Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Резюме

Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.

Аннотация

Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.

Введение

Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котором гликолиз используется преимущественно для производства энергии и аэробных митохондриальное дыхание, который включает цикл ТСА и электрон-транспортной цепи, downregulated в млекопитающих рака клеток в^1,2. Недавно мы показали, что уровень лактата и последующее лактата в пирувата (L/P) соотношение уменьшилось во время старения в организме модель Caenorhabditis elegans (C. elegans). Аналогичным образом мы обнаружили, что млекопитающих опухоли ortholog подавитель p53 ВИС-1 в C. elegans имеет важную роль в возрастных изменений метаболизма энергии путем активации его транскрипционный анализ цели³.

В биологических анализов, например измерения концентрации лактата и пирувата в клетках чувствительность, точность, размер выборки и время инкубации колориметрии/Флуориметрическое пробирного комплектов были улучшены резко. Благодаря технологическим новшествам теперь мы можем анализировать различные метаболиты и промежуточных метаболитов без крупномасштабных культуры C. elegans, который трудно, учитывая ее небольшие размеры. В общем чувствительность колориметрического анализа является на порядок меньше, чем Флуориметрическое анализа; Однако колориметрические подход больше подходит в установлении общих лабораториях. Кроме того метод извлечения, содержащие гомогенизации и белка осадков имеет решающее значение для количественного определения концентраций лактата и пирувата в C. elegans клетки, потому что этот нематода заключена в экзоскелет под названием кутикулы, в отличие от mammalian клетки культивировали линии^4,5. Здесь мы описываем протокол для анализа концентрации лактата и пирувата, с помощью коммерческих колориметрического анализа комплектов, включая советы для извлечения образца из C. elegans.

протокол

1. синхронизированные культуры C. elegans

1. Перед посевом, культура Escherichia coli (E. coli) штамма ОР50 на ночь при 37 ° C в 300 мл жидкой среды бульон Бертани Лурия (LB). Магазин искусственный ОР50-4 ° c.
   1. Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 г NaCl и 1,5 мл 1 N NaOH и добавить 1 Л деионизированной водой. Автоклав.
      Примечание: ОР50 и C. elegans штаммы доступны из центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, Сент-Пол, Миннесота, США).
2. Чтобы сделать нематоды роста среднего (НГМ) агар, используйте 3 g NaCl, 2.5 g Пептон, 17 g агар и 975 мл деионизованной воды. Автоклав. Охладить до 55 ° C, а затем среду добавить в заказ, 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл CaCl 1 M₂, 1 мл 5 мг/мл холестерина в EtOH и 25 мл 1 М фосфат калия pH 6.0 в 90-мм Петри.
   1. 1 M калия фосфат pH 6.0 используйте 108.3 g KH₂PO₄ и 46,6 g K₂HPO₄и Добавьте деионизированной воды до 1 л автоклав⁶.
3. Распространение 1-2 мл культивировали ОР50 на плитах агара NGM. Чтобы сделать тонкий слой ОР50, Инкубируйте пластины на ночь при комнатной температуре перед добавлением любой нематод.
   Примечание: NGM плиты агара привитых ОР50 может храниться при комнатной температуре на 2-3 недели.
4. Добавьте по крайней мере 100 червей на NGM агар пластину с ОР50 и культуры при 20 ° C до стадии взрослого. Требуется по меньшей мере три пластины.
5. Собирать яйца в утробе матери, передачи беременных гермафродитки из трех NGM плиты агара каждый с 5 мл буфера S в 15 мл Конические трубки и мыть червей 3 раза с 15 мл S буфера с помощью центрифугирования в 300 x g 30 s при комнатной температуре.
   1. Чтобы сделать S буфера, использовать 5,9 г NaCl и 50 мл 1 М калия фосфат pH 6.0, добавьте 1 Л деионизированной водой. Автоклав⁶.
6. Распустить червей в щелочной гипохлорита раствор для axenization и сыпучие яйцо изоляции (0,5 мл свежего отбеливатель или эквивалент: 5-6% гипохлорита натрия, 0,1 мл 10 M NaOH, примерно 4,5 мл буфера S)⁶, и постоять 10-15 мин на решение комнатной температуре с перемешиванием, инвертирование.
   Примечание: В течение 15 мин, взрослых червей следует распустить, оставляя туманно решение яиц, освобожденных от их туши (освобожденных яйца должны быть подтверждены с помощью стереоскопического микроскопа). Вместо 0,1 мл 10 N NaOH 0,2 мл 5 N NaOH может также использоваться.
7. После лечения гипохлорита мыть яйца гранулы 3 раза с 15 мл буфера S и Ресуспензируйте в 5-6 мл S буфера. Люк выпустила яйца во время ночи инкубации при 20 ° C в буфере S без E. coli возраст синхронных культуры L1 стадии личинок.
8. Чтобы определить приблизительное количество L1 стадии личинки, граф червей с помощью стереоскопического микроскопа в 10 мкл буфера S после resuspending личинки по крайней мере 3 раза и вычислить среднее значение. Затем передавать L1 стадии личинки пяти NGM плиты агара с ОР50 (1500-3000 червей за пластины с помощью Петри 90 мм) и культура при 20 ° C до тех пор, пока они выросли на молодых взрослых сцену, когда начинается самооплодотворения и несколько яиц (обычно после 3 d Айс).

2. Добыча сотовой дроби от C. elegans

1. Соберите молодой взрослый этап (5-дневных животных) червей из пяти NGM плиты агара с S буфера (рис. 1A).
   1. Чтобы выбрать только жизни червей с помощью метода сахарозы⁶ для флотации на 30% (w/v) сахарозы, смешайте приостановлено в 3-4 мл буфера S с равным объемом ледяной 60% (w/v) сахарозы в 15 мл Конические трубки червей. Спина трубки на 1500 x g 15 s при 4 ° C и удалить плавающей червей в свежий трубку, перемещая их за пределы стенки трубки с пипетка Пастера.
2. Моют червей 3 раза с буфером S центрифугированием на 1500 x g за 30 сек при 4 ° C. Проверьте мокрой объем промывают червей после центрифугирования, используя кончик микропипеткой 1000 мкл (рис. 1B).
3. Добавьте промытый червей равным объемом ледяной 10% (w/v) трихлоруксусной кислоты (TCA; конечной концентрации 5%) для белка осадков (рис. 1 c). Вместо того чтобы ТКА может использоваться хлорной кислоты (PCA) или metaphosphoric кислоту.
4. Однородный червей с осадителя, используя 40 ударов пестика в тефлоновой гомогенизатора (Поттер-Elvehjem ткани мясорубку) с вращением на до 1300 об/мин на льду.
5. Передача огневки в свежий Микропробирка 1.5 мл с пипетка Пастера и sonicate с помощью ультразвуковой гомогенизатор для 3 мин (3 раза по 1 мин) с 20% Рабочий цикл на льду.
6. Уточнить огневки центрифугированием в 8000 x g 10 мин при 4 ° C. Нейтрализовать supernatants с 4 M Кох (0,25 объем до 10% TCA) за 20 минут на льду и центрифуги на 8000 x g 10 мин при 4 ° C. Супернатант (как образец теста) могут храниться при температуре-80 ° C до следующих анализов.

3. лактата Assay с помощью колориметрических Assay Kit

1. Измерение концентрации лактата в образцы с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Осуществляют дуплекс экзамены для испытательных образцов. 5 или 10 мкл испытательных образцов на 96-луночных тарелку и отрегулировать громкость до 50 мкл в колодец с Assay Buffer лактат, комплект.
2. Для стандартной кривой лактат, разбавляют 100 мм L (+)-лактат стандарт до 1 мм с лактата Assay Buffer. Добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл 1 мм L (+)-лактат стандарт, который предоставляется с комплектом, в ряд скважин.
3. 50 мкл реакции Mix (содержащие 46:2:2 лактат Assay Buffer, микс фермента лактата и лактата зонд в ДМСО, безводный; все реагенты предоставляются в комплект) или фон управления Mix (содержащие 48:2 лактат Assay Buffer и лактата зонд) в каждой скважине и инкубации при комнатной температуре за 30-60 мин, в то время как образцы защищены от света.
4. Измерение поглощения каждой скважины на 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов и вычесть поглощения фон управления Mix от поглощения смеси реакции.
5. Участок лактат калибровочной кривой. Рассчитайте концентрации лактата испытательных образцов из лактата калибровочной кривой.

4. пируват Assay с помощью колориметрических Assay Kit

1. Измерьте концентрацию пирувата в supernatants (пробы) с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Осуществляют дуплекс экзамены для испытательных образцов. Добавить 10 мкл испытательных образцов и 90 мкл рабочего реагента (содержащие 94:1 фермента смеси и краска реагента, которые предоставляются в комплект) в 96-луночных плиту и инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин, в то время как образцы защищены от света.
2. Измерение оптической плотности каждой скважины на 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
3. Участок пируват калибровочной кривой. Рассчитайте концентрации пируват испытательных образцов из пирувата калибровочной кривой.

5. белка Assay для нормализации с содержанием белка

1. Измерьте концентрацию белка в supernatants (пробы) с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Однако этот шаг не ограничивается пробирного комплект, и другие подходы могут быть использованы для измерения концентрации белка.
2. Нормализовать значения концентраций лактата и пирувата среди образцы с использованием каждого концентрации общего белка.
   Примечание: Концентрация белка в испытательных образцов обнаруживается достаточно даже после осадков белок и используется для нормализации шага среди образцов.

Результаты

С помощью колориметрических анализов для количественного определения концентрации лактата и пирувата, мы показали точность этих анализов, по сравнению с предыдущими докладами в C. elegans^7,,⁸. Здесь процесс белка осадков во время извле?...

Обсуждение

При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton