ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Summary

נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.

Abstract

לקטט פירובט intermediates מפתח של מסלולים מטבוליים אנרגיה תאיים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. פיקוח על היחס לקטאט/פירובט בתאים מסייעת כדי לקבוע אם קיים חוסר איזון בחילוף החומרים האנרגיה הקשורות לגיל בין זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי גליקוליזה אירובי. כאן, אנו מראים את הניצול של ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי ו לקטט פירובט באורגניזם מודל C. elegans. לאחרונה, הרגישות והדיוק של ערכות ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay שופרו במידה רבה על ידי מחקר ופיתוח בניצוחו של ריאגנט יצרנים. ריאגנטים משופרת אפשרו את השימוש מבחני בקנה מידה קטן עם צלחת 96-ובכן C. elegans. באופן כללי, וזמינותו fluorimetric עדיפה על רגישות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאים יותר לשימוש במעבדות נפוצות. בעיה חשובה נוספת ב אלה מבחני לקביעת כמותית היא חלבון משקעים של הומוגני C. elegans דגימות. בשיטה שלנו חלבון משקעים, precipitants משותף (למשל., חומצת חומץ טריכלור, חומצה על-כלורית, חומצה metaphosphoric) משמשים עבור הכנת הדוגמא. מדגם assay נטול חלבון מוגש על-ידי הוספת ישירות קר precipitant (ריכוז הסופי של 5%) במהלך המגון.

Introduction

ריכוז ו לקטט פירובט נחשבים נרחב intermediates של חילוף החומרים האנרגיה, קשורים לארצות הברית גליקוליזה, חומצה tricarboxylic (TCA) מחזור ו תחבורה אלקטרונים בשרשרת בתאים של אורגניזמים אירוביים. סדרה של תגובות בגליקוליזה נישחק גלוקוז כדי פירובט, אשר שוכנת בצומת דרכים מטבולית, ניתן להמיר פחמימות באמצעות גלוקונאוגנזה, חומצות שומן, חילוף החומרים האנרגיה באמצעות אצטיל קואנזים a, את אלנין חומצה אמינית. מחזור TCA מתרחשת תחת הנוכחות של מספיק חמצן מומס, והוא היסוד עבור ההמרה של גלוקוז לאנרגיה. במיוחד, משינוי של חילוף חומרים משני הוא תופעה מעניינת שבה גליקוליזה משמשת בעיקר לייצור אנרגיה והוא אירובי נשימה מיטוכונדריאלי, אשר מערבת את מחזור TCA ושרשרת אלקטרון תחבורה, downregulated סרטן בתרבית של תאי^1,2. הראנו לאחרונה את רמת חומצת החלב ואת היחס הסוגר לקטאט/פירובט (L/P) ירד במהלך ההזדקנות באורגניזם מודל Caenorhabditis elegans (C. elegans). כמו כן, מצאנו כי גידול בתרבית של משתיק קול p53 ortholog CEP-1 C . elegans יש תפקיד חשוב בהתיקונים הקשורות לגיל של חילוף החומרים האנרגיה דרך ההפעלה של מטרות תעתיק³.

במבחני ביולוגיים, כגון מדידת ריכוזים ו לקטט פירובט בתאים, הרגישות דיוק, גודל המדגם, זמן הדגירה של ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay ערכות שופרו באופן דרמטי. בשל חידושים טכנולוגיים, עתה אנו מסוגלים לנתח מטבוליטים שונים של מטבוליטים ביניים ללא תרבות בקנה מידה גדול של C. elegans, אשר קשה בהתחשב גודלו הקטן. באופן כללי, הרגישות של וזמינותו ערכי צבע מוחלטים היא בסדר גודל קטן יותר מזה של וזמינותו fluorimetric; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאימה יותר בסביבה של מעבדות נפוצות. יתר על כן, שיטת החילוץ המכילה משקעים המגון וחלבון הוא קריטי עבור קביעת כמותית של ריכוזים ו לקטט פירובט בתאי C. elegans כי תחום זה תולעים נימיות שלד חיצוני קרא את הקוטיקולה, בניגוד בתרבית של תאים בתרבית קווים^4,5. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לנתח ריכוזים ו לקטט פירובט באמצעות ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי הכולל טיפים להפקת מדגם של C. elegans.

Protocol

1. מסונכרנים תרבות של C. elegans

1. לפני זריעה, תרבות Escherichia coli (e. coli) זן OP50 בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 300 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי. לאחסן את OP50 בתרבית ב-4 ° c
   1. כדי להפוך את LB מרק נוזלי בינוני, השתמש 10 גר' טריפטון, 5 גר' תמצית שמרים, 10 גרם של NaCl ו 1.5 מ ל 1 N NaOH ולאחר להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב.
      הערה: OP50 ו- C. elegans זנים זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis (אוניברסיטת מינסוטה, סנט פול, MN, ארה ב).
2. כדי להפוך את הצמיחה נמטודות בינוני (NGM) אגר, השתמש דור 3 של NaCl, 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, 975 מ ל מים יונים. אוטוקלב. מגניב עד 55 ° C, אז sterilely להוסיף, סדר, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl₂, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול EtOH ב, 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0 ב 90-מ מ פטרי....
   1. עבור 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0, להשתמש 108.3 גר'₂פו ח'₄ ו- g 46.6 של K-₂-HPO-₄, ולהוסיף מים יונים אוטוקלב ל' 1⁶.
3. מורחים 1-2 מ ל OP50 בתרבית על לוחות אגר NGM. כדי להפוך את שכבה דקה של OP50, דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר לפני הוספת כל נמטודות.
   הערה: NGM אגר הלוחות ש-op50 חוסנו ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 2-3 שבועות.
4. להוסיף לפחות 100 תולעים על גבי צלחת אגר NGM עם OP50 והתרבות 20 ° C עד השלב למבוגרים. לפחות שלושה לוחות דרושים.
5. לאסוף ביצים בתוך הרחם, להעביר אנדרוגינוסים gravid של שלושה NGM אגר צלחות כל עם 5 מ של מאגר S בצינור חרוטי 15-mL ולאחר לשטוף את התולעים 3 פעמים עם 15 מ"ל S המאגר באמצעות צנטריפוגה ב x 300 גרם ל 30 s בטמפרטורת החדר.
   1. כדי להפוך את מאגר S, 5.9 גרם של NaCl ולהשתמש 50 מ של 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0, להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב⁶.
6. להמיס תולעים פתרון תת-כלורי אלקליין axenization, לרשימת תפוצה ביצה בידוד (0.5 מ של אקונומיקה טריים או שווה ערך: 5-6% נתרן תת-כלורי, 0.1 מ"ל של NaOH 10 מ', כ- 4.5 מ ל S מאגר)⁶, ולעמוד הפתרון למשך 10-15 דקות- בטמפרטורת החדר עם ערבוב על-ידי היפוך.
   הערה: בתוך 15 דקות, תולעים בוגרות, צריך לפזר, עוזב פתרון מעורפל של ביצים שחרור מכל פגרי שלהם (הביצים המשוחררת יש לאשר באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי). במקום 0.1 מל ' של 10 N NaOH, 0.2 מ ל 5 N NaOH יכול גם לשמש.
7. לאחר טיפול תת-כלורי, לשטוף בגדר ביצה 3 פעמים עם 15 מ"ל S המאגר, resuspend ב 5-6 מ"ל S המאגר. בוקעות הביצים שפורסמו במהלך הדגירה לילה ב- 20 ° C במאגר S ללא e. coli לתרבות גיל-סינכרונית של הזחלים הבמה L1.
8. כדי לקבוע את המספר המשוער של הזחלים הבמה L1, לספור את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי ב- µL 10 S מאגר לאחר resuspending את הזחלים לפחות 3 פעמים, לחשב את הממוצע. לאחר מכן, להעביר את הזחלים הבמה L1 חמש פלטות אגר NGM עם OP50 (1500-3000 תולעים לכל לוח באמצעות צלחת פטרי 90-מ מ), תרבות ב- 20 ° C עד שהם גדלו לבמה למבוגרים צעירים, כאשר להפריה מתחילה, מספר הביצים מוטלות (בדרך כלל לאחר בתלת-ממד ays).

2. מיצוי של שבר הסלולר של C. elegans

1. לאסוף את הצעירים למבוגרים הבמה (בעלי חיים בן יום-5) תולעים של צלחות אגר NGM חמש עם מאגר S (איור 1 א').
   1. כדי לבחור רק תולעים חיים באמצעות שיטת סוכרוז⁶ לציפה על 30% (w/v) סוכרוז, מערבבים את התולעים הושעו ב 3-4 מ ל S מאגר עם אמצעי אחסון שווה של סוכרוז קרח 60% (w/v) צינור חרוטי 15-mL. לסובב את הצינור ב x 1,500 גרם 15 s ב 4 ° C ולהסיר הצפים תולעים לתוך צינור טריים על-ידי הזזתם מהקיר של הצינור עם פיפטה פסטר.
2. לשטוף את התולעים 3 פעמים עם מאגר S על ידי צנטריפוגה ב x 1,500 גרם ל 30 s-4 מעלות צלזיוס. בדוק את עוצמת הקול הרטוב של תולעים שטף לאחר צנטריפוגה באמצעות טיפ micropipette 1,000 µL (איור 1B).
3. להוסיף את התולעים שטף אמצעי שווה של חומצת חומץ טריכלור 10% (w/v) קרה כקרח (TCA; הריכוז הסופי של 5%) עבור חלבון משקעים (איור 1C). במקום TCA, חומצה על-כלורית (PCA) או חומצה metaphosphoric יכול לשמש.
4. Homogenize התולעים עם precipitant באמצעות קווים 40 של כבעלי מהמגן טפלון (פוטר-Elvehjem רקמות grinder) עם סיבוב בבית עד 1,300 סל"ד על קרח.
5. להעביר את homogenate microtube 1.5-mL טריים עם פיפטה פסטר, sonicate באמצעות מהמגן אולטראסוניות במשך 3 דקות (3 פעמים של 1 דקות) עם מחזור 20% על קרח.
6. להבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 º C. לנטרל את supernatants עם 4 מ KOH (נפח 0.25 ל-10% TCA) במשך 20 דקות על קרח, צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 º C. ניתן לאחסן את תגובת שיקוע (כמדגם מבחן) ב- 80 ° C עד מבחני הבאים.

3. לקטט Assay באמצעות ערכת Assay ערכי צבע מוחלטים

1. מודדים את ריכוז חומצת החלב הדגימות הבדיקה באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). לבצע בדיקות דופלקס על הדגימות הבדיקה. להוסיף 5 או 10 µL של הדגימות מבחן צלחת 96-ובכן, לכוונן את עוצמת הקול כדי µL 50 לכל טוב עם המאגר Assay לקטט מסופק עם הקיט.
2. על עקומת סטנדרטי לקטט, לדלל 100 מ מ L (+)-לקטט רגיל עד 1 מ"מ עם מאגר Assay לקטט. להוסיף 0, 2, 4, 6, 8 ו 10 µL של 1 מ מ L (+)-לקטט סטנדרטי, אשר מסופק עם הקיט, לתוך סדרה של וולס.
3. להוסיף 50 µL של תערובת התגובה (מכיל 46:2:2 של לקטט מאגר Assay, מיקס האנזים לקטט לקטט בדיקה ב דימתיל סולפוקסיד, נטול מים; ריאגנטים כל מסופק עם הקיט) או ערבוב שליטה רקע (מכיל 48:2 של לקטט מאגר Assay ו לקטט בדיקה) כל טוב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות, בעוד הדגימות מוגנים מפני אור.
4. למדוד את ספיגת כל הבאר-570 nm שימוש בקורא microplate להפחית את ספיגת של המיקס שליטה רקע מ ספיגת של המיקס התגובה.
5. מגרש העקומה סטנדרטי לקטט. לחשב את ריכוזי חומצת החלב הבדיקה דגימות מן העקומה סטנדרטי לקטט.

4. פירובט Assay באמצעות ערכת Assay ערכי צבע מוחלטים

1. למדוד את הריכוז של פירובט ב- supernatants (הבדיקה דוגמאות) באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). לבצע בדיקות דופלקס על הדגימות הבדיקה. להוסיף 10 µL של הדגימות הבדיקה, µL 90 של ריאגנט עובד (מכיל 94:1 של אנזים מיקס, ריאגנט לצבוע, אשר מסופקים עם הקיט) לתוך צלחת 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, בעוד הדגימות מוגנים מפני אור.
2. למדוד את ספיגת כל הבאר-570 nm באמצעות קורא microplate.
3. התווה את עקומת סטנדרטי של פירובט. לחשב את ריכוזי פירובט הבדיקה דגימות מן העקומה סטנדרטי פירובט.

5. שיטת עבור הנורמליזציה עם תכולת החלבון

1. מודדים את ריכוז חלבון supernatants (הבדיקה דוגמאות) באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). עם זאת, שלב זה אינו מוגבל ערכת assay, גישות אחרות יכול להיות מנוצל כדי למדוד את ריכוז חלבון.
2. לנרמל את הערכים של ריכוזים ו לקטט פירובט בין הדגימות הבדיקה באמצעות ריכוז חלבון הכוללת כל.
   הערה: ריכוז חלבון הדגימות מבחן מזוהה במידה מספקת גם לאחר חלבון משקעים, הוא מנוצל עבור השלב נורמליזציה בין הדגימות.

תוצאות

באמצעות מבחני את ערכי צבע מוחלטים לקביעת ריכוזים ו לקטט פירובט כמותית, הראנו את הדיוק של אלה מבחני לעומת דוחות הקודם ב- C. elegans^7,8. כאן, התהליך של חלבון משקעים במהלך חילוץ מדגם היה השלב המכריע ביותר כדי להפיק ערכים מדויקים. עבור חלבון משקע...

Discussion

כאשר ניצול ערכות אלה assay ערכי צבע מוחלטים, השלב הקריטי ביותר מדגם החילוץ כדי לזהות לקטט הסלולר ו פירובט במדויק ב- C. elegans הוא התהליך של חלבון המדידות המגון (איור 1). . זה לא הכרחי כדי להשתמש מהמגן טפלון, כמו אחרים לטקס (למשל., דאונס, צמצום מטחנות רקמות או חרוז מילס) מתאימ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton