-יתד17-Ms, אני).
    1. להמיס 10 גרם של מיאו-יתד17-OH ב- 200 מ של 100% טולואן בתוך בקבוקון 3-צוואר עגול התחתון (RBF) תחת בחישה מגנטית-600 סל ד.
    2. להתחבר RBF 3-צוואר את מנגנון דין-שטרק, עצמה קשורה הקבל, לשמור את המערכת כולה תחת גז אינרטי, חנקן או ארגון.
    3. מקם את RBF 3-צוואר באמבט שמן, חום עד 165 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב במהירות של 600 סל ד.
    4. להסיר מעקב מים 100 מ של טולואן באמצעות זיקוק azeotropic.
    5. הסר את RBF 3-צוואר שמן לנתק את המנגנון דין-סטארק תוך שמירה על תנאי גז אינרטי, להתקרר לטמפרטורת החדר.
    6. להוסיף 5.6 מ של 100% triethylamine (הציוד טוחנת 3) ו- 300 מ של טולואן 100% נטול מים מיאו-יתד17-OH פתרון תוך כדי ערבוב במהירות של 600 סל ד.
    7. לעבור את RBF 3-צוואר אמבטיית קרח, לשמור על ערבוב ב 600 סל ד ו גז אינרטי תנאים.
    8. לדלל 3.1 מ ל 100% methanesulfonyl כלוריד (הציוד טוחנת 3) ב- 30 מ של 100% טולואן, להוסיף לאט RBF 3-צוואר ויה בנוסף המשפך תוך כדי ערבוב במהירות של 600 סל ד.
    9. מערבבים בין לילה ב 600 סל ד בטמפרטורת החדר בתנאים אינרטי.
    10. פתרון סינון באמצעות משפך בוכנר ארוז עם הארץ diatomaceous (ראה טבלה של חומרים) כדי להסיר מלחים.
    11. הסר טולואן ויה המאדה עם האמבטיה מים מוגדר כ- 40 ° C, סיבוב ב 120 סל ד, ו לחץ מוגדר בין 50-100 millibar.
    12. לפזר מחדש מוצר ב 200 מ של 100% דיכלורומתאן (DCM), לסנן דרך משפך בוכנר ארוז עם הארץ diatomaceous (ראה טבלה של חומרים).
    13. הסר DCM ויה המאדה עם האמבטיה מים מוגדר כ- 40 ° C, סיבוב ב 120 סל ד, ו לחץ מוגדר בין 450-600 millibar.
    14. במשורה לפזר מחדש במוצר ב- 100% DCM, לאט לזרז המוצר על-ידי הוספתו dropwise (באמצעות פיפטה פסטר) עד 500 מ"ל של דיאתיל אתר 100% קר כקרח. לשמור על ערבוב במהירות של 300 סל ד.
    15. Decant או האחות כדי להסיר דיאתיל אתר זירז את המוצר, מיאו-יתד17- מסילייט וחנות לינה desiccator ואקום להתייבש לגמרי.
    16. להשתמש במוצר מיד, או לשמור תחת גז אינרטי ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  2. לסנתז מתוקסי-poly(ethylene glycol) thioacetate (מיאו-יתד17-טה, II).
    1. להמיס 5 g של מיאו-יתד17-Ms (I) ב- 200 מ של 100% נטול מים dimethylformamide (DMF) ב- RBF 3-צוואר, מערבבים במהירות של 600 סל ד בטמפרטורת החדר תחת גז אינרטי.
    2. להוסיף 2.5 גר' 100% אשלגן פחמתי (הציוד טוחנת 3) לערבב פתרון.
      הערה: אשלגן פחמתי לא יימס לחלוטין בפתרון.
    3. לדלל מ 1.3 ל 100% חומצה thioacetic (הציוד טוחנת 3) ב- 100 מ של 100% DMF נטול מים, ולהוסיף dropwise פתרון ויה בנוסף המשפך.
      הערה: חומצה Thioacetic בעל ריח חזק, ריצו. חייבים להקפיד לשמור על כל האובייקטים המלוכלכים בתוך המנוע fume כימי בין לילה לפני סילוק או ניקוי.
    4. לבחוש נמרצות (סל ד 600 ומעלה) למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: היווצרות מלח יכול בקלות לשבש את ערבוב של פתרון זה. חייבים להקפיד לשמור על ערבוב בין לילה.
    5. פתרון סינון באמצעות משפך בוכנר ארוז עם הארץ diatomaceous (ראה טבלה של חומרים).
    6. הסר DMF ויה המאדה עם האמבטיה מים מוגדר כ- 60 ° C, סיבוב ב 120 סל ד, ו לחץ מוגדר בין 5-15 millibar.
    7. להמיס את המוצר ב- 100 מ של 100% tetrahydrofuran (THF) ולהוסיף עמודה גדוש אלומינה ניטראלי כדי להסיר זיהומים בצבע אדום/כתום.
    8. הסר THF ויה המאדה עם האמבטיה מים מוגדר כ- 40 ° C, סיבוב ב 120 סל ד, ו לחץ מוגדר בין 200-300 millibar.
    9. במשורה לפזר מחדש במוצר ב- 100% DCM. אם התמיסה מלח טפסים, פתרון סינון באמצעות 6 μm נקבובית גודל נייר סינון באמצעות משפך בוכנר.
    10. לאט לאט לזרז את המוצר על-ידי הוספת dropwise באמצעות פיפטה פסטר עד 500 מ"ל של קרח 100% דיאתיל אתר, נע במהירות של 300 סל ד. דיאתיל אתר ייתכן שתצטרך להיות עוד יותר מקורר ל-20 ° C במקפיא קילוואט במשך כמה שעות אם התמיסה אינה מוחצת מתוך פתרון ב 4 º C.
    11. Decant או האחות כדי להסיר דיאתיל אתר זירז את המוצר, מיאו-PEG17-Thioacetate. לאחסן מוצר ללון ב- desiccator ואקום, ולאחר מכן תחת גז אינרטי ב-20 ° C.
  3. לסנתז diblock קופולימר poly(ethylene glycol) -בלוק -poly(propylene sulfide)-תיול (פג17-bl- PPS35-SH, השלישי).
    1. להמיס מיאו-יתד17-טה (II) 10 מ"ל של 100% נטול מים DMF בתוך בקבוקון schlenk ב תחת ארגון, תוך כדי ערבוב במהירות של 400 סל ד באמבט מים בטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 1.1 eq מולרי של סודיום methoxide (פתרון 0.5 M במתנול), מאפשרים מערבבים במהירות של 400 סל ד למשך 5 דקות.
    3. להוסיף 35 eq טוחנת של 100% פרופילן גופרתי, במהירות, פתרון. אפשר להניע-400 סל ד ל-10 דקות.
    4. להוסיף 10 eq טוחנת של 100% חומצה אצטית קרחונית, מאפשרים מערבבים במהירות של 400 סל ד למשך 5 דקות.
    5. הסר DMF ויה המאדה עם האמבטיה מים מוגדר כ- 60 ° C, סיבוב ב 120 סל ד, ו לחץ מוגדר בין 5-15 millibar.
    6. לפזר מחדש מוצר במשורה ב 100% DCM, לזרז ב- 80 מ של 100% מתנול, פיצול בין שני צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ.
    7. צנטריפוגה צינורות חרוט ב 7500 g x 5 דקות ב 4 º C. תגובת שיקוע משם וביופסיה.
    8. מוצר בחנות, פג17-bl- PPS35-SH, לילה ב- desiccator ואקום, ולאחר מכן תחת גז אינרטי ב-20 ° C.

2. מרכיבים פג -bl -PPS Nanocarriers ויה Hand-Powered פלאש Nanoprecipitation

  1. (אופציונלי) לעקר את המיקסר מטוסי (CIJ) impingement חיכוכים.
    1. בתוך בטיחות ביולוגית cabinet (BSC), להטביע מיקסר עם כל החלקים לפרק בתוך 0.1 M NaOH בין לילה.
    2. מיקסר CIJ לכנס שוב, זרימת מים נטולי אנדוטוקסין באמצעות סכינים סטריליים-lock מזרקים.
    3. מבחן ה-pH של המים, ולהמשיך זורמים המים דרך עד pH האוגרים בתור נייטרלי.
  2. להמיס פג17-bl- PPS35-SH פולימר ומטענים הידרופובי שבשנות ה (impingement פתרון 1).
    1. שוקל 20 מ ג של פג17-bl- PPS35-SH לתוך צינור 1.5 מ ל.
    2. להוסיף צבעי הידרופובי (למשל,DiI, ICG), סמים (למשל,rapamycin) או מטענים אחרים.
      הערה: מטען עשוי להיות יבש, או מומס ב בתור ממיס miscible-מים, רצוי THF. אם המטען מסיס THF או DMF, מרכך מים-miscible אחר עשוי לשמש, אבל במשורה, הפולימר סביר להיות מסיסים. כמות המטען ניתן לטעון תלויה המאפיינים המטען עצמו (למשל, משקל מולקולרי, hydrophobicity, שיקולים הסטריים), ואני צריך להיחקר על11,--כל מקרה לגופו עם12.
    3. להוסיף 500 µL של 100% THF פולימר, מטענים, מערבולת נמרצות כדי להמיס.
  3. להמיס מטען הידרופילית במאגר מימית (impingement פתרון 2). בשביל זה, להמיס מטען הידרופילית ייטענו בתוך פולימר שלפוחית ב- 500 µL של מאגר מימית (למשל, באגירה פוספט מלוחים, טהור מים, וכו ') לפי הצורך.
  4. להוסיף מאגר למאגר.
    1. להוסיף 2.5 מ של מאגר מימית של בחירה (למשל, 1 x buffered פוספט תמיסת מלח) מאגר בגודל כראוי (למשל, בקבוקון נצנוץ של זכוכית 20 מ ל). מקום המאגר תחת מערבל CIJ כזאת זרימה החוצה מיקסר נכנס ישירות למאגר.
  5. לטעון impingement פתרונות לתוך מזרקים חד פעמיות מפלסטיק נפרד 1 מ"ל.
  6. פוגעים פתרונות נגד השני בו זמנית יוצרים nanostructures ולטעון אותם עם המנה.
    1. הכנס מזרקים נעל-סכינים סטריליים מתאמי בחלק העליון של המיקסר CIJ.
    2. בתנועה אחת חלקה, מהירה, נלחצים שני מזרקים בו-זמנית, ללא היסוס.
      הערה: אם מבצע מרובים impingements רציפים, קודם לאסוף יצוא במאגר ריק.
    3. (אופציונלי) לבצע impingements מרובים. פתרון nascent ננו-מבנה פיצול בין שני מזרקים, חזור על שלבים 2.6.1-2.6.2 עד 4 פעמים נוספות.
    4. לאסוף את יצוא בתוך המאגר מלא מאגר מימית המבושלות 2.4.1 ומערבבים בעדינות כדי להבטיח ערבוב.
  7. הסר לפרוק מטען הממס האורגני.
    1. (אפשרות 1) Dialyze nanocarrier ניסוח המאגר מימית באותו המשמש impingement, המאגר, באמצעות צינורות של MW המתאים הקיצוץ לפחות 24 שעות עם שינויי מאגר לפחות 2. זה יכול להתבצע בטמפרטורת החדר.
      הערה: Nanocarriers יישמרו על-ידי אבובים עם ניתוק MW < 100,000 kDa ואת פוטנציאלי עלול להיות נשמר על ידי המכנסונים גבוה גם כן. אפשרות זו שומרת על עקרות כאשר מבוצעת ב- BSC באמצעות מאגר סטרילי.
    2. (אפשרות 2) לסנן ניסוח באמצעות גודל הדרה או desalting/מאגר exchange עמודה (למשל, Sepharose 6B עמודה) באמצעות 1 x PBS כמו המאגר מימית.
      הערה: אפשרות זו שומרת על עקרות כאשר מבוצעת בתואר ראשון עם עמודה יש עברתי עיקור ביסודיות.
    3. (אופציה 3) הסר את הממס אורגניים נדיפים באמצעות ואקום לייבוש למשך הלילה.
    4. (אפשרות 4) לסנן ניסוח באמצעות מערכת סינון זרימת וצורניים באמצעות מסנן kDa 50-100 בספיקה 20-60 mL/min במשך 15 דקות עד שעה, תלוי משקל מולקולרי של המטען unencapsulated הטיהור משם (מטען גדול יותר יידרש זמן רב יותר).
  8. (אופציונלי) רכז ניסוח nanocarrier.
    1. (אפשרות 1) להתרכז באמצעות מערכת רכז ספין (למשל, ספין טורים MW הקיצוץ > 100,000), נהגו כפי שתואר על ידי היצרן.
      הערה: Nanocarriers ייתכן שתצטרך להיות resuspended בין מהדורות, עשוי לדרוש מספר מהדורות להתרכז עד לנפח הרצוי. ספין ריכוז עשויה להפחית את עקרות של ניסוחים nanocarrier.
    2. (אפשרות 2) להפחית את נפח באמצעות ואקום לייבוש.
      הערה: שינוי אמצעי שקשה לשלוט בתנאים אלה, יש לנקוט כדי לשמור על osmolarity לפני ואחרי ריכוז.
  9. חנות nanocarriers ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות עד חודשים. לפני השימוש, לאחר אחסון, בקצרה מערבולת nanocarrier ניסוחים.

3. לאפיין ניסוחים Nanocarrier

  1. למדוד נצילות ההטענה
    1. אם המטען פלורסנט או סופג בחריפות על אורך גל מסוים מחוץ 260-450 nm, למדוד קרינה פלואורסצנטית/ספיגת באמצעות של fluorimeter/ספקטרופוטומטרים.
      הערה: פג -bl- PPS סופג בתוקף מ- 260-310 ננומטר, ניסוחים polymersome לספוג מן 310-450 nm, אשר עלול לסבך את כימות של מטענים הסופגת ב אורך גל דומה.
    2. אם המטען סופג בטווח 260-450 nm הידרופיליות, לשבש פג -bl- PPS nanostructures על-ידי הוספת μL 25 של ניסוח אמצעי שווה של 1% H2O2 או 1% טריטון X-100, לאחר מכן להפריד ולהבחין מטענים פולימר ספיגת באמצעות ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) באמצעות אי-הכללה של גודל עמודה תואם מימית אנשים רגילים (למשל, עמודה 6B Sepharose) 11.
    3. אם המטען סופג בטווח 260-450 nm והוא מסיס THF או DMF, lyophilize ניסוח על ידי הקפאת μL 100 1.5 mL צינור פלסטיק ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ואז למקם את הצינור לתוך מיכל ואקום הזכוכית המקום על גבי איזה שהוא לופילייזר. אפשר 24 שעות lyophilization להתרחש, לאחר מכן מחדש להמיס 50 μL DMF או THF לפני הפרדה וזיהוי באמצעות HPLC.
  2. מדד nanocarrier הגודל של מורפולוגיה
    1. השתמש פיזור אור דינאמי (DLS)11 או nanoparticle מעקב ניתוח13 כדי למדוד את גודל nanocarrier.
      הערה: Nanocarriers נוצר פג17-bl- PPS35-SH צפויים יש קוטר ממוצע של בין 100-200 ננומטר, עם polydispersity אינדקס < 0.3.
    2. לקבוע מורפולוגיה nanocarrier באמצעות שידור קריוגני מיקרוסקופ אלקטרונים (cryoTEM)14.
      הערה: Nanocarriers נוצר פג17-bl- PPS35-SH צפויים להיות פולימר שלפוחית (polymersomes) עם ממברנה פולימרית (טרה) ניכרת בבירור, צורה כדורית במידה רבה.
  3. (אופציונלי) מבחן פורמולציות עבור אנדוטוקסין
    1. (אפשרות 1) שימוש assay מבוססת-תא לנוכחות של אנדוטוקסין, למשל, RAW תאים כחול או תאים TLR4 כחול HEK (ראה טבלה של חומרים), כפי שתואר על ידי יצרן, גם כמותיים או איכותיים assay עבור lipopolysaccharides (LPS)13 .
    2. (אפשרות 2) להשתמש ערכת assay15 Limulus Amebocyte Lysate (LAL), כפי שתואר על ידי היצרן.

4. ייצור של משאבת מזרק במהירות גבוהה עבור FNP

  1. לפברק רכיבי כלי מותאם אישית.
    הערה: דגמי תלת-ממד עבור עיבוד שבבי חלקים מותאמים אישית כל ניתנים חומרים משלימים.
    1. מכונת כלי רב שכבתית המארז ¾" גליונות אקרילי ולהרכיב (ראה הקבצים המשלימים 1-5).
      הערה: אקריליק יש עמידות כימית המסכן. אם המכשיר לשימוש עם ממיסים קשים, מכונת הבסיס של מתכת ייחשב מתאימים עבור היישום.
    2. חלקי הדפסה 3D עם מודפס עם פלסטיק polylactide (PLA).
      1. הדפס את המזרק גירוש (SE) 2-חלק המנגנון: SE חלק 1 - בלוק FNP אחורי מחזיק כרכרה (איור 5F, חלק אפור; הקבצים המשלימים 6) SE חלק 2 - מדריך גירוש הקדמי (איור 5F, החלק השחור; הקבצים המשלימים 7). לראות את 2 הקבצים המשלימים עבור תרשימים.
      2. להדפיס את הסוגריים המסולסלים חיישן אינפרא-אדום (איור 5I, תיבות שחורות; הקבצים המשלימים 8 ו-9).
      3. (אופציונלי) הדפס את הסוגר המסולסל משאבת מזרק כפול.
  2. הדקו כלי מארז שכבות יחד עם ברגים hex M5 ולהוסיף רגליות גומי לבסיס.
  3. קביעת תצורה של מחשב יחיד פנסיון עם מערכת ההפעלה גנו \ לינוקס Raspbian 8.0 (ג'סי) (מבוסס על לינוקס דביאן).
    הערה: תוכנה להפעלת המכשיר זמין על פי בקשה. כלי תוכנה קוד המקור זמין על פי בקשה. עם קבלת קבצים מכווצים, להוריד את כל יחסי התלות שצוין בקובץ ה-README. תוכנה זו כוללת ממשק משתמש גרפי פשוט המאפשר שליטה על פעולת כלי נגינה, כולל פרמטרים בסיסיים בניהול (מהירות מוטורית, כיוון, וכו '). מומלץ להרחיב על קוד המקור קיים ולהשתמש המודולים המותאמים אישית תוכנית שתפורה בניסויים שלהם. כל התוכנות נכתב באמצעות פיתון 2.7.12 ואינו תואם כעת פיתון 3. Rpi גבוהה, PicoBorgRev, kivy ומודולים עיבוד מקבילי מנוצלים. בקובץ ה-README מכיל מידע מפורט לגבי ברשיון הפצת התוכנה.
  4. התקן בגודל 24 V מוברש מנוע DC (איור 5A) והחלק דיוק (4.5 ׳׳ (114.3 מ מ) קו; בורג 1.27 מ מ עופרת) (איור 5C).
    הערה: מנוע V DC 24 המשמש כאן יש עם סל"דמקסימום, אנימקס, מומנט עומס מלא 4,252 סל ד, 4.83 A, ו- ~0.2 N * m, בהתאמה.
    1. (אופציונלי) המקום מרווח מתחת המנוע כדי לצנן את רטט במהלך המבצע.
      הערה: מומלץ כרית גומי עבה 2-3 מ מ נחתך כדי להתאים למידות הכרכרה מנוע של הבסיס כלי נגינה.
    2. טעינת השקופית דיוק לבסיס הכלי.
      1. הסר באופן זמני את רוד משורשרות.
      2. טעינת השקופית באמצעות שני #8-32 שטוח המכונה הברגים.
    3. מנוע DC הר לשקופית דיוק באמצעות צימוד אלומת בורג (1-1/4 פלייר אורך) המכיל "6/16" ו- "1/4 קוטר משעמם.
      הערה: תלוי בעובי של אקריליק נהגה מכונת הרבדים בסיס כלי נגינה, שימסים עשוי להיות נחוץ כדי רמה המוטות מנוע והשקופית מדייקת.
  5. להרכיב גירוש פלטפורמה של לוחות מתכת על השיניים פינה בצורת L (איור 5D). הר מתכת בסיס הפלטפורמה לפלטפורמת הזזה (מחובר עם רוד משורשרות) באמצעות הברגים #6-32. לראות את הדיוק מפרטים טכניים של שקופיות שסיפק יצרן לפרטים בנוגע האילוצים הרכבה.
  6. להרכיב מזרק גירוש הגדרת המערכת.
    1. צרף העבורת הכרית בלוקים (פלטפורמות התקנה + מיסב תנועה ליניארי) על גבי M8 בציפוי כרום מפלדת מסילות (הפסים פלדה במקביל ניתן בקלות לראות באיור5).
    2. מסילות חוט דרך פיר ליניארי מדריך/תמיכה ונעל מסילות. השתמש שלושה מדריכים לפס. הר SE חלקים 1 ו- 2 על גבי הכרית הבלוקים באמצעות ברגים במכונה M4.
    3. ברפיון להצטרף SE חלקים 1 ו-2 עם ברגים hex M8. להגדיר את החלל שבין חלק SE 1 ו- 2 עם דחיסה לוליינית מעיינות כיסוי כל בורג המאובטחות בין שני פנימה מול ניילון תותבים (ראה איור 5F). הר תוחבים האלה בצד החיצוני של SE חלק 1 ו- SE חלק 2.
  7. תיל במעגל (ראה איור 6 עבור הדיאגרמה חיווט הליבה)
    1. התחברות של בקר מנוע I2C/SDA, 3.3 V, ועל GND פינס המחשב לוח יחיד.
    2. להתחבר מסופי מנוע DC M - ו M + בלוקים של הלוח בקר מנוע. להתחבר 24 V, אספקת החשמל 2.5 A (איור 5B) אבני V + ו- GND של הבקר מוטוריים (הבקר הוא עטוף בתוך קופסה אלקטרוניקה פשוטה בעיצוב הסופי, ראה איור 5 H).
    3. להתחבר 3V3, 5V הפינים של הלוח המוטורי הפינים המתאימים במחשב לוח יחיד. התחבר SDA ואת SCL סיכות של בקר מנוע לפינים 3 ו- 5 של מחשב לוח אחד, בהתאמה.
      הערה: פקודות מונפקים כדי מנוע DC ממחשב הלוח יחיד דרך בקר מנוע. מהירות מנוע נשלטת על ידי ויסות המתח על פני המסופים מוטוריים דרך אפנון רוחב פולס. בהגדרת הזה, המרבי הנוכחי פועל באמצעות מנוע V DC 24 (עומס מלא עוצמת הזרם: 4.83 A) מוגבל ל- 2.5 A על ידי אספקת כוח V 24 שעות ביממה. מומלץ כי המעגל מנוע מחובר דרך סגור בדרך כלל (NC) חירום עצירה (איור 5J). בכך מספק אמצעים כדי לשבש את המעגל מנוע כדי לאפשר את פעולת כיבוי חירום בסיסי.
    4. חבר חזית וחיישנים אחורי קרבה אינפרא-אדום (חיישני מרחק דיגיטלי, איור 5I) RPi GPIO פינס 24, 23, בהתאמה.
      1. מסלול חיווט חיישן בצנרת בבסיס המכשיר.
        הערה: חיישני אינפרא-אדום הם ללא מגע הפסקה-קרן חיישני תנועה עם טווח גילוי של 2-10 ס מ.
      2. 4.7.4.2 להצמיד את חיישני אינפרא-אדום קווי לתוך סוגריים מסולסלים מודפס 3D חיישן אינפרא-אדום (איור 5I, תיבות שחורות) והר על גבי הבסיס כלי נגינה. מתי כראוי הממוקם בתוך הסוגר המסולסל, הפנים חיישן צריך בולטות מסובבת כלפי חוץ מ 14 מ"מ x 7 מ"מ מלבני בפתיחת הסוגר.
        הערה: הגשרים חיישן הללו יכול להיות זמני מותקן באמצעות Velcro או דבק (זמני הרכבה זו שימושית לכוונן ולמטב השמה חיישן IR כראוי). לחלופין, לצמיתות הר על ידי קידוח חורים מדריך קטן בבסיס המכשיר ואבטחת הסוגריים המסולסלים עם ברגים M2.
    5. להתחבר צג מסך מגע LCD בגודל 7" 5V, GND, ולהציג סיכות ממשק טורי (DSI) של מחשב הלוח יחיד. 7" RPi וה -LCD להציג הרכבה מוצג באיור 5G.

5. לפברק Polymersomes ויה FNP באמצעות המשאבה מזרק מהיר בהזמנה אישית

  1. (אפשרות 1) השתמש במצב אוטומטי לרוץ.
    1. בחר אוטומטית להפעיל מהתפריט הראשי. המערכת תנחה משתמשים כדי לאפשר את המנוע מקם באופן אוטומטי את הפלטפורמה גירוש מזרק להתחלה של השקופית דיוק. ודא כי הנתיב בחזית ומאחורי את לוחית המתכת ברורה לפני שתמשיך.
    2. לטעון 1 מ"ל מזרקים מפלסטיק כמפורט בסעיף 2.5 ומזרקים הר על גבי המחברים סכינים סטריליים הנשי של מיקסר CIJ. לטעון CIJ מיקסר (עם מזרקים מצורף) לתוך הפתח המלבני של הכרכרה גירוש האחורי (ראה איור 5E).
    3. להגדיר את מהירות המנוע הרצוי (יחידות: סל ד) באמצעות המחוון ב- GUI (ראה הערה להלן שיקולים חשובים). מהירות מנוע אופטימליים יהיה תלוי על משאבת ספציפיים ועל ההתקנה אבל עליך להבטיח קצב זרימה של פחות 1 mL/s עבור CIJ מידות ערוץ מערבל שסופק כאן.
      הערה: שקול את הנקודות הבאות בעת הגדרת קצב הזרימה. בתצורה אנכיים המופעל ביד FNP, המגיבים מגורשים מן תארגן את הדברים בקצב של ~ 1 mL/s, אבל יכול להיות משתנה מאוד כאשר ידניות. . זה פשוט קצב הזרימה דרך הקנה מזרק, שנשלטת על ידי הקצב שבו המשתמש מקדמות על הבוכנה מזרק... שימו לב: שיעור 1 mL/s הוא לא מתייחס קצב הזרימה יציאה מן הצינור קוטר קטן יותר. ב לעיל צוין ערוץ מידות, ~ 1 mL/s שיש לקיים כדי להבטיח המספר של וריינולד המתאים עבור ערבוב הסוערים10. המחירים זרימה שונים יכול לשמש כל עוד הקוטר ערוץ מותאמת בהתאם כדי לשמור על המספר של וריינולד התומך תנאים הסוערים. בוכנות המזרק מתקדמים על ידי פלטה ממתכת בניצב, אשר מהלכים לאורך מגלשת אלומיניום ברמת דיוק גבוהה מצמידים 24 V מוברש מנוע DC. בתצורה זו, קצב הזרימה חבית המרבי מושפעת על ידי מספר גורמים, כולל (1) המנוע המהירות המרבית (4,252 סל ד) ואת ההפניה בורג של דיוק לשקופית (1.27 מ מ) זה משולב מנוע שאפט (2) מומנט המנוע (~0.2 N * m של מלא-l oad מקפיא), אשר יש צורך להתגבר על ההתנגדות זרימת תרומות לחץ אחורי (3) של נוזל כניסתו ויציאה של המיקסר CIJ ו- (4) כוחו של מזרקים שימוש (משתמשים צריך להיות קשובה של הכוחות הפועלים על תארגן את הדברים ולהשתמש מזרקים של חוזק המתאים). לגבי הנקודה (2), כאשר הגדלת זרימת מומנט מספיק קצב נדרש להימנע השתהות המנוע תוך שמירה על גירוש קבוע תחת הגדלת לחץ אחורי. המחירים זרימה חבית – כדי להדגים את זרימת חבית לדרג כי המערכת הנ ל ניתן להשיג, במקרה שבו FNP מתבצע באמצעות שני המגיבים נטען לתוך שני מזרקים אחד-מילימטר. כדי להשיג את זרם mL/s 1 שיעור דרך הקנה, המנוע חייב לקדם את לוחית המתכת מה המרחק שהוגדרו על-ידי האורך הבוכנה (~ 68 מ מ עבור מזרק mL אחד טיפוסי) בשנייה אחת. בתנאי שההפניה בורג 1.27 מ מ של השקופית דיוק, המסקנה היא כי מנוע DC פועל ב 4,252 rpm הוא מסוגל לקדם את הפלטפורמה עד ~ 90 מ מ/s (rev 71/s * 1.27 מ מ/rev). זה תואם את קצב זרימה חבית של ~1.3 מ ל/s, אשר חורג את קצב המטרה של mL/s 1.
    4. לפני הפעלת הכלי, בדוק את מערכת כדי להבטיח הנתיב של פלטפורמת נקיה ממכשולים, וכי גלאי קירבה IR מלפנים ומאחור ברורים ומדרכי (חיישני אינפרא-אדום הם קופסאות שחורות קטנות ליד השקופית דיוק מסופי; ראה איור 5I). גם להבטיח כי שקע צינורות קפילר מיקסר CIJ מנותבת לתוך מיכל איסוף המתאים (לשעבר: זכוכית הספל, וכו ').
    5. לגרש את המגיבים של המזרקים, ערבול CIJ, הקש על לחצן הפעל ממשק התוכנה.
  2. (אפשרות 2) השתמש במצב הפעלה ידנית. עיין בהוראות הפעלת מצב אוטומטי לעיל ורשום את השינוי הבא לשלב 5.1.5: לחץ על לחצן הבא ללא הרף דרך סיום המרוץ (קרי, פלטפורמת מקדמות בתגובה לאירוע על-לחץ, המנוע יפסיקו בתגובה לאירוע על שחרור).
  3. (אופציה 3) להשתמש בפלטפורמת ידנית מיקום מצב; מצב זה מאפשר למשתמשים למקם את הפלטפורמה על-ידי הפעלת המנוע במהירות נמוכה (20% כוח) בתגובה הלחצנים ואחורה על ממשק התוכנה.

תוצאות

. הנה, הוצגו פרוטוקול פשוט על ניסוח של nanocarriers מסוגל להעמיס מטען הידרופיליות, הידרופובי הבטוחים ויוו העכבר, אנושיות הפרימטים המינהל11,13. כללנו גם פרוטוקול מפורט לסינתזה של הפולימר בשימוש התוצאות נציג שלנו, יחד עם תיאור להרכבת מכשיר מותא...

Discussion

סיפקנו הנחיות מפורטות הזיוף מהירה של polymersomes באמצעות PEG17-bl- PPS35-SH כמו קופולימר diblock. Vesicular polymersomes הם המורפולוגיה צבירה ראשוני שהתאסף באתר היחס הזה של פג הידרופיליות, משקל מולקולרי של בלוק PPS הידרופובי. כאשר impinged מספר פעמים, יש להם קוטר ויצרו polydispersity שמתאים polymersomes extruded דרך קרום...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

אנו להכיר צוות ומכשור לתמוך מהמתקן ביולוגיה מבנית באוניברסיטת נורת'ווסטרן. התמיכה של ר. ה לוריא מקיף סרטן מרכז של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, אוניברסיטת נורת'ווסטרן המתקנים מבניים ביולוגיה הוא הודה. גלאי אלקטרונים ישירה Gatan K2 נרכש בכספים המסופקים על ידי האיחוד ביו שיקגו עם תמיכה מקרנות סרל ב שיקגו הקהילה הקרן. אנו מודים גם את המתקנים הבאים באוניברסיטת נורת'ווסטרן: המתקן המדע קק השטח בין-תחומית, המתקן ביולוגיה מבנית, המתקן הביולוגי הדמיה, המרכז המתקדם הדמיה מולקולרית ו האנליטי של Bionanotechnology ציוד הליבה. מחקר זה נתמך על ידי המענק הלאומית למדע 1453576, מוסדות לאומיים של בריאות מנהל חדש חדשן פרס 1DP2HL132390-01, מרכז פרס Catalyst ננו-רפואה רגנרטיבית ופרס זרז מקורמיק 2014. SDA נתמך בחלקה על ידי NIH ביוטכנולוגיה predoctoral אימונים גראנט T32GM008449.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm DiameterAdafruit1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, MetricVXBkit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm DiameterAdafruit1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacityMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motorIron HorseMTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD DisplayRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal TorqueRulandPSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl etherSigma Aldrich202495
Methanesulfonyl chlorideSigma Aldrich471259
TolueneSigma Aldrich179418
Toluene, AnhydrousSigma Aldrich244511
TriethylamineSigma AldrichT0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth)Sigma Aldrich419931
DichloromethaneSigma Aldrich320269
Diethyl etherSigma Aldrich296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrousSigma Aldrich227056
Potassium carbonateSigma Aldrich791776
Thioacetic acidSigma AldrichT30805
TetrahydrofuranSigma Aldrich360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann ISigma Aldrich199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanolSigma Aldrich403067
Propylene sulfideSigma AldrichP53209
Acetic acidSigma AldrichA6283
MethanolSigma Aldrich320390
Sodium hydroxide solution 1.0 NSigma AldrichS2770
Endotoxin-free waterGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Paper pH stripsFisher Scientific13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
Borosilicate glass scintillation vialsFisher Scientific03-337-4
1 mL all-plastic syringeThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Liquid chromatography columnSigma AldrichC4169
CIJ mixer, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Hydrogen peroxide solutionSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL AssaysLonzaN183-125

References

  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138nanomaterialnanocarrierbiomaterialnanoprecipitation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved