שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

Summary

מטרת מאמר זה היא להציג שיטה המאפשרת שחזור תלת-ממדי של העץ כשאבדן בעכברים לאחר מיקרו שחושב טומוגרפיה והנחישות של אמצעי אחסון של מקטעי כל כלי יכול לשמש כדי לכמת vasospasm מוחין ב מודלים מאתר של דימום תת-עכבישי.

Abstract

דימום תת-עכבישי (SAH) הוא תת סוג של שבץ מדמם. Vasospasm המוחית המתרחשת בעקבות הדימום גורם חשוב בקביעת התוצאה החולה, ולכן נלקח לעתים קרובות בתור נקודת קצה של המחקר. עם זאת, במחקרים בעלי חיים קטנים-SAH, כימות vasospasm מוחית היא אתגר גדול. . הנה, שיטה שמחוץ מוצג המאפשר כימות של אמצעי אחסון של כלי השיט כולו מקטעים, אשר יכול לשמש מדד אובייקטיבי לכמת vasospasm מוחי. בשלב הראשון, הליהוק endovascular מוחי להערכת מתבצעת באמצעות סוכן הליהוק ריתוך. לאחר מכן, חתך הרוחב נתונים הדמיה נרכשים על ידי טומוגרפיה מיקרו. השלב הסופי כולל שחזור תלת-ממדי של העץ וסקולרית וירטואלי, ואחריו אלגוריתם לחישוב קווי מרכז ואמצעי אחסון המקטעים הכלי הנבחר. השיטה הביאה הדמייה מאוד מדויקת של העץ כשאבדן מוצגים על-ידי השוואה המבוסס על קוטר של דגימות אנטומי עם שחזורים וירטואליים שלהם. לעומת כלי קטרים לבד, אמצעי האחסון כלי להדגיש את ההבדלים בין vasospastic, הלא vasospastic כלי שמוצג בסדרה של SAH ועכברים המופעלים באמצעות העמדת פנים.

Introduction

דימום תת-עכבישי aneurysmatic (SAH), תת סוג של שבץ מדמם, היא מחלה נפוצה ביחידות טיפול neurointensive. מלבד מוקדם פגיעה מוחית (עבי), אשר כוללת נזק מוחי שנגרם על ידי האירוע המדמם עצמו, עוד גורם חשוב בקביעת התוצאה החולה הוא מתעכב קליפתית (DCI), שהוגדרו על-ידי קלינית הידרדרות דרך לקוי במוח זלוף או אוטם מוחי לא משויך הליכים התערבותית או כירורגי^1,2,3. חשוב המנגנונים תורם DCI הם זאת אולי התחלת כלי גדול-מוחין מצד אחד; מצד שני, תפקוד microcirculatory עם vasospasm של microvessels microthrombosis, ואת איסכמיה הקשורות דיכאון מתפשטת קורטיקלית לשחק תפקיד (נבדקה ב Madonald 2014¹). לכן, אבחון של vasospasm של כלי מוחי גדול חיוני הקלינית, מציג נקודת קצה חשוב במחקרים קליניים וניסויים רבים.

למרות העובדה כי התכונות של vasospasm במודלים SAH מאתר אינן ישירות להעברה לחולה, מאתר אנושית כל דגמי SAH vasospasm קשורים כבר גוברת החשיבות בשנים האחרונות. דגמים אלה SAH הנגרמת על ידי endovascular פילמנט ניקוב^4,5,6,7,8, חיתוך של ספינות cisternal⁹, או הזרקה של דם לתוך CSF^{10 11, ,12}. בניגוד גדול מודלים של בעלי חיים SAH אשר תוכננו באופן מסורתי ללמוד vasospasm¹³, הדגמים מאתר יש היתרון הגדול כי זנים העכברים הטרנסגניים רבים זמינים. זה הופך אותם כלי מצוין ללימוד המנגנונים המולקולריים המוביל vasospasm הבלש הראשי. עם זאת, קביעה של מוחי vasospasm בעכברים הוא מאתגר. זה כי בניגוד מודלים בעלי חיים גדול שבו vasospasm אפשר לבחון תוך שימוש בטכניקות הדמיה קליני, ויוו הדמיה ולנתח מוחית vasospasm בעכברים אינה זמינה עדיין. לכן, vasospasm נקבעת בדרך כלל באמצעות^10,או מקטעים היסטולוגית¹¹ או השלכת מאכל אחרי כלי מוחי-^7,-^9,-¹². לעומת זאת, שיטות אלה יש החיסרון כלי הדם הזה קטרים נבדקים בנקודות מוגדרות בלבד.

בהתבסס על המחקר הקודם⁷, כתב יד זה מציג שיטה אובייקטיבית, ניתוח לשחזור של vasospasm במודל SAH מאתר. השיטה היא בהתאם זלוף, הליהוק של כלי מוחי, לשעבר vivo סריקה מיקרו-CT, שחזור דיגיטלי של כלי עץ, ובעקבות ההערכה של אמצעי אחסון של כל כלי מוחי.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים היו שאושר על ידי הועדה אחראית טיפול בבעלי חיים (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz), מתבצעת על פי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית (TierSchG). כל הישים הבינלאומי, לאומי, המוסדיים הנחיות הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים עקבו אחריך

במחקר זה, שימשו זכר עכברים C57BL6 (גיל 10-12 שבועות). בקצרה, דימום תת-עכבישי הסחרור הושפע endovascular ניקוב פילמנט תחת הרדמה עם איזופלוריין. העורק החיצוני השמאלי הוכן בניתוח. לאחר מכן, נימה היה מוכנס לתוך העורק תרדמני חיצוני, מתקדם intracranially דרך העורק אשר היה מחורר ב בעורק T, גרימת תת עכבישי. עלייה בלחץ תוך גולגולתי נלקח כמחוון של endovascular מוצלח לחירור. פרוטוקול מפורט endovascular פילמנט ניקוב מודל של SAH בעכברים כבר פורסם על-ידי אחרים^8,14.

1. זלוף, הליהוק Endovascular

1. מחקר זה בוצע זלוף 72 שעות לאחר אינדוקציה של SAH. לגרום הרדמה על ידי הזרקת intraperitoneally 5 µg/g הגוף משקל (bw) midazolam, 30 פנטניל bw ng/g ו- 0.5 medetomidin bw µg/g. להמשיך רק לאחר לרמה הרדמה מספקת הגיעה, אשר אושר על ידי העדר תגובות לגירויים כאב.
2. פתיחת בית החזה, לנקב החדר השמאלי עם בצינורית 21G, פתח אטריום ימין ולאחר מלחציים העורקים כפי שמתואר במקום¹⁵.
3. ביצוע של זלוף transcardiac באמצעות את הפתרונות הבאים: (i) Dulbecco של פוספט Buffered מלוחים המכילים MgCl₂ CaCl₂ ב- pH 7.4 עם גלוקוז 1 g/L, ו (ii) 4% paraformaldehyde פתרון.
   1. להתחיל את הטפטוף את הפתרון (i) למשך 2 דקות ולהמשיך עם פתרון (ii) במשך 4 דקות.
   2. להשרות את הפתרונות בטמפרטורה של 37 ° C ו באמצעות משאבה שבשליטת הלחץ בקצב משתנה זלוף כדי perfuse ובלחץ קבוע של 70 מ מ כספית, אשר נמצאה להיות הלחץ זלוף אופטימלית כדי לנתח vasospasm עכברים¹⁶. להימנע אובדן הלחץ בעת החלפת מהפתרון (i) פתרון (ii).
4. אחרי זלוף עם פתרונות (i) ו- (ii), ממשיכים זלוף במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם יציקה ריתוך (ראה טבלה של חומרים) בקצב קבוע של 0.2 ml/min.
5. לאפשר לריפוי של החומר הליהוק ריתוך ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ואז להסיר במוח הגולגולת כפי שתואר לעיל¹⁷, להעביר את הדגימה לפתרון PFA 4% ולאחר לאחסן את הדגימה ב 4 ° C עד סריקות CT מיקרו.

2. מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת

1. מקום המוח במרכז של צינור פלסטיק עם מלקחיים אנטומי בוטה. בחר צינור בקוטר גדול מעט יותר הדגימה כדי להבטיח כי האובייקט לא זזה במהלך ייבוא תמונות. להשתמש גזה כדי לסגור את הצינור.
2. לצרף את צינור פלסטיק המנוע מיקרו-לדרוך על המחשב-מנווט-פקד (CNC) מערכת המיקום לבקתה רנטגן, שבו מסובבים את העצם סביב צירו האופקי.
3. יישר המדגם בתצוגה השדה-של-תחת רדיוגרפיה רנטגן. כדי להשיג את רמת ההגדלה מקסימלי, למקם את האובייקט קרוב ככל האפשר אל מקור רנטגן ולהגדיל את המרחק הגלאי ככל האפשר.
4. להשתמש בפרוטוקול רכישה שלב-ולצלם תמונה עם הפרמטרים הבאים הסריקה: להגדיר זמן החשיפה ל- 1 s כל השלכה למטב את יחס אות לרעש (SNR), צינור מתח 80 kV (µA 38 הנוכחי), סיבוב 360 מעלות וכתוצאה מכך השלכות 1,000.
5. עבור שחזור של נתוני גלם להשתמש באלגוריתם הקרנה אחורי מסוננים החלת המסנן שפ-לוגן עם מטריצה של 1024 x 1024 x 1024 voxels באמצעות שחזור תוכנה (ראה טבלה של חומרים). לצורך ניתוח נוסף לייבא את הנתונים המתקבלים DICOM לתוך תוכנת ויזואליזציה תלת-ממד (ראה טבלה של חומרים).

3. תלת-ממדי שחזור של העץ וסקולרית תוך-גולגולתי והנחישות של אמצעי אחסון כלי

הערה: ניתן למצוא חומר רקע על הפונקציות של התוכנה ויזואליזציה באמצעות הפונקציה לעזור.

1. לייבא נתוני Dicom לתוך תוכנת ויזואליזציה באמצעות הפונקציה ייבוא.
2. דמיינו את ספינת עץ עם הפונקציה Volren. לבחור את הסף ויזואליזציה כך העורקים המוחיים הגדולים מתוארים בחלוקות חדה. חשוב להשתמש הסף ויזואליזציה זהה עבור כל ערכות הנתונים השייכים הסדרה ניסיוני.
3. כמעט לנתח את העורקים המוחיים הבזליים (מעגל של ויליס) עם הפונקציה VolumeEdit על-ידי תחימת כלי עם הסמן. ואז כמעט לנתח על קטע כלי כדי להיות מנותח. לכן, לסובב את מודל תלת-ממדי של העץ כלי הדם כדי דווקא להפריד בין כל הענפים קטן של הרחוב הראשי. זה חיוני לניתוח נוסף למחוק את כל כלי פרט קטע כלי כדי להיות מנותח.
4. להחיל את הפונקציה Autoskeleton עם סף מוגדר סף ויזואליזציה, אשר מפיק מרכז-קו -מבוסס SpatialGraph.
5. לאחר מכן, להחיל בפונקציה SpatialGraphToLineSet כדי ליצור קו סט. לחלק את הקו המקשטים את פלחי משנה יחיד על ידי באופן ידני בחירת את פלחי משנה יחיד עם הסמן ולאחר לחיצה על "פיצול". שלב זה חיוני על מנת לחשב את נפחי פלחי משנה יחיד.
6. השתמש בפונקציה LineSetToSpatialGraph כדי ליצור גרף המרחבי שוב.
7. השתמש בפונקציה SpatialGraphStatistics כדי לקבוע את אורך, נפח, קוטר של כל פלח משנה. להמחשת בצבעים המייצגים את הקורס מקוטר כלי השיט, השתמש בפונקציה SpatialGraphView. הגדר מקטע צביעה כדי "עובי", אשר עולה בקנה אחד עם קוטר הכלי. חשוב לבחור את המפה צבע זהה עבור כל datasets השייכים הסדרה ניסיוני.
8. להוסיף אורך פלחי משנה כדי לקבוע אילו פלחי משנה כדי להיכלל בניתוח נוסף. במחקר הנוכחי אנו מוערכים קטע כלי בהיקף של 1 מ מ העורק הפרוקסימלית של בעורק T ו- 2.5 מ מ של עורק המוח התיכון דיסטלי של בעורק טי לאחר מכן להוסיף את אמצעי האחסון כדי לקבוע את נפח הכלי קטע כלי מוגדרת.

תוצאות

שחזורים וירטואליים של העץ תלת-ממדי וסקולרית תוך-גולגולתי

העצים וסקולרית תוך-גולגולתי 3-ממדית המשוחזרת סיפק כלי הדם ומדויקים של האנטומיה (איור 1). כדי להעריך את רמת הדיוק, ביצענו מבוסס-קוטר השוואה בין כלי השיט קטרים נקבע ברמה המיקרוסקופית, מן המרתף וירטואלי תלת-ממדי בנקודות מוגדרות מבחינה אנטומית 2 (1: שמאל בעורק האמצעי (MCA) 1 מ"מ דיסטלי של עורק הצוואר T; 2: נכון MCA דיסטלי של בעורק T 1 מ"מ). לקביעת מיקרוסקופיים כלי קטרים, נעשה שימוש ברזולוציה גבוהה המצלמה (אינפיניטי X-21, Deltapix) עם תובנה DeltaPix תוכנה גירסה 2.0.1 המכויל לפי מידה מיקרומטר. עבור הערכה זו, נותחו 10 דגימות המוח (5 SAH, 5 דמה). אלה היו מתוך סדרה של עכברים 12, 7 מהם SAH היה המושרה, בעוד 5 עברה ניתוח דמה (2 חיות של קבוצת SAH מת בימים שלאחר הניתוח 1 ו- 2, בהתאמה). היו אין הבדלים משמעותיים בין הקוטר נקבע ברמה המיקרוסקופית, כמעט, המציין של שחזורים וירטואליים מדויק של האנטומיה וסקולרית תוך-גולגולתי (נחישות מיקרוסקופיים לעומת שחזורים וירטואליים, אומר שגיאה סטנדרטית ±: עזב MCA 150 ± 9 מיקרומטר לעומת שמאל MCA 150 ± 8 מיקרומטר; נכון MCA 153 ± 8 מיקרומטר לעומת154 ± 9 מיקרומטר, ראה איור 2).

כימות vasospasm מוחי אצל עכברים עם SAH

כדי לכמת vasospasm מוחי, היו (i) את עוצמת הקול של קטע כלי מוגדרת מראש נציג 3.5 מ מ, בהיקף של 1 מ מ העורק הפנימי ביותר (ICA) ו- 2.5 מ מ MCA מימין, וכן (ii) את כלי הקיבול קטרים בנקודות מוגדרות מבחינה אנטומית 2 (שמאל וימין MCA) נקבע דגימות המוח SAH וחיות המופעלים דמה (n = 5). האחסון הקיבול היה נמוך באופן משמעותי ב- SAH בהשוואה דמה (36 ± 4 nL לעומת 71 ± 9 nL, p < 0.05). כלי קטרים היו נמוכות ב- SAH בהשוואה דמה (עזב MCA: 140 מיקרומטר ± 11 לעומת 160 ± 10 מיקרומטר, p = 0.11; נכון MCA: 130 מיקרומטר ± 16 לעומת 158 ± 13 מיקרומטר, p < 0.05; ראו איור 3), ואילו המשמעות של רמת הושגה רק עבור analys יש MCA הנכון.

איור 1. שחזורים וירטואליים של העץ וסקולרית תוך-גולגולתי. (א) מציג מדגם נציג המוח; (B) מראה המתאים כמעט שיחזר עץ כלי הדם. (ג) מקודדים ויזואליזציה של הקוטר של השמאל MCA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . הדיוק של השחזור הדיגיטלי של להערכת. קטרים מתכוון למדוד מדגימות המוח המשוחזרת 3D לעומת אלו נקבעים ברמה המיקרוסקופית. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 . קיבול ונפח קוטר הכלי לאחר SAH. (א) השוואה של MCA קטרים נמדד מאמצע להערכת המשוחזרת תלת-ממד ב- SAH, שאם עכברים. (B) הקיבול של עוצמת SAH, שאם עכברים. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מאתר SAH הן כלי חשוב למחקר SAH בסיסי. מוחי vasospasm משמש לעתים קרובות נקודת קצה במחקרים ניסיוני לחקור את המנגנונים המוביל DCI אחרי SAH^9,11. עם זאת, כימות של מוחי vasospasm בעכברים או דגמים אחרים בעלי חיים קטנים של SAH הוא מאתגר. בדרך כלל, לכמת vasospasm שמחוץ נחישות של כלי השיט קטרים בנקודות אנטומי מוגדרים לאחר endovascular זלוף, הליהוק^7,9,12 או על ידי קביעת היקף כלי מוגדרת על היסטולוגית סעיפים^10,11. עם זאת, שיטות אלה יש כמה חסרונות: Vasospasm מוערך רק בנקודות מוגדרות אנטומי; vasospasm המדינות השכנות מקטעי כלי עשוי לברוח הערכה. חפצים היסטולוגית להציג מקור נוסף של שגיאות. יתר על כן, האבחון יכול להיות סובייקטיבי למדי, בגלל המיקום המדויק שבו נמדד קוטר הכלי נקבעת על-ידי החוקר.

המטרה היה לכן להקים שיטה מכמתת vasospasm מוחית על ידי חישוב נפח כלי קיבול מוחי כל מקטעי חתך הרוחב נתונים הדמיה⁷. היתרון החשוב ביותר של השיטה הנפחי המובאת כאן היא כלי הדם. הזה כולו מקטעים תוכל להיבדק. זה מונע את הצורך של הגדרה של נקודה שבה נמדד קוטר הכלי. יתרון נוסף של הערכת כלי כל מקטעי היא כי זה ככל הנראה מציג פרמטר אובייקטיבי יותר לכמת vasospasm מאשר קביעת כלי קטרים בנקודות מוגדרות איפה vasospasm של כלי השיט צינתור או דיסטלי יותר לברוח הערכה. ייצוג דיגיטלי של קטרים הכלי בעזרת קוד צבע מאפשר הערכת מידת vasospasm אינטואיטיבי. יתר על כן, הערכת נפחי מוביל הבדלי כלי vasospastic לעומת הערכה של קטרים כלי כמוצג בתיבה על התוצאות נציג. שחזור וירטואלי מושגת עם השיטה המובאת כאן משקף את כלי הדם האנטומיה במדויק. זה מוצג על ידי הערכת הסדרה נציג, אילו כלי קטרים נמדדת ברמה המיקרוסקופית, מן המרתף דיגיטלי היו דומים, מתרבה התצפיות של המחקר הקודם⁷. עם זאת, למרות היתרונות שלה, עוד יותר נדרשים מחקרים כדי להעריך אם השיטה המובאת כאן עדיפה בשיטות המקובלות של vasospasm ניתוח או לא.

מגבלה של השיטה המובאת כאן היא כי היא מעניקה זמן רב יותר לעומת ניתוח מיקרוסקופי casted מוחי לדוגמאות או ניתוח היסטולוגית (מיקרו CT סריקה זמן 90 דקות לכל דגימה מהמוח, עיבוד נתונים 45 דקות לכל דגימה מהמוח). יתר על כן, הזמינות של סורקי CT מיקרו עשויה להגביל את היישום שלה. מספר החיות לבחון כאן היה די כדי להוכיח את הכדאיות של הפרוטוקול המתואר בכתב היד. עם זאת, אם הפרוטוקול אמור לשמש בלימודי טיפול, חיה המספרים צריך להיות מחושב בהתבסס על ההשפעות הצפויות באמצעי אחסון כלי הקיבול של קטרים. הגבלה נוספת של זה ומחקרים נוספים באמצעות מודלים SAH מאתר הוא ש-vasospasm הזה הוא נחוש ex-vivo. זה עושה את האורך מחקרים בלתי אפשרי לחקור ערכים של תוכנית בסיסית לפני SAH אינדוקציה ו- vasospasm בנקודות זמן שונות. למרות מחקרים הוכיחו שזה אפשרי לתאר את האנטומיה של כלי תוך-גולגולתי גדול של עכברים ויוו באמצעות טומוגרפיה תהודה מגנטית¹⁸, טומוגרפיה מסתמים¹⁹או חיסור דיגיטלי עדיין לא שימשו מסתמים²⁰, שיטות אלה, לידע שלנו, ולנתח מוחית vasospasm ב- SAH מאתר מודלים vivo בתוך. ראוי לציין, מחדש דיגיטלי של להערכת מוחי עם הערכת נפחי עוקבות vasospasm מוחי המובאת כאן אינה מוגבלת לשימוש ב- ex-vivo מיקרו CT נתונים. אם הדמיה ברזולוציה גבוהה בכלי הדם במוח סקציות קרוס בעכברים צריך להיות זמין בעתיד, זה יכול לשמש כדי לבצע ניתוח volumetric של vasospasm ויוו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany