Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Özet

Bu makalenin amacı mikro bilgisayarlı tomografi ve serebral vasospasm ölçmek için kullanılan tüm gemi parçaları hacimleri belirlenmesi sonra farelerde serebrovasküler ağaç 3 boyutlu rekonstrüksiyon sağlayan bir yöntem sunmaktır fare modelleri subaraknoid kanama.

Özet

Subaraknoid kanama (SAH) hemorajik inme alt olduğunu. Kanama sonrasında oluşur beyin vasospasm hasta sonucu belirlemede önemli bir faktör olduğunu ve bu nedenle sık sık çalışma bitiş noktası olarak alınır. Ancak, küçük hayvan çalışmalarında SAH üzerinde serebral vasospasm miktar büyük bir sorun olduğunu. Burada, bir ex vivo yöntemi miktar serebral vasospasm ölçmek için objektif bir ölçü kullanılabilir tüm gemi parçaları hacimli sağlayan sunulur. Bir ilk adım olarak, beyin damarlara endovasküler döküm radyoopak döküm Aracı kullanılarak gerçekleştirilir. O zaman, kesitsel görüntü veri mikro bilgisayarlı tomografi ile elde edilir. Son adım 3 boyutlu inşası merkezi hatları ve seçilen gemi segmentlerinin birimleri hesaplamak için bir algoritma tarafından takip sanal vasküler ağacı içerir. Yöntem kendi sanal rekonstrüksiyonu ile anatomik örnekleri çapı tabanlı karşılaştırılması tarafından gösterilen serebrovasküler ağaç son derece hassas bir sanal yeniden inşası sonuçlandı. Yalnız gemi çapları ile karşılaştırıldığında, gemi birimleri SAH ve sham çalışan fareler bir dizide vazospastik ve vazospastik sigara damarları arasındaki farkları vurgulayın.

Giriş

Aneurysmatic subaraknoid kanama (SAH), hemorajik inme, bir alt tür neurointensive bakım ünitelerinde yaygın bir hastalıktır. Kanama olayı kendisi tarafından beyin hasarları oluşmaktadır, erken beyin hasarı yanı sıra (EBI), klinik tarafından tanımlanan gecikmeli serebral iskemi (şef), hasta sonucu belirleyen bir diğer önemli faktör olduğunu bozulma ile Engelli beyin perfüzyon veya beyin enfarktüsü girişimsel ve cerrahi^1,2,3ile ilişkili değil. DCI için katkıda bulunan önemli vasospasms büyük beyin damarlarının bir yandan mekanizmasıdır; Öte yandan, vasospasm yüzdeki ve mikrotromboz ve kortikal yayılan depresyon ile ilgili iskemi ile microcirculatory disfonksiyon (gözden Madonald 2014¹içinde) bir rol oynar. Bu nedenle, vasospasm büyük beyin damarlarının tanısında klinik pratikte çok önemlidir ve birçok klinik ve deneysel çalışmalarda önemli bir bitiş noktasını görüntüler.

Vasospasm fare SAH modelleri özellikleri doğrudan değildir olmasına rağmen SAH insan hasta, fare modelleri için transfer edilebilir ilgili vasospasm-si olmak be önemi son yıllarda büyüyen. Bu modelleri SAH endovasküler filaman delikli^4,5,6,7,8, cisternal gemiler⁹transeksiyon veya bos^{10 içine kan enjeksiyon tarafından indüklenen ,11,12}. Geleneksel olarak vasospasm¹³eğitim için tasarlanmış büyük hayvan modelleri SAH aksine, fare modelleri çok sayıda transgenik fareler suşları kullanılabilir üstünlüğü var. Bu onları moleküler mekanizmalar vasospasm ve DCI lider eğitim için mükemmel bir araç yapar. Ancak, farelerde serebral vasospasm belirlenmesi zordur. Bunun nedeni, vasospasm klinik görüntüleme teknikleri kullanılarak incelenebilir büyük hayvan modeller aksine farelerde serebral vasospasm analiz etmek için Imaging vivo içinde henüz kullanılabilir değil. Bu nedenle, vasospasm yaygın olarak her iki histolojik kesitler^10,11 kullanarak veya mikroskobik sonra beyin damarlarının^7,9,12/ döküm belirlenir. Ancak, bu teknikler çapları sadece tanımlanmış noktalarda incelenir o gemiyi dezavantajı var.

Bir önceki çalışma⁷üzerinde bağlı olarak, bu el yazması bir fare SAH modelinde amaç ve vasospasm tekrarlanabilir analizi için bir yöntem sunar. Perfüzyon ve döküm beyin damarları, ex vivo mikro-CT tarama, dijital yeniden gemisi ağacının bağlı ve sonraki yöntemdir birimleri tüm beyin damarlarının değerlendirilmesi.

Protokol

Hayvan deneyleri sorumlu hayvan bakımı Komitesi (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) tarafından onaylanmış ve Alman hayvan refah Yasası (TierSchG) uygun olarak yürütülmektedir. Bakım ve hayvanların kullanımı için ilgili tüm uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergeleri takip edildi.

Bu çalışmada, Erkek C57BL6 fareler (10-12 hafta yaş) kullanılmıştır. Kısacası, subaraknoid kanama endovasküler filaman perforasyon isoflurane ile anestezi altında tarafından akımıdır. Sol dış karotid arter cerrahi olarak hazırlanmıştır. Sonra bir filament dış karotid arter eklenen ve intracranially karotis T, subaraknoid kanama inducing delikli iç karotis arter yoluyla gelişmiş. Kafa içi basınç artış başarılı endovasküler bir göstergesi olarak alınan delikli. Farelerde SAH bir endovasküler filaman perforasyon modeli detaylı bir protokol oldu başkaları tarafından^8,14yayınlandı.

1. perfüzyon ve endovasküler döküm

1. Bu çalışmada, perfüzyon 72 saat sonra SAH indüksiyon gerçekleştirildi. Anestezi intraperitoneally 5 µg/g vücut ağırlığı (bw) midazolam, 30 ng/g bw fentanil ve 0,5 µg/g bw medetomidin enjekte edilerek ikna etmek. Sadece yeterli anestezi düzeyi, hangi acı uyaranlara karşı tepkiler yokluğunda tarafından onaylandıktan ulaşıldıktan sonra devam edin.
2. Toraks açık, 21 G kanül ile sol ventrikül ponksiyon, sağ atrium açın ve azalan aort açıklandığı gibi başka bir yerde¹⁵kelepçe.
3. Aşağıdaki çözümleri kullanarak bir transcardiac perfüzyon gerçekleştirmek: (i) Dulbecco'nın fosfat tamponlu MgCl₂ ve CaCl₂ pH 7.4 ile 1 g/M glikoz ve (ii) % 4 paraformaldehyde çözüm içeren serum fizyolojik.
   1. Perfüzyon çözüm ile (i) için 2 dakika başlarlar ve çözüm ile (II) 4 dakikadır.
   2. Çözümleri bir sıcaklık 37 ° C ve vasospasm fareler¹⁶çözümlemek için en uygun perfüzyon basıncı bulundu 70 mmHg sabit bir basınç ile sıvı için değişken perfüzyon oranı ile basınç kontrollü pompa kullanarak süzülür. Basınç kaybı çözüm (i) geçiş yaparken çözüm (II) kaçının.
4. Radyoopak döküm ajan ile Oda sıcaklığında 20 dakika perfüzyon çözümleri (i) ve (ii) ile perfüzyon sonra devam ( Tablo malzemelerigörmek) 0.2 ml/dk sabit bir hızda.
5. 4 ° C'de radyoopak döküm malzemenin gecede tedavi için izin verir. Sonra yukarıda açıklanan¹⁷olarak kafatası beyin kaldırmak, örnek % 4 İngiltere'de yılın eriyik-e doğru aktarın ve mikro CT tarama kadar örnek 4 ° C'de depolayın.

2. mikro bilgisayarlı tomografi

1. Beyin bir künt anatomik forseps ile bir plastik tüp ortasına yerleştirin. Nesneyi resim alma sırasında taşımak değil emin olmak için örnek daha biraz daha büyük çaplı bir tüp seçin. Gazlı bez tüp kapatmak için kullanın.
2. Bilgisayar-navigasyon-kontrol (CNC) konumlandırma sistemi, nesneyi yatay ekseni döndürüleceğini X-ray kabinde mikro adım motor plastik tüp takın.
3. Alan bakış açısı altında x-ışını radyografi örnekte hizalayın. Maksimum büyütme elde etmek için x-ışını kaynağına mümkün olduğunca yakın nesneyi yerleştirmek ve belgili tanımlık bulmak mümkün olduğunca Uzaklik en üst düzeye çıkarmak.
4. Bir adım ve çekim görüntü Alım Protokolü ile aşağıdaki tarama parametreleri kullanın: set çekim hızı 1 s sinyal-gürültü oranı (SNR) optimize etmek gerilim 80 tüp her projeksiyon için kV (geçerli 38 µA), 1000 projeksiyonlar sonucu 360 ° dönme.
5. RAW veri yeniden inşası için 1024 x 1024 x 1024 voxels yeniden yapılanma yazılımını kullanarak bir matris ile Shepp-Logan filtre uygulama filtre uygulanmış arka projeksiyon algoritma kullanın (bkz. Tablo malzeme). Daha fazla çözümleme için 3 boyutlu görselleştirme yazılımı içine elde edilen DICOM veri alma ( Tablo malzemelerigörmek).

3. 3 boyutlu rekonstrüksiyon kafa içi vasküler ağaç ve gemi birimleri belirlenmesi

Not: İşlevleri hakkında arka plan bilgileri görselleştirme yazılım işlevi Yardımkullanarak bulunabilir.

1. DICOM veri almaişlevini kullanarak görselleştirme yazılımı içine alın.
2. Gemi ağaç Volrenişleviyle görselleştirin. Büyük serebral arterler keskin Anahatlarda tasvir edilmektedir görselleştirme eşik seçin. Deneysel serideki tüm veri kümesi için aynı görselleştirme eşik kullanmak önemlidir.
3. Neredeyse bazal serebral arterler (Willis daire) işleviyle VolumeEdit gemiler imleç çevreleyen incelemek. O zaman hemen hemen çözümlenmesi için gemi segment incelemek. Bu nedenle, vasküler ağaç 3 boyutlu modelini tam olarak tüm küçük dalları ana arterin ayırmak için döndürün. Analiz edilecek gemi kesimi hariç tüm gemileri silmek daha fazla çözümleme için önemlidir.
4. Küme oluşturur görselleştirme eşik için eşik ile Autoskeleton işlevi uygular bir Merkezi-çizgi - SpatialGraphdayalı.
5. Uygula işlevi oluşturmak için SpatialGraphToLineSet bir satır kümesi. Onun tek alt segmentler el ile imleci ile tek alt segmentleri seçip "bölme" tıklayarak ayarla satırını bölmek. Tek alt segmentler birimleri hesaplamak için çok önemli bir adımdır.
6. Tekrar kayma bir grafik oluşturmak için LineSetToSpatialGraph işlevini kullanın.
7. Uzunluk, hacim ve her alt bölüm çapını belirlemek için SpatialGraphStatistics işlevini kullanın. Renk kodlu görselleştirme için işlevini kullanın damar çapı elbette temsil eden SpatialGraphView. "Damar çapı ile karşılıklı olarak ilişkilendirir kalınlığı" için boyama segment ayarlayın. Deneysel serideki tüm veri kümeleri için aynı renk eşlemi seçmek önemlidir.
8. Hangi alt segmentler içinde daha fazla çözümleme dahil edileceğini belirlemek için alt segmentler uzunlukları ekleyin. Bu da çalışmanın iç karotid arter karotis T proksimal 1 mm ve 2.5 mm orta serebral arter karotis T. distal oluşan bir gemi kesimi değerlendirildi Sonra tanımlanmış gemi segment gemi hacmi belirlemek için birimleri ekleyin.

Sonuçlar

3 boyutlu beyin damar ağacının sanal yeniden yapılanma

3-boyutlu yeniden kafa içi vasküler ağaçlar son derece hassas bir damar anatomi (Şekil 1) sağlanan. Doğruluk değerlendirmek için biz çapı tabanlı karşılaştırma olarak belirlenen gemi çapları arasında ve 3 boyutlu sanal rekonstrüksiyonlar 2 anatomik olarak tanımlanmış noktalarda üzerinden yapılacak (1: 1 mm orta serebral arter (MCA), distal yaptı karotis T; 2: 1 mm karotis T distal MCA değil). Gemi çapları mikroskobik belirlenmesi için bir ölçüm ölçek için kalibre bir yüksek çözünürlüklü fotoğraf makinesi (sonsuz X-21, Deltapix) ile DeltaPix Insight yazılımı sürüm 2.0.1 kullanıldı. Bu değerlendirme için 10 beyin örnekleri (5 SAH, 5 sahte) analiz edildi. Bu 5 sahte ameliyat (ameliyat sonrası gün 1 ve 2, sırasıyla öldü SAH grubunun 2 hayvanlar) iken hangi bir SAH, akımıdır 7 12 fareler bir dizi vardı. Kafa içi damar anatomi (mikroskobik belirlenmesi vs sanal imar, doğru bir sanal yeniden inşası gösteren kesin ve neredeyse, belirlenen çapları arasında hiçbir önemli farklılıklar vardı ± Standart hata demek: MCA 150 ± 9 µm vs sol MCA 150 ± 8 µm; yaptı MCA 153 ± 8 µm vs154 ± 9 µm anda, Şekil 2bakın).

SAH ile farelerde serebral vasospasm miktar

Serebral vasospasm ölçmek için (i ses, 1 mm iç karotid arter (ICA) ve 2.5 mm MCA sol ve (ii) damar çapı 2 anatomik olarak tanımlanmış noktalarda (sol ve sağ MCA) oluşan bir önceden tanımlanmış temsilcisi 3.5 mm gemi kesim olduğunu beyin örneklerinde SAH ve sham işletilen hayvanlardan belirlenen (n = 5). Gemi birim SAH sham için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Gemi çapları SAH sham için karşılaştırıldığında daha düşük (MCA yaptı: 140 ± 10 µm vs 160 ± 11 µm, p 0,11; = sağ MCA: 130 ± 13 µm vs 158 ± 16 µm, p < 0,05; bkz. Şekil 3), düzey of önemi sadece analiz için ulaştı doğru MCA var.

Şekil 1. Kafa içi vasküler ağaç sanal inşası. (A) bir temsilci beyin örnek gösterir; (B) hemen hemen karşılık gelen vasküler ağaç yeniden gösterir. (C) renk kodlu sol MCA çapını görselleştirme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Damarlara dijital yeniden inşası doğruluğunu. 3D yeniden oluşturulan beyin örneklerinden kesin kararlı olanlar karşılaştırıldığında ortalama çapı ölçüldü. Veri ortalama ± standart hata ortalamaya gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Gemi hacmi ve damar çapı SAH sonra. (A) karşılaştırma MCA çapları SAH 3D yeniden oluşturulan damarlara itibaren ölçülen ve sham fareler. (B) gemi SAH hacmindeki ve sham fareler. Veri ortalama ± standart hata ortalamaya gösterilir. p < 0.05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Temel SAH araştırma için önemli bir araç fare SAH modellerdir. Serebral vasospasm sık sık deneysel çalışmalar için DCI SAH^9,11' den sonra lider mekanizmaları araştıran bir son nokta olarak kullanılır. Ancak, farelerde serebral vasospasm miktar ya da diğer küçük hayvan modelleri SAH, meydan okuyor. Vasospasm gemi çapları endovasküler perfüzyon ve döküm^7,9,12 sonra tanımlanmış anatomik noktalarda ex vivo belirlenmesi veya çevresi belirlenmesi genellikle, sayısal histolojik olarak tanımlanan gemilerin^10,11bölümleri. Ancak, bu yöntemlerin bazı dezavantajları var: Vasospasm yalnızca tanımlanmış anatomik noktalarda; değerlendirilir vasospasm gemi parçaları komşu değerlendirme kaçış olabilir. Histolojik eserler hatalardan başka bir kaynak mevcut. Ayrıca, değerlendirme oldukça öznel olabilir çünkü tam olarak nerede damar çapı ölçülür araştırmacı tarafından belirlenir.

Amaç bu nedenle serebral vasospasm serebral gemiyi kesimleri kesitsel görüntü veri⁷gemi hacmi hesaplayarak quantifies bir yöntem kurmak oldu. Burada sunulan hacimsel yöntemin en önemli avantajı kesimleri incelenebilir o gemiyi var. Bu bir noktasının nerede damar çapı ölçülür tanımının engeller. Bir daha bütün gemi parçaları değerlendirilmesi o muhtemelen gemi çapları nerede vasospasm daha proksimal ve distal geminin kaçış olabilir tanımlanmış noktalarda belirlenmesi daha vasospasm ölçmek için daha objektif bir parametre armağan avantajdır değerlendirme. Damar çapı bir renk kodu kullanarak dijital gösterimi vasospasm derece sezgisel bir tahmin sağlar. Ayrıca, hacimsel değerlendirme değerlendirme temsilcisi sonuçlarında gösterildiği gibi damar çapı göre vazospastik gemiler arasındaki büyük farklar yol açar. Burada sunulan yöntemiyle elde sanal imar damar anatomi doğru şekilde yansıtır. Bu hangi gemi çap olarak ölçülen ve dijital rekonstrüksiyonlar benzerdi, bir önceki çalışma⁷gözlemleri üreyen temsilcisi serisi değerlendirme tarafından gösterilir. Ancak, avantajları rağmen daha fazla çalışmalar burada sunulan Yöntem vasospasm analiz geleneksel yöntemlerle üstün olup olmadığını değerlendirmek için ihtiyaç vardır.

Bir yöntemi burada sunulan bu mikroskopik analiz döküm beyin örnekleri ya da histolojik Analizi (mikro CT zaman beyin örnek, veri işleme beyin örnek başına 45 dakika başına 90 dakika tarama) göre daha fazla zaman tanıyor kısıtlamasıdır. Ayrıca, mikro CT tarayıcıları kullanılabilirliğini onun uygulama sınırlayabilir. Hayvanlar burada muayene sayısı bu el yazması açıklanan protokol fizibilite göstermek için yeterli idi. Ancak, protokol tedavi çalışmalarında kullanılması gerekiyorsa, hayvan numaraları hesaplanan gerekir gemi birimleri ve çapları beklenen etkileri dayalı. Bu ve diğer çalışmaların fare SAH modelleri kullanarak başka bir sınırlama bu vasospasm kararlı ex vivoolmasıdır. Bu uzunlamasına çalışmalar imkansız temel değerlerini SAH indüksiyon ve farklı zaman noktalarda vasospasm önce araştırmak sağlar. Çalışmalar bunun göstermiştir rağmen manyetik rezonans tomografisi¹⁸, bilgisayarlı tomografi anjiyo¹⁹veya dijital çıkarma kullanarak fare vivo içinde büyük kafa içi gemilerin anatomisi tasvir etmek mümkündür anjiyografi²⁰, bizim bilgi, bu yöntemler henüz kullanılmamış fare SAH modelleri içinde vivoserebral vasospasm analiz etmek. Not, serebral damarlara dijital yeniden serebral vasospasm burada sunulan sonraki hacimsel değerlendirilmesi ile ex vivo mikro CT veriler üzerinde kullanılacak sınırlı değildir. Yüksek çözünürlüklü vasküler çapraz kesit beyin görüntüleme farelerde gelecekte kullanılabilir olacaktır vasospasm in vivohacimsel analizini gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany