أسلوب حجمي للتحديد الكمي للمخ بالتشنج في نموذج موريني نزيف تحت العنكبوتية

Summary

والهدف من هذه المادة هو تقديم أسلوب يسمح بإعادة بناء ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية للمخ في الفئران بعد الدقيقة المحسوبة التصوير المقطعي وتحديد كميات من شرائح كامل السفينة التي يمكن استخدامها لقياس بالتشنج الدماغي في مورين نماذج من نزيف تحت العنكبوتية.

Abstract

نزيف تحت العنكبوتية (ساه) نوع فرعي من السكتة الدماغية النزفية. هو عامل مهم في تحديد نتائج المريض بالتشنج الدماغي الذي يحدث في أعقاب نزيف ولذلك كثيرا ما تؤخذ كنقطة نهاية دراسة. في دراسات أجريت على الحيوانات الصغيرة في صح، التحديد الكمي للمخ بالتشنج غير تحديا كبيرا. هنا، هو عرض أسلوب السابقين فيفو يسمح التحديد الكمي لوحدات تخزين شرائح كامل السفينة، التي يمكن استخدامها كتدبير من تدابير موضوعية للقياس الكمي بالتشنج الدماغي. في خطوة أولى، يتم صب اللمفاوية المفرج الدماغي استخدام عامل صب راديوباك. ثم، تكتسب بيانات التصوير المقطعي بالجزئي المقطعي. الخطوة الأخيرة ينطوي على إعادة البناء ثلاثي الأبعاد شجرة الأوعية الدموية الظاهري، تليها خوارزمية لحساب مركز خطوط وأحجام قطاعات مختارة من السفينة. وأسفر الأسلوب بإعادة بناء ظاهري دقيقة للغاية للشجرة المخية يتبين من مقارنة العينات التشريحية مع انتهاء عمليات إعادة البناء الظاهري المستندة إلى قطر. وبالمقارنة مع أقطار السفينة وحدها، أحجام السفن تسليط الضوء على الاختلافات بين السفن فاسوسباستيك وغير فاسوسباستيك التي تظهر في سلسلة من ساه والفئران تعمل بالشام.

Introduction

أنيوريسماتيك نزيف تحت العنكبوتية (صح)، نوع فرعي من السكتة الدماغية النزفية، مرض شائع في وحدات الرعاية نيوروينتينسيفي. بالإضافة إلى إصابة في الدماغ المبكر (المعهد المصرفي المصري)، الذي يشمل الأضرار الدماغية الناجمة عن النزيف الحدث نفسه، هو عامل هام آخر تحديد نتائج المريض تأخر الاسكيمية الدماغي (الحركة)، يحددها السريرية التدهور من خلال إعاقة دماغية نضح أو احتشاء دماغي غير المرتبطة بالإجراءات الجراحية أو التدخلية^1،،من²³. آليات هامة تسهم في الحركة فاسوسباسمس الأوعية الدماغية الكبيرة من ناحية؛ من ناحية أخرى، دور الخلل microcirculatory مع بالتشنج ميكروفيسيلس وميكروثرومبوسيس والاسكيميه المتصلة بالمنخفضات نشر القشرية (استعرض في 2014 مادونالد¹). ولذلك، تشخيص بالتشنج الأوعية الدماغية كبيرة أمر بالغ الأهمية في الممارسة السريرية، ويعرض نقطة هامة في العديد من الدراسات السريرية والتجريبية.

على الرغم من حقيقة أن ميزات بالتشنج في مورين ساه نماذج غير مباشرة قابلة للتحويل إلى نماذج صح المريض، مورين البشرية ذات الصلة بالتشنج قد متزايد الأهمية في السنوات الأخيرة. في هذه النماذج صح هو فعل اللمفاوية الشعيرة انثقاب^{4،5،6،7،8}، ترانسيكشن للسفن سيستيرنال⁹، أو حقن الدم في السائل الدماغي النخاعي^{10 ،،}من¹¹¹². على النقيض كبيرة نماذج حيوانية لساه التي صممت تقليديا للدراسة بالتشنج¹³، نماذج موريني مزية كبيرة أن تتوفر العديد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا. وهذا يجعلها أداة ممتازة لدراسة الآليات الجزيئية التي تفضي إلى بالتشنج والحركة. ومع ذلك، تحديد بالتشنج المخ في الفئران تحديا. يرجع ذلك إلى أنه على النقيض من النماذج الحيوانية الكبيرة التي يمكن بحث بالتشنج باستخدام تقنيات التصوير السريري، في فيفو التصوير لتحليل بالتشنج المخ في الفئران ليست متاحة بعد. ولذلك، يتحدد بالتشنج عادة باستخدام أما مقاطع نسيجية^10،11 أو مجهريا بعد الصب من الأوعية الدماغية^7،،من⁹¹². ومع ذلك، هذه التقنيات قد العيب تلك السفينة ويتم فحص أقطار في نقاط محددة فقط.

بناء على دراسة سابقة⁷، هذه المخطوطة تعرض طريقة لتحليل موضوعي واستنساخه بالتشنج في نموذج ساه مورين. الأسلوب استناداً إلى نضح وصب الأوعية الدماغية، والمسح الجزئي-CT السابقين فيفو ، التعمير الرقمية من شجرة السفينة، ولاحقا تقييم كميات من الأوعية الدماغية كامل.

Protocol

التجارب على الحيوانات التي أقرتها اللجنة مسؤولية رعاية الحيوان (لانديسونتيرسوتشونجسامت راينلاند-فالز) وتنفذ وفقا "القانون الألماني لرعاية الحيوان" (تيرشج). وتلت كل التوجيهية المؤسسية الوطنية والدولية المنطبقة لرعاية واستخدام الحيوانات.

واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران الذكور C57BL6 (في سن 10-12 أسبوعا). وباختصار، حملت نزيف تحت العنكبوتية بثقب الشعيرة اللمفاوية تحت التخدير مع إيسوفلوراني. وقد أعد الشريان السباتي الخارجي الأيسر جراحيا. ثم، خيوط إدراجها في الشريان السباتي الخارجي ومتقدمة إينتراكرانيالي عن طريق الشريان السباتي الداخلي الذي كان ثقب في السباتي T، الذي يحفز بنزيف تحت العنكبوتية. ارتفاع في الضغط داخل الجمجمة قد اتخذ كمؤشر على نجاح اللمفاوية الثقب. بروتوكول مفصل نموذج ثقب الشعيرة اللمفاوية لساه في الفئران وقد نشرت من قبل الآخرين^8،14.

1. نضح وصب اللف

1. في هذه الدراسة، تم إجراء نضح 72 ساعة بعد تحريض ساه. حمل التخدير عن طريق حقن إينترابيريتونيلي 5 ميكروغرام/غرام الجسم الوزن (الأسلحة البيولوجية) الميدازولام و 30 نانوغرام/غرام وزن الجسم شيفتشنكو 0.5 ميكروغرام/غرام وزن الجسم ميديتوميدين. يستمر إلا بعد مستوى تخدير كافية تم التوصل إلى، وهو ما يؤكده عدم وجود ردود فعل لمحفزات الألم.
2. فتح الصدر وثقب البطين الأيسر مع قنية ز 21، فتح الاذين الأيمن والمشبك الابهر تنازلي كما هو موضح في مكان آخر¹⁵.
3. إجراء نضح ترانسكاردياك استخدام الحلول التالية: (ط) دولبيكو "الفوسفات مخزنة المالحة" تتضمن مجكل₂ و كاكل₂ على درجة الحموضة 7.4 مع الجلوكوز 1 غرام/لتر، والحل بارافورمالدهيد 4% (ثانيا).
   1. ابدأ نضح مع الحل (ط) لمدة دقيقتين ويستمر مع الحل (الثاني) لمدة 4 دقائق.
   2. يبث الحلول عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واستخدام مضخة للتحكم في الضغط مع معدل التروية متغير إلى نتخلل مع ضغط مستمر من 70 مم زئبق، الذي وجد أن ضغط التروية الأمثل لتحليل بالتشنج في الفئران¹⁶. تجنب فقدان الضغط عند التبديل من الحل (ط) إلى حل (ثانيا).
4. بعد التروية مع الحلول (ط) و (ثانيا)، لا تزال نضح لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عامل صب راديوباك (انظر الجدول للمواد) 0.2 مل/دقيقة بمعدل ثابت.
5. السماح لعلاج المواد الصب راديوباك في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم قم بإزالة الدماغ من الجمجمة كما هو موضح سابقا¹⁷ونقل العينة إلى 4% PFA حل تخزين العينة في 4 درجات مئوية حتى مسح الأشعة المقطعية الصغرى.

2-الجزئي المقطعي

1. مكان الدماغ في مركز أنبوب بلاستيكي مع ملقط تشريحية غير حادة. اختر أنبوب قطره أكبر قليلاً من العينة لضمان عدم تحرك الكائن أثناء الحصول على الصور. استخدام الشاش لإغلاق الأنبوب.
2. إرفاق أنبوب بلاستيكي للمحرك الصغير الخطو على نظام تحديد المواقع (الحاسب الآلي) الكمبيوتر-أبحر-مراقبة في كابينة الأشعة السينية، التي يتم استدارة الكائن حول محورها الأفقي.
3. قم بمحاذاة العينة في الميدان من العرض تحت الأشعة السينية. لتحقيق نسبة التكبير القصوى، وضع الكائن أقرب قدر الإمكان إلى مصدر الأشعة السينية وتحقيق أقصى قدر من المسافة إلى كاشف قدر الإمكان.
4. استخدام بروتوكول اكتساب صورة الخطوة وإطلاق النار مع المعلمات المسح التالية: تعيين وقت التعرض إلى 1 s لكل التوقعات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية)، وأنبوب الجهد 80 كيلو فولت (µA 38 الحالية)، تناوب 360° أسفر عن الإسقاطات 1,000.
5. لإعادة بناء البيانات الخام استخدام خوارزمية إسقاط الخلفي مصفاة تطبيق مرشح شب-لوغان بمصفوفة من 1024 × 1024 × 1024 فوكسيلس استخدام برامج إعادة الإعمار (انظر الجدول للمواد). لمزيد من التحليل باستيراد البيانات DICOM الناتجة إلى البرمجيات التصور ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول للمواد).

3-3-الأبعاد التعمير شجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة وتحديد حجم السفينة

ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات أساسية عن المهام البرنامج التصور باستخدام الدالة المساعدة.

1. استيراد بيانات Dicom إلى استخدام الدالة استيرادالبرمجيات التصور.
2. تصور الشجرة السفينة مع الدالة فولرين. اختر عتبة التصور بحيث يصور الشرايين الدماغية كبيرة في مخططات حادة. من المهم استخدام عتبة التصور نفسه لجميع مجموعات البيانات التي تنتمي إلى المجموعة التجريبية.
3. تقريبا تشريح الشرايين الدماغية القاعدية (دائرة ويليس) باستخدام الدالة فولوميديت التي تحيط بالسفن مع المؤشر. ثم تشريح تقريبا الجزء السفينة يتم تحليلها. ولذلك، تدوير نموذج ثلاثي الأبعاد من شجرة الأوعية الدموية من أجل دقة فصل جميع فروع صغيرة من الشريان الرئيسي. من الضروري إجراء المزيد من التحليل لحذف جميع السفن فيما عدا الجزء المتعلق بالسفينة يتم تحليلها.
4. تطبيق الدالة أوتوسكيليتون مع الحد الأدنى لعتبة التصور، الذي يولد مركز-خط-على أساس سباتيالجراف.
5. ثم قم بتطبيق الدالة سباتيالجرافتولينيسيت لإنشاء خط مجموعة- تقسيم خط تعيين إلى به الشرائح واحد باختيار الشرائح واحد مع المؤشر يدوياً والنقر على "تقسيم". تعد هذه الخطوة الحاسمة من أجل حساب أحجام الشرائح واحد.
6. استخدم الدالة لينيسيتوسباتيالجراف لإنشاء رسم "بياني المكانية" مرة أخرى.
7. استخدم الدالة سباتيالجرافستاتيستيكس لتحديد الطول والحجم والقطر من كل الشرائح الفرعية. للتصور مرمزة تمثل مسار سفينة القطر، استخدم الدالة سباتيالجراففيو. تعيين الجزء التلوين إلى "سمك"، الذي يرتبط بقطر السفينة. من المهم أن تختار خريطة اللون نفسه لجميع مجموعات البيانات المنتمين إلى المجموعة التجريبية.
8. إضافة أطوال الشرائح لتحديد الشرائح التي يتم إدراجها في إجراء مزيد من التحليل. في هذه الدراسة يمكننا تقييم قطاع سفينة يتألف من 1 الشريان السباتي الداخلي الدانية من السباتي T و 2.5 ملم الشريان الدماغي الأوسط القاصي من السباتي ت. قم بإضافة وحدات التخزين لتحديد حجم السفينة من الجزء المتعلق بتعريف السفينة.

النتائج

التعمير الظاهري لشجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة ثلاثي الأبعاد

وقدم الأشجار الأوعية الدموية داخل الجمجمة 3-الأبعاد أعيد بناؤها تشريح الأوعية الدموية درجة عالية من دقة (الشكل 1). لتقييم مدى الدقة، أجرينا مقارنة على أساس القطر بين أقطار السفينة مصممة مجهريا ومن عمليات إعادة البناء الظاهري 3 الأبعاد في نقاط محددة تشريحيا 2 (1: ترك الشريان الدماغي الأوسط (MCA) 1 مم القاصي السباتي تي؛ 2: حق MCA القاصي من السباتي ر 1 ملم). لتصميم مجهرية من أقطار السفينة، استخدمت عالية الدقة (X-21 اللانهاية، ديلتابيكس) مع كاميرا ديلتابيكس انسايت البرمجيات الإصدار 2.0.1 معايرة بمقياس ميكرومتر. لهذا التقييم، تم تحليل 10 عينات المخ (صح 5، 5 الشام). وكانت هذه من سلسلة من 12 من الفئران، في 7 التي كان المستحث ساه، بينما 5 جراحية الشام (الحيوانات 2 مجموعة صح توفي في أيام ما بعد الجراحة 1 و 2، على التوالي). لا توجد هناك فروق كبيرة بين أقطار العزم مجهريا وتقريبا، مما يدل تعمير ظاهري دقيقة من تشريح الأوعية الدموية داخل الجمجمة (تصميم مجهرية مقابل التعمير الظاهري، يعني خطأ معياري ±: ترك MCA 150 ± 9 ميكرومتر مقابل الأيسر MCA 150 ± 8 ميكرومتر؛ الحق MCA 153 ± 8 ميكرومتر مقابل154 ± 9 ميكرومتر، انظر الشكل 2).

التحديد الكمي للمخ بالتشنج في الفئران مع صح

للقياس الكمي بالتشنج الدماغية، كانت (ط) حجم قطاع السفينة مسبقاً الممثل 3.5 مم، يتألف من 1 مم الشريان السباتي الداخلي (ICA) و 2.5 ملم MCA على اليسار، والسفينة (ثانيا) أقطار في نقاط محددة تشريحيا 2 (MCA اليمين واليسار) تحدد في عينات الدماغ من ساه والحيوانات تعمل بالشام (n = 5). حجم السفينة كان أقل بكثير في ساه مقارنة بالشام (36 ± 4 nL مقابل 71 ± 9 nL، ف < 0.05). أقطار سفينة كانت أقل في ساه مقارنة بالشام (ترك MCA: 140 مكم ± 11 مقابل 160 ± 10 ميكرومتر، ف = 0.11؛ الحق MCA: 130 ميكرومتر ± 16 مقابل 158 ± 13 ميكرومتر، ف < 0.05؛ انظر الشكل 3)، في حين تم التوصل إلى مستوى من الأهمية إلا هو من حق هيئة مكافحة الاحتكارات.

الشكل 1. الإعمار الظاهري لشجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة. (أ) يظهر عينة تمثيلية المخ؛ (ب) يبين المقابلة تقريبا أعيد بناء شجرة الأوعية الدموية. (ج) مرمزة التصور لقطر اليسار MCA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . الدقة الرقمية إعادة إعمار المفرج- قياس أقطار يعني من عينات 3D الدماغ أعيد بناؤها بالمقارنة مع تلك التي تحدد مجهريا. وترد البيانات ك ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . حجم السفينة وسفينة القطر بعد صح. (أ) قياس أقطار مقارنة MCA من 3D المفرج أعيد بناؤها في ساه ومشينة الفئران. (ب) حجم السفينة في ساه ومشينة الفئران. وترد البيانات ك ± يعني الخطأ المعياري للوسط. ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مورين ساه النماذج أداة هامة للبحوث ساه الأساسية. الدماغي بالتشنج كثيرا ما يستخدم كنقطة نهاية في الدراسات التجريبية التحقيق الآليات المؤدية إلى الحركة بعد صح^9،11. ومع ذلك، التحديد الكمي للمخ بالتشنج في الفئران أو غيرها نماذج حيوانية صغيرة من ساه يمثل تحديا. عادة، يتم كمياً بالتشنج بعزم السابقين فيفو من أقطار السفينة في نقاط محددة التشريحية بعد التروية اللمفاوية وصب^7،،من⁹¹² أو بواسطة تحديد محيط من سفن محددة في غذائها الأبواب^10،11. ومع ذلك، هذه الأساليب لها بعض العيوب: يتم تقييم بالتشنج فقط عند نقاط تشريحية محددة؛ بالتشنج المجاورة أجزاء السفينة قد هربا من التقييم. التحف النسيجي يقدم مصدرا آخر للأخطاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون التقييم ذاتي بدلاً من ذلك، لأنه يتم تحديد الموضع الدقيق حيث يتم قياس قطر السفينة قبل المحقق.

ولذلك كان الهدف هو وضع طريقة يوضحها بالتشنج الدماغي عن طريق حساب حجم السفينة السفينة دماغي كامل أجزاء من بيانات التصوير المقطعي⁷. أهم ميزة الأسلوب الحجمي المعروضة هنا هي تلك السفينة كاملة يمكن فحص شرائح. هذا يتجنب الحاجة لتعريف نقطة حيث يتم قياس قطر السفينة. وثمة ميزة أخرى للتقييم لأجزاء السفينة كله هو أنه يفترض أن يعرض معلمة أكثر موضوعية لقياس بالتشنج من تحديد أقطار السفينة في نقاط محددة بحيث يمكن الهروب بالتشنج السفينة أكثر الدانية أو البعيدة التقييم. التمثيل الرقمي لأقطار السفينة باستخدام رمز لون يتيح تقدير بديهية لدرجة بالتشنج. وعلاوة على ذلك، يؤدي الحجمي التقييم إلى أكبر الفروق بين السفن فاسوسباستيك مقارنة بتقييم أقطار السفينة كما هو مبين في نتائج الممثل. إعمار الظاهري تحقيقه بالطريقة المعروضة هنا يبين تشريح الأوعية الدموية بدقة. ويرد هذا التقييم لسلسلة الممثل، في السفينة التي تقاس مجهريا أقطار ومن إعادة البناء الرقمية كانت متشابهة، استنساخ ملاحظات الدراسة السابقة⁷. ومع ذلك، رغم مزاياه، وكذلك الدراسات مطلوبة لتقييم أم لا الأسلوب الذي قدم هنا متفوقة على الأساليب التقليدية للتحليل بالتشنج.

حد من الطريقة المعروضة هنا أنه يتيح مزيدا من الوقت مقارنة بالتحليل المجهري لعينات المخ مسبوك أو التحليل النسيجي (CT مايكرو المسح الضوئي الوقت 90 دقيقة كل عينة الدماغ، معالجة البيانات 45 دقيقة لكل عينة الدماغ). وعلاوة على ذلك، توفر الماسحات المقطعية الصغرى قد تحد من تطبيقها. وكان عدد الحيوانات التي درست هنا كافية لإثبات جدوى البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة. ومع ذلك، إذا كان البروتوكول ينبغي أن تستخدم في دراسات العلاج، الحيوان الأرقام سيكون على حساب استناداً الآثار المتوقعة على حجم السفينة وأقطار. قيد آخر لهذه وغيرها من الدراسات باستخدام نماذج ساه مورين بهذا التشنج هو العزم السابقين فيفو. وهذا يجعل من الدراسات الطولية مستحيلة التحقيق قيم الأساس قبل التعريفي ساه بالتشنج في نقاط زمنية مختلفة. على الرغم من أن الدراسات أظهرت أنه من الممكن تصور تشريح للسفن داخل الجمجمة الكبيرة من الفئران في فيفو باستخدام التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي¹⁸أو التصوير المقطعي الأوعية¹⁹أو الطرح الرقمي الأوعية²⁰، هذه الأساليب، على حد علمنا، لا بعد استخدمت لتحليل بالتشنج الدماغي في نماذج ساه موريني فيفو. من المذكرة، إعادة المفرج الدماغي الرقمية مع التقييم اللاحق الحجمي للمخ بالتشنج المعروضة هنا لا يقتصر الاستخدام السابقين فيفو البيانات الدقيقة الأشعة المقطعية ل. إذا كان تصوير الأوعية الدموية عبر الدماغ مقطعية عالية الدقة في الفئران وينبغي أن تصبح متاحة في المستقبل، فإنه يمكن القيام تحليل الحجمي بالتشنج في فيفو.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany