قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Summary

يصف لنا استخراج معدلة على نطاق ضيق وفحوصات اللونية لاكتات وبيروفات في ديدان أسطوانية C. ايليجانس. عند استخدام أدوات التحليل التجاري، المهم التطور التقني الحساسية والدقة. ترسيب البروتين في استخراج هي الخطوة الأكثر أهمية لتحديد الكمية من نواتج الأيض داخل الخلايا.

Abstract

لاكتات وبيروفات وسيطة رئيسية للطاقة داخل الخلايا الأيضية. رصد نسبة لاكتات/بيروفات في الخلايا يساعد على تحديد ما إذا كان هناك اختلال في الأيض الطاقة المرتبطة بالسن بين المتقدرية الفسفرة وتحلل الهوائية. هنا، علينا أن نبدي الاستفادة مجموعات تجارية مقايسة اللونية لاكتات وبيروفات في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. في الآونة الأخيرة، بحساسية ودقة من أطقم مقايسة اللونية/فلوريميتريك قد تحسنت إلى حد كبير بالبحث والتطوير التي تقوم بها الشركات المصنعة للكاشف. ومكنت الكواشف تحسين استخدام فحوصات صغيرة الحجم مع لوحة 96-جيدا في C. ايليجانس. بشكل عام، الإنزيم فلوريميتريك متفوقة في مجال التوعية مقايسة اللونية؛ ومع ذلك، نهج قياس الألوان أكثر مناسبة للاستخدام في المختبرات المشتركة. مسألة هامة أخرى في هذه الاختبارات لتحديد الكمية ترسيب البروتين المتجانس C. ايليجانس العينات. في أسلوبنا ترسيب البروتين، بريسيبيتانتس مشتركة (مثلاً.، حمض التريكلوروسيتيك، وحمض بيرتشلوريك وحمض ميتافوسفوريك) وتستخدم لإعداد نموذج. بإضافة مباشرة مرسب الباردة (تركيز النهائي 5%) خلال التجانس بإعداد عينة فحص خالية من البروتين.

Introduction

تركيزات لاكتات وبيروفات تعتبر على نطاق واسع كوسيطة استقلاب الطاقة، وهي تتصل بالدول من تحلل، ودورة حمض تريكاربوكسيليتش (TCA)، وسلسلة نقل الإلكترون في خلايا الكائنات الحية الهوائية. سلسلة من ردود الفعل في تحلل أكسدة الجلوكوز إلى بيروفات، التي تقع في مفترق طرق الأيض ويمكن تحويلها إلى الكربوهيدرات عن طريق جلوكونيوجينيسيس، الأحماض الدهنية والايض الطاقة عن طريق البيروفات، والأنين من الأحماض الأمينية. دورة TCA يحدث تحت وجود الأوكسجين الذائب كافية، وهو أمر أساسي لتحويل الجلوكوز إلى طاقة. خاصة، هو تغيير الأيض الثانوية ظاهرة مثيرة لاهتمام التي تحلل يستخدم أساسا لإنتاج الطاقة والتنفس المتقدرية الهوائية، والذي يتضمن بدوره TCA وسلسلة نقل الإلكترون، دوونريجولاتيد في الثدييات سرطان الخلايا^1،2. وأظهرت لنا مؤخرا أن مستويات اللاكتات ونسبة ما يترتب عليها من لاكتات/بيروفات (L/P) انخفض خلال الشيخوخة في الكائن الحي النموذجي ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس). وبالمثل، وجدنا أن القامع الورم الثدييات أورثولوج p53 المجلس الانتخابي المؤقت-1 في C. ايليجانس دوراً هاما في التعديلات المتعلقة بالسن في استقلاب الطاقة من خلال تفعيل أهداف النسخي³.

في فحوصات بيولوجية، مثل قياس تركيزات لاكتات وبيروفات في الخلايا، والحساسية، ودقة وحجم العينة، ووقت الحضانة لمجموعات مقايسة اللونية/فلوريميتريك قد تحسنت جذريا. ونظرا للابتكارات التكنولوجية، ونحن الآن قادرة على تحليل مختلف نواتج الأيض ونواتج الأيض الوسيطة دون ثقافة واسعة النطاق من C. ايليجانس، هو أمر صعب نظراً لصغر حجمه. وبصفة عامة، حساسية مقايسة اللونية أمر من حجم أصغر من أن الإنزيم فلوريميتريك؛ بيد أن النهج اللونية أكثر ملاءمة في الإعداد لمختبرات مشتركة. وعلاوة على ذلك، أسلوب استخراج تتضمن ترسيب البروتين وتجانس حاسمة لتحديد كمية تركيزات لاكتات وبيروفات في الخلايا C. ايليجانس نظراً لديدان أسطوانية هذا مضمن في الهيكل الخارجي ودعا بشرة، خلافا لخلايا الثدييات خطوط^4،5. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل تركيزات لاكتات وبيروفات باستخدام مجموعات مقايسة اللونية التجارية بما في ذلك النصائح لاستخراج عينة من C. ايليجانس.

Protocol

1-تزامن ثقافة C. ايليجانس

1. قبل البذر، سلالة الثقافة الإشريكيّة القولونية (كولاي) OP50 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 300 مل مرق لوريا بيرتاني (رطل) متوسطة السائل. متجر OP50 مثقف-4 درجة مئوية.
   1. جعل رطل مرق المتوسطة السائل، استخدام 10 جرام تريبتوني، 5 غ خميرة استخراج، 10 غم من كلوريد الصوديوم و 1.5 مل من 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وإضافة إلى 1 لتر مع المياه. اﻷوتوكﻻف.
      ملاحظة: تتوفر سلالات OP50 و C. ايليجانس من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (جامعة مينيسوتا، سانت بول، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية).
2. جعل نمو السلكية أجار المتوسطة (NGM)، استخدام الجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم 2.5 g من ببتون، ز 17 من أجار ومل 975 من المياه. اﻷوتوكﻻف. كول إلى 55 درجة مئوية، ثم ستيريليلي إضافة، في الترتيب، 1 مل 1 م MgSO₄، 1 مل كاكل 1 م₂، 1 مل 5 ملغ/مل الكولسترول في EtOH، و 25 مل من م 1 البوتاسيوم الفوسفات pH 6.0 في 90-أطباق بيتري ملم.
   1. م 1 فوسفات البوتاسيوم pH 6.0، استخدم 108.3 ز خ₂ص₄ و 46.6 ز ك₂مكتب البراءات الهنغاري₄، وإضافة المياه. 1 اﻷوتوكﻻف ل.⁶.
3. 1-2 مل OP50 المستزرعة على لوحات أجار NGM تنتشر. جعل طبقة رقيقة من OP50، احتضان لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة أي الديدان الخيطية.
   ملاحظة: NGM أجار لوحات OP50 الملقحين يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع.
4. أضف الديدان على الأقل 100 على صفيحة أجار NGM مع OP50، والثقافة في 20 درجة مئوية حتى مرحلة الكبار. مطلوبة على الأقل ثلاث لوحات.
5. جمع البيض في الرحمونقل جرابيد المنحرفين من ثلاثة NGM أجار لوحات كل مع 5 مل من المخزن المؤقت S في أنبوب مخروطي 15 مل، وتغسل الديدان 3 مرات مع 15 مل من المخزن المؤقت S باستخدام الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
   1. لجعل المخزن المؤقت S، استخدم 5.9 غرام من كلوريد الصوديوم و 50 مل من م 1 البوتاسيوم الفوسفات pH 6.0، إضافة إلى 1 لتر مع المياه. اﻷوتوكﻻف⁶.
6. حل الديدان في حلاً تحت كلوريت قلوية أكسينيزيشن وعزل البيض بالجملة (0.5 مل من التبييض الطازجة أو ما يعادلها: هيبوكلوريت الصوديوم 5-6%، 0.1 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم، حوالي 4.5 مل من المخزن المؤقت S)⁶، والوقوف الحل لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاختلاط بعكس.
   ملاحظة: خلال 15 دقيقة، الديدان الكبار ينبغي أن يحل، ترك حل ضبابي من البيض المحررة من جثث بهم (البيض المحررة ينبغي تأكيد استخدام مجهر مجسم). بدلاً من 0.1 مل من هيدروكسيد الصوديوم ن 10، يمكن أيضا استخدام 0.2 مل من هيدروكسيد الصوديوم N 5.
7. وبعد العلاج تحت كلوريت، يغسل بيليه البيض 3 مرات مع 15 مل من المخزن المؤقت S، وريسوسبيند في 5-6 مل من المخزن المؤقت S. تفقس البيض تم إصدارها خلال حضانة بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية في المخزن المؤقت S دون كولاي لثقافة عصر متزامن ليرقات المرحلة L1.
8. لتحديد العدد التقريبي ليرقات المرحلة L1، تعول الديدان باستخدام مجهر مجسم في 10 ميليلتر من المخزن المؤقت S بعد ريسوسبيندينج اليرقات 3 مرات على الأقل، وحساب المتوسط. ثم نقل اليرقات المرحلة L1 إلى خمس لوحات أجار NGM مع OP50 (الديدان 1,500-3,000 كل لوحة باستخدام طبق بيتري 90 ملم)، والثقافة في 20 درجة مئوية إلى حين نمت إلى مرحلة الكبار الصغار، وعندما يبدأ الإخصاب ويتم وضع عدد قليل من البيض (عادة بعد 3 د آيس).

2-استخراج "جزء الخلوية" من C. ايليجانس

1. جمع الشباب مرحلة الكبار (عمره 5 أيام الحيوانات) الديدان من خمس لوحات أجار NGM مع المخزن المؤقت S (الشكل 1A).
   1. لتحديد الديدان الحية فقط استخدام الأسلوب السكروز⁶ للتعويم في محلول السكروز 30% (w/v)، مزيج من الديدان قد علقت في 3-4 مل من المخزن المؤقت S مع حجم متساوية من المثلج السكروز 60% (w/v) في أنبوب مخروطي 15 مل. تدور الأنبوب في س 1,500 ز لمدة 15 ثانية في 4 درجات مئوية وإزالة العائمة الديدان في أنبوب جديد بنقلها قبالة جدار الأنبوبة مع ماصة باستور.
2. أغسل الديدان 3 مرات مع المخزن المؤقت S باستخدام الطرد المركزي في س 1,500 ز لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية. فحص وحدة التخزين الرطب من الديدان غسلها بعد الطرد المركزي باستخدام تلميح ميكروبيبيتي 1,000 ميليلتر (الشكل 1B).
3. إضافة الديدان غسلها على حجم متساوية من حمض التريكلوروسيتيك 10% (w/v) المثلج (كلورفورم الميثيل؛ والتركيز النهائي من 5 في المائة) لترسيب البروتين (الشكل 1). بدلاً من كلورفورم الميثيل، يمكن استخدام حمض ميتافوسفوريك أو حمض بيرتشلوريك (PCA).
4. مجانسة الديدان مع مرسب استخدام 40 ضربات المدقة في الخالطون تفلون (طاحونة الأنسجة بوتر-ألفهيم) مع دوران يصل إلى 1,300 لفة في الدقيقة على الجليد.
5. نقل هوموجيناتي في microtube 1.5 مل طازجة مع ماصة باستور، و sonicate باستخدام الخالطون الموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقيقة (3 مرات من 1 دقيقة) مع دورة عمل 20% على الجليد.
6. توضيح هوموجيناتي بالطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تحييد supernatants مع 4 م كوه (حجم 0.25% 10 TCA) لمدة 20 دقيقة على الجليد، وأجهزة الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين المادة طافية (كعينة اختبار) في-80 درجة مئوية حتى الاختبارات التالية.

3-لاكتات الفحص باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية

1. قياس تركيز لاكتات في عينات الاختبار باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية (جدول المواد). القيام بفحوصات المزدوجة لعينات الاختبار. إضافة 5 أو 10 ميليلتر من عينات الاختبار لصفيحة 96-جيدا، وضبط حجم الصوت إلى 50 ميليلتر الواحدة وكذلك مع "اكتات الإنزيم المخزن المؤقت" المقدمة مع عدة.
2. للمنحنى المعياري لاكتات، تمييع 100 مم L (+)-"لاكتات القياسية" إلى 1 ملم مع "المخزن المؤقت للمقايسة لاكتات". أضف 0، 2، 4، 6 و 8 و 10 ميليلتر مم 1 L (+)-"لاكتات القياسية"، التي يتم توفيرها مع هذه المجموعة، إلى سلسلة من الآبار.
3. إضافة 50 ميليلتر من مزيج التفاعل (التي تحتوي على 46:2:2 "لاكتات المخزن المؤقت المقايسة" ومزيج إنزيم لاكتات لاكتات التحقيق في [دمس]، لا مائي؛ وترد جميع الكواشف مع عدة) أو مزيج التحكم الخلفية (التي تحتوي على 48:2 "لاكتات المخزن المؤقت المقايسة" ولاكتات Probe) في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة بينما تتم حماية العينات من الضوء.
4. قياس امتصاص لكل بئر في 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية وطرح امتصاص مزيج التحكم الخلفية من امتصاص هذا المزيج الرد.
5. ارسم المنحنى القياسي لاكتات. حساب تركيزات لاكتات عينات الاختبار من المنحنى المعياري لاكتات.

4-بيروفات الفحص باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية

1. قياس تركيز بيروفات في supernatants (عينات الاختبار) باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية (جدول المواد). القيام بفحوصات المزدوجة لعينات الاختبار. إضافة 10 ميليلتر من عينات الاختبار وميليلتر 90 من "الكاشف العامل" (التي تحتوي على 94:1 "ميكس الإنزيم" و "كاشف صبغ"، التي يتم توفيرها مع عدة) في لوحة 96-جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بينما تتم حماية العينات من الضوء.
2. قياس امتصاص لكل بئر في 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
3. ارسم المنحنى القياسي بيروفات. حساب تركيزات بيروفات عينات الاختبار من المنحنى المعياري بيروفات.

5-البروتين المقايسة للتطبيع مع محتوى البروتين

1. قياس تركيز البروتين في supernatants (عينات الاختبار) باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية (جدول المواد). بيد أن هذه الخطوة لا يقتصر على وضع مجموعة من أدوات تحليل، ونهج أخرى يمكن أن تستخدم لقياس تركيز البروتين.
2. تطبيع قيم تركيزات لاكتات وبيروفات بين عينات الاختبار باستخدام كل تركيز البروتين الكلي.
   ملاحظة: تركيز البروتين في عينات الاختبار هو الكشف بما فيه الكفاية حتى بعد ترسيب البروتين ويستخدم لخطوة التطبيع بين العينات.

النتائج

استخدام الاختبارات اللونية لتحديد كمية تركيزات لاكتات وبيروفات، أظهرنا دقة هذه الاختبارات مقارنة بالتقارير السابقة في^7، ايليجانس جيم-⁸. هنا، كانت عملية ترسيب البروتين أثناء استخراج عينة أن الخطوة الأكثر أهمية لتوليد قيم صحيحة. لترس?...

Discussion

عند استخدام هذه المجموعات اللونية المقايسة، الخطوة الأكثر أهمية في استخراج عينة للكشف عن لاكتات الخلوية وبيروفات بدقة في C. ايليجانس هي عملية ترسيب البروتين خلال التجانس (الشكل 1). ليس من الضرورة القصوى لاستخدام الخالطون تفلون، كسائر أجهزة المجانسة (مثلاً.، دونس ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton