JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى وصف أسلوب استنساخه للجمع بين فصل البشرية pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية وأستروسيتيس معا في 3D المجال كوكولتوريس، الحفاظ على هذه المجالات في ظروف العائمة مجاناً، وفي وقت لاحق قياس نشاط الدائرة متشابك المجالات إيمونواناليسيس وتسجيلات مولتيليكترودي الصفيف.

Abstract

حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات الصلة لدراسة الدماغ البشري. التكنولوجيا الناشئة واحد للتصدي لهذه المشكلة هو استخدام الأبعاد (3D) الخلايا العصبية الثقافات الثلاث، ووصف 'أورجانويدس' أو 'الماغنيسيوم'، للحفاظ على المدى الطويل للتفاعلات بين الخلايا، بما في ذلك جزيئات الالتصاق خارج الخلية. ومع ذلك، هذه الأنظمة الثقافة مضيعة للوقت ولا يتم إنشاؤه بشكل منهجي. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سرعة واستمرار إنتاج 3D كوكولتوريس من الخلايا العصبية وأستروسيتيس من البشر pluripotent الخلايا الجذعية. فصل astrocytes أولاً، قبل متمايزة وفروعه الخلايا العصبية وتحسب. بعد ذلك، يتم دمج الخلايا في مجال تشكيل الأطباق مع مثبط رو-كيناز وفي نسب معينة لإنتاج مجالات حجم استنساخه. بعد عدة أسابيع من الثقافة كمجالات عائمة، وأخيراً كوكولتوريس (الكويكبات) مقطوع ل immunostaining أو مطلي على صفائف مولتيليكترودي لقياس كثافة متشابك وقوتها. وبصفة عامة، فمن المتوقع أن هذا البروتوكول سوف تسفر عن المجالات العصبية 3D عرض علامات نوع الخلية الناضجة مقيدة، وتشكل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية ومعرض نشاط الشبكة متشابك عفوية الاندفاع. معا، يسمح هذا النظام فحص المخدرات والتحقيقات في آليات للمرض في نموذج أكثر ملاءمة بالمقارنة مع ثقافات أحادي الطبقة.

Introduction

أستروسيتيس نوع خلية الدبقية عالية وفيرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع مجموعة متنوعة من المسؤوليات الوظيفية خارج نطاق الدعم الهيكلي. من خلال إفراز العوامل سينابتوجينيك للذوبان ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، المعونة astrocytes في إنشاء وتجميع نهايات ناضجة خلال التنمية1. كما تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على الصحة واللدونه من الاشتباكات العصبية إلى خارج الخلية إشارات2،3،،من45، والإسهام في تحقيق الاستقرار الطويل الأجل من التماثل الساكن البيئات التي تنظم البوتاسيوم خارج الخلية وغلوتامات، فضلا عن إفراز ركائز الطاقة و ATP6،،من78. وأخيراً، يمكن أن تسهم إسهاما كبيرة بالتأثير على تيارات اكستراسينابتيك9، وغير مباشر يمكن أن تؤثر في النشاط من خلال أنواع الخلايا الأخرى مثل تعزيز مييلينيشن10. الأهم من ذلك، لأنه شذوذ أو خلل وظيفي من أستروسيتيس يمكن أن يؤدي إلى العديد من المتلازمات النمائية العصبية وأمراض الأعصاب الكبار، هناك حاجة واضحة لتشمل astrocytes جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية داخل هندسة الشبكات العصبية من أجل تحسين نموذج للبيئة الدماغ الذاتية. سمة لا يتجزأ من أستروسيتيس هو قدرتهم على النموذج التفاعلات الدينامية مع نهايات الخلايا العصبية1،،من1112. في حالة عدم إطلاق، تشكل الخلايا العصبية لعدد محدود من نقاط الاشتباك العصبي، بصورة عامة كما تفتقر إلى النضج الوظيفي13.

Astrocytes البشرية عرض الخصائص المورفولوجية والنسخي والوظيفية – مثل الزيادة في حجم وتعقيد الجينات التفريع، فضلا عن إبلاغها – التي لا يرد موجز لها في القوارض12،14، 15. ونتيجة دراسات استخدام الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك)-مشتقة من الخلايا العصبية وقد تصبح مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لدراسة الأمراض المتصلة بالجهاز العصبي المركزي في المختبر أثناء تطوير علاجات جديدة ونماذج الضرر ونماذج الثقافة16 ،17. وعلاوة على ذلك، تسمح هبسكس دراسة تشكيل المشبك البشرية ووظيفة دون الحاجة للأنسجة الابتدائية18،19.

حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات صلة من الدماغ البشري. وهناك حاجة إلى منبر مناسب الخص شبكاته متشابك مع الدقة العالية وإمكانية تكرار نتائج. في الآونة الأخيرة، برز اهتمام في إنتاج نظم الثقافة 3D (على نطاق واسع يعرف باسم 'أورجانويدس'، 'الماغنيسيوم'، أو 'ميني العقول')20 نموذج معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لهياكل على المستويين الخلوي والكلى. الاحتفاظ الثقافة 3D نظم إدارة المحتوى في المؤسسة وخلية خلية التفاعلات التي تكون عادة غائبة أو محدودة خلال كوكولتوري 2D نموذجية نماذج21،22. توجد وفرة تقنيات استزراع الماغنيسيوم العصبية 3D24،،من2325؛ بيد كثيرة تتطلب فترات طويلة من الثقافة (أشهر إلى سنوات) للتنمية عفوية والحفاظ على طبقة، مع المستخدم نستعرض القليل جداً من التحكم في الإخراج.

هنا، نحن توضيح أسلوب منهجي لسرعة واستمرار التفاعلات العصبية بيونجينير بين أنواع متعددة من الخلايا (الخلايا العصبية قبل متمايزة و astrocytes) مستمدة من هبسكس بتجميع الخلايا في مجال كوكولتوريس ('الكويكبات')26 أن الخص التعقيدات الخاصة بالإنسان المورفولوجية في 3D. يولد هذا الجهاز العصبي عالي الكثافة موزعة بالتساوي المخططات العصبية التي تأخذ على خصائص ناضجة مع مرور الوقت ويمكن فحص أو جزيئي في طريقة الفائق. علينا أن نظهر للمرة الأولى أن أستروسيتيس البشرية الحث على نشاط الشبكة متشابك الاندفاع في هذه كوكولتوريس ثلاثي الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا البروتوكول لا يمكن تكييفها بسهولة لإنشاء مجالات ذات أحجام مختلفة، الاستفادة من الخلايا المحددة لمختلف الهويات الإقليمية من الجهاز العصبي المركزي، ودراسة التفاعلات بين العديد من أنواع الخلايا الأخرى كما هو مطلوب.

Protocol

1-الخلية الثقافة وإعداد كاشف

ملاحظة: يتم كتابة البروتوكولات في هذا القسم بالترتيب الذي تظهر به في البروتوكول التمييز (المادة 2). انظر الجدول للمواد اللازمة للمواد وإعداد النشرة المصورة.

  1. إعداد لوحات المغلفة للخلية والثقافة.
    1. تمييع الحل طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) مع وسائط الإعلام DMEM/F12 لإعداد 1 ملغ/مل الحل الأسهم. الكوة ECM المخفف الأسهم الحل في أنابيب مخروطية الشكل 30 مل 3 كل وتخزينها مباشرة في-20 درجة مئوية. لإيجاد حل عملي، ريسوسبيند 3 مل أسهم ECM إلى 33 مل مبردة مسبقاً وسائل الإعلام DMEM/F12، يصل الحجم الإجمالي لمل 36 لتركيز 80 ميكروغرام/مل.
    2. معطف 1 مل كل من صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا مع برنامجي عمل الحل جيدا. إضافة مل 1 إضافية DMEM/F12 كل جيدا (إذا لزم الأمر) التأكد من أن سطح البئر مغطى تغطية كاملة. تسمح الخلية 6-جيدا المغلفة ألواح الثقافة للجلوس في درجة حرارة الغرفة على الأقل 1 ساعة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: قد تخزين لوحات المغلفة في الحاضنة أو عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. إعداد صيغ وسائل الإعلام، وعوامل النمو والجزيئات الصغيرة.
    1. إعداد 500 مل من البشر pluripotent الخلايا الجذعية (هبسك) المتوسط27، إضافة 20 x وملاحق x 500 وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    2. إعداد 500 مل من العصبية المتوسطة (NM)، إضافة الهيبارين بتركيز نهائي 2 مغ/مل، 1 x حل المضادات الحيوية/فطري، 1 x B27 الملحق أو الملحق x N2 1 إلى 500 مل زجاجة من DMEM/F12 مع الملحق لام الجلوتامين كما سبق مفصلاً28.
    3. لإعداد من 10 ملم (1، 000 x) الأسهم الحل من Y27632 المانع رو-كيناز (Y)، وإضافة 10 ملغ مسحوق إلى 3 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS). فلتر تعقيم، قاسمة، وتخزينها في-20 درجة مئوية. استخدم في تركيز عامل 10 ميكرون في وسائل الإعلام.
    4. لإعداد من عيار 20 ملم (10، 000 x) الأسهم حل SB431542، وإضافة 10 ملغ مسحوق إلى 1.3 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). إعداد 2 مم (1، 000 x) الأسهم حل DMH1، وإضافة 10 ملغ مسحوق إلى 13.1 مل من [دمس]. فلتر تعقيم، قاسمة، وتخزين كل حل في-20 درجة مئوية. استخدم بعضها في تركيز عمل 2 ميكرومتر في وسائل الإعلام (شمال البحر الأبيض المتوسط + SB431542 + DMH1).
      ملاحظة: يوصي هذا البروتوكول 2 ميكرومتر العامل تركيزات لكلا SB431542 و DMH1 استناداً إلى29 تفيد بأن تركيز هذا يعزز فعالية تعريفية العصبية من هبسكس لدينا ملاحظات وتقارير من جهات أخرى. وكانت تركيزات أعلى أيضا الإبلاغ عن30. بالإضافة إلى ذلك، مع وسائل الإعلام البديلة، كما ثبت أن الجزيئات الصغيرة ليست ضرورية للتحويل العصبية عالية31. وهكذا، تركيزات العامل سوف تختلف تبعاً للبيئات ثقافة الخلية البديلة، وينبغي اختبار التركيزات المثلى من الباحثين من الأفراد.
    5. إعداد فردية 100 ميكروغرام/مل (10، س 000) إضافة حلول الأسهم من عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية-2 (FGF2)، وعامل نمو البشرة (لو) 1 ملغ لكل منها إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني + 0.1% جيش صرب البوسنة. لو الكوة و FGF2 الأسهم الحلول إلى 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية. استخدم بعضها في تركيز عامل 10 نانوغرام/مل في وسائل الإعلام؛ سبيل المثال، إضافة 5 ميليلتر لو و 5 ميليلتر FGF2 إلى 50 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط (شمال البحر الأبيض المتوسط + لو FGF2).
    6. لإعداد حل أسهم الدوكسي هيدروكلوريد (دوكس)، أولاً حل مسحوق في [دمس] إلى 100 مغ/مل وتخزينها في-20 درجة مئوية. كذلك تمييع أنه جعل من 2 مغ/مل (1، 000 x) الأسهم الحل في برنامج تلفزيوني ومخزن في-20 درجة مئوية. استخدام 2 ميكروغرام/مل العامل تركيز في وسائل الإعلام؛ مثلاًإضافة 50 ميليلتر دوكس إلى 50 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط (شمال البحر الأبيض المتوسط + دوكس).
      ملاحظة: لا إعادة تجمده الحلول بعد ذوبان الجليد.

2-توليد "المخططات العصبية" من "البشرية التي يسببها Pluripotent الخلايا" (هبسكس)

ملاحظة: ينبغي الإبقاء على جميع الثقافات الخلية في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تمسك هذه الثقافات في مستويات الأكسجين في الغرفة، ولو قد يستفاد من المستويات الأدنى.

  1. إنشاء والحفاظ على موروث أستروسيتي (هاستروس) من هبسكس.
    ملاحظة: هذا القسم يقدم بروتوكول تمايز موجزة ومبسطة. للحصول على وصف مفصل (مع تشكيل هيئة امبريويد، واختيار روزيت وخطوات الزخرفة الإقليمية) تشير إلى البروتوكول هو موضح سابقا28 (الشكل 1A، منقط مربع أخضر).
    1. مجموعات البذور من هبسكس (الشكل 1B) على لوحات 6-جيدا المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة (راجع الخطوة 1، 1) مع 2 مل هبسك المتوسطة + Y في البئر. تغذية الخلايا الجذعية كل يوم حتى وهم حوالي 50% المتلاقية ومقسمة حسب الحاجة.
      1. لتقسيم هبسكس، إضافة 1 مل كاشف باساجينج إلى الآبار ونضح بعد إضافة 1 مل متوسطة هبسك الخلايا إينكوباتي 1 كحد أدنى في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق،، وتقسيم المجاميع 01:10 على الآبار المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة الجديدة في 2 مل هبسك المتوسطة + Y في بئر.
    2. الحفاظ على الخلايا الجذعية حتى وهم حوالي 50% روافد، ثم تغيير الوسائط لشمال البحر الأبيض المتوسط + SB431542 + DMH1 للحث على تمايز العصبية (يوم 0). عندما تكون الخلايا حوالي 95% روافد، 1:6 تقسيم آبار جديدة المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة في الأجل المتوسط نفسها.
    3. في يوم 14، ننأى بالخلايا مع الحل مفرزة ونقل إلى قارورة غير المغلفة مع Y لتشجيع تشكيل المجاميع.
      ملاحظة: إضافة Y يستخدم لتشجيع تشكيل خلية البقاء على قيد الحياة والمجال لكن لا يتم تضمين أثناء كل تغذية.
    4. لتوليد المتكفل الخلايا العصبية والخلايا العصبية (هنيورونس)، استخدم هذه الخلايا اليوم-14 كما هو موضح أدناه. وبدلاً من ذلك، تستخدم هذه الخلايا في نقاط زمنية لاحقة من ثقافات أحادي الطبقة أو المجال قبل نضوج الخلايا العصبية يحدث أو يبدأ جليوجينيسيس.
      ملاحظة: بشكل افتراضي، يعطي هذا البروتوكول astrocytes الظهرية القشرية. ومع ذلك، يمكن تحديد أنواع فرعية astrocyte إقليمياً بإضافة الزخرفة مورفوجينس إذا رغبت في28،،من3233. ويمكن إضافة حمض الريتينويك (RA) كوداليزي الخلايا في الحبل الشوكي طرية تعمل، بينما القنفذ سونيك (SHH)، مؤثر (تبلد)، أو بورمورفاميني سوف تنتج تعمل البطني.
    5. لتوليد المتكفل astrocyte وأستروسيتيس في المجاميع 3D تشكلت عفويا (هاستروسفيريس)، قم بالتبديل إلى شمال البحر الأبيض المتوسط + لو FGF2 وتغذية أسبوعيا (أو كلما دعت الحاجة لضمان استقرار الأس الهيدروجيني) كما سبق مفصلاً34.
      1. بلطف ننأى المجاميع هاسترو مع مفرزة الحل عند مراكز داكنة تظهر وإزالة المجالات التي توليها تلقائياً. كسر المجالات بلطف مرة واحدة في أسبوع للحفاظ على المجال الصحي وتجنب النوى نخرية.
        ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق للمعاملة مع مفرزة الحل.
      2. بعد 4-6 أشهر للتوسع، تأكيد هوية الخلية وأما تجميد في المتوسطة للواسمات (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة) أو تخزين بديل الشروط للحفاظ على المدى الطويل في النتروجين السائل، أو استخدام فورا التجريب.
    6. لإذابة الجليد في أسهم مجمدة من هاستروسفيريس، بسرعة ذوبان الجليد قنينة في درجة حرارة الغرفة، نقل محتويات الأنبوبة المخروطية فارغة 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 1 بعناية نضح المادة طافية ويغسل مع DMEM/F12، وتكرار لما مجموعة يغسل اثنين الخطوات. إضافة إلى قارورة T25 بحجم إجمالي 6 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط لو + FGF2 + Y (أو الارتقاء بحسب الحاجة).
  2. إنشاء والحفاظ على الخلايا العصبية إيندوسيبلي (إينيورونس) من هبسكس.
    1. هبسكس البذور المحورة وراثيا (مع التحوير نيوروجينين الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي مستقرة 235) على ألواح 6-جيدا المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة مع 2 مل هبسك المتوسطة + Y في البئر (كما هو موضح أعلاه لخطوط غير المعدلة وراثيا). تغذية اليومية مع 2 مل من وسائل الإعلام كل بئر حتى أنهم على استعداد لرفع في كونفلوينسي 70%. تقسيم الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
    2. عندما تكون الخلايا حوالي 35% المتلاقية، أضف نانومتر + دوكس للحث على التمايز في إينيورونس. الحفاظ على كثقافة أحادي الطبقة مع شمال البحر الأبيض المتوسط + دوكس لمدة يومين قبل المتابعة إلى الخطوة 3، 2.
      ملاحظة: الخلايا سيتم الانتقال إلى الخلايا العصبية المتكفل ولكن لن بعد تمديد نيوريتيس (الشكل 1).

3-إعداد وصيانة كوكولتوريس مجال ثلاثي الأبعاد

  1. فصل هاستروس من مجاميع ثلاثية الأبعاد في تعليق (كما هو موضح في الخطوة 2.1.5.1).
  2. ننأى هنيورونس أو إينيورونس من أحادي الطبقة 2D.
    1. قم بإزالة الوسائط من لوحة 6-جيدا وإضافة 500 ميليلتر من حل مفرزة لكل منها أيضا يحتوي على ثقافات أحادي الطبقة. احتضان في 37 درجة مئوية لإضافة 5 كحد أدنى بلطف 2-3 مل DMEM/F12 لإزالة الخلايا المرفقة.
    2. جمع الخلايا ووسائل الإعلام في 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز 1 دقيقة Aspirate المادة طافية، أضف 1 مل وسائط جديدة، و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً برفق مع ميكروبيبيتي ميليلتر 1,000 لتحقيق تعليق خلية مفردة.
  3. النموذج ثلاثي الأبعاد مجالات استخدام لوحات الثقافة ميكروويل.
    1. إعداد لوحة عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الشطف المضادة الانضمام إلى كل من لوحة ميكروويل جيدا. الطرد المركزي لوحة في 2,000 س ز لأدنى 5 Aspirate الشطف الحل، وإضافة 1 مل من DMEM/F12 لكل بئر يغسل، ونضح مرة أخرى.
      ملاحظة: تأكد دائماً أنه متوازن الطرد المركزي أثناء الاستخدام.
    2. عد كل نوع من الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية. إضافة نسبة المرجوة من هاستروس منفصلان وهنيورونس أو إينيورونس لكل بئر في إجمالي حجم 2 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط + Y (تشمل دوكس إذا استخدمت إينيورونس). الطرد المركزي لوحة في 100 x ز لمدة 3 دقائق والعودة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: تتضمن لوحات ميكروويل 24-جيدا (انظر الجدول للمواد) ميكروويلس 300 كل بئر. إضافة الحد أدنى من 6 × 105 خلايا (بالنسبة لمجالات 2 × 103 خلايا كل) وبحد أقصى 6 × 106 خلايا (بالنسبة لمجالات 2 × 104 خلايا كل) في 2 مل من وسائل الإعلام كل بئر. لمجالات قابلة للاستمرار بكثافة محددة داخل هذا النطاق، استخدام كمية محددة من الخلايا والقسمة على 300 لحساب عدد الخلايا في كل مجال. كما يمكن استخدام البديل مجال تشكيل أساليب وأدوات إذا رغبت في ذلك. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للنطاقات مقبولة من كثافة الخلية.
    3. السماح بتجميع ذاتي في المجالات كثيفة معبأة داخل لوحات ميكروويل خلال الأيام القادمة 2 (الشكل 2A) الخلايا. استبدال وسائط 50% إذا هو اصفرار الثقافة.
      ملاحظة: تبادل الوسائط فقط نصف و "الماصة؛" بلطف عند إزالة وإضافة وسائل الإعلام كي لا تخل بالمجالات. المجالات قد ترفع من ميكروويلس والصمامات جنبا إلى جنب مع قوة أعلى.
    4. وبعد يومين، بلطف إزالة مجالات من ميكروويلس مع ميكروبيبيتي 1,000 ميليلتر (الشكل 1). طفيفة تطبيق القوة على الجزء السفلي من ميكروويلس مع وسائل الإعلام لإزالة أي مجالات إضافية يجري التقيد بها. تتيح مجالات تسوية في أنبوب مخروطي 15 مل ونضح وسائل الإعلام القديمة، وإضافة وسائط جديدة.
  4. إعداد نظام مفاعل حيوي قارورة زر الزيادة والنقصان لتشكيل مجالات 3D.
    1. تنظيف سطح صفيحة إثارة المغناطيسية مع الإيثانول 70%، ووضعه في حاضنة ثقافة خلية. اﻷوتوكﻻف قوارير غزل الفردية لتعقيم.
    2. إضافة المجالات مع الحد أدنى من وسائل الإعلام 50 – 60 مل لكل قارورة زر الزيادة والنقصان (الشكل 1، اقحم). وضع في قارورة على لوحة مغناطيسية إثارة تعيين 60 لفة في الدقيقة. مجالات الثقافة في قوارير غزل حتى أنهم على استعداد لجمع البيانات.
      ملاحظة: الحد أدنى لمدة 3 أسابيع في الثقافة هو الحاجة إلى تشكيل المشبك. إذا ليس هو المطلوب نظام مفاعل حيوي قارورة زر الزيادة والنقصان، قد تكون مثقف مجالات في ظروف ثابتة في قوارير الثقافة الخلية أو أطباق. مجالات يمكن أن تندرج أيضا في إدارة المحتوى في المؤسسة أو المائية.

4-قياس مباشر فسيولوجيا متشابك مع صفائف مولتيليكترودي (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)

  1. إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لثقافة الخلية.
    1. سطح نظيف لكل شركة طيران الشرق الأوسط مع 1 مل منظفات حاء 1 شطف مع تعقيم المياه (دي)، شطف مع الإيثانول 70% لتعقيم ومن ثم الهواء الجاف في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في المياه دي في 4 درجات مئوية تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام.
    2. تحضير حلاً 0.5 ملغ/مل من بولي-أورنيثيني (منظمة التحرير الفلسطينية) بإذابة 50 مغ من منظمة التحرير الفلسطينية إلى 100 مل من الماء المقطر المخزن المؤقت. معطف السطح من كل شركة طيران الشرق الأوسط مع 1 مل من منظمة التحرير الفلسطينية تجعل السطح ماء واحتضان في 37 درجة مئوية للحد أدنى من 4 h. إزالة منظمة التحرير الفلسطينية، ويغسل السطح بالماء دي، أضف 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة (راجع الخطوة 1.1.1)، واحتضان في 37 درجة مئوية للحد ني ح 4.
    3. إزالة المحتوى والمجالات في 1.5 مل من وسائل الإعلام على سطح اتفاق بيئي متعدد الأطراف، ضمان أن المجالات متوضعة على رأس مجموعة قطب كهربائي (الأرقام 3A 3A '). السماح للالتزام لمدة يومين. تغيير نصف وسائل الإعلام كل 2-3 أيام (أو أكثر غالباً ما إذا لزم الأمر)، ضمان أن المجالات لا نشعر بالقلق.
      ملاحظة: إضافة عوامل النمو قد يحسن بقاء الثقافة والنضج.
  2. قياس النشاط الكهربائي للمجالات العصبية.
    1. إعداد نظام مجموعة مولتيليكترودي (MEA) مع هيدستاجي التحكم في درجة الحرارة. قم بإنشاء برنامج حاسوبي مع عامل تصفية عالية تمرير 5 هرتز، ومرشح تمرير منخفض 200 هرتز، وعتبة سبايك x 5 الانحراف المعياري (SD).
    2. مكان في الشرق الأوسط وأفريقيا على هيدستاجي وسجل عفوية النشاط الكهربائي (الشكل 3B، ب). حفظ البيانات الخام بما في ذلك ارتفاع التردد والسعة للتحليل الإحصائي.
      ملاحظة: يمكن استخدام نظام التروية مع شركة طيران الشرق الأوسط لإضافة وكلاء الدوائية أو لزيادة تدفق وسائط جديدة لتسجيل طويلة الأجل. يمكن تنفيذ معالجة إضافية بعد انتهاء من المسامير ك المطلوب36،37.

5-قياس كثافة متشابك مع إيمونوسيتوتشيميستري

  1. تعد الكواشف.
    1. لجعل حل أسهم 500 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA)، إضافة 400 مل من برنامج تلفزيوني x 1 كوب زجاج أو لوحة ضجة في غطاء التهوية. إضافة شريط ضجة والحرارة إلى 60 درجة مئوية مع إثارة؛ لا يغلي. إضافة 20 جرام مسحوق منهاج العمل لحل برنامج تلفزيوني ساخن ورفع درجة الحموضة إلى 6.9 ببطء إضافة هيدروكسيد الصوديوم N 1 دروبويسي.
      ملاحظة: حل منهاج العمل 4% يمكن أن الكوتيد والمخزنة على 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. إضافة ز 20 أو 30 غ من السكروز إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني لجعل الحلول 20% و 30% من السكروز، على التوالي.
    3. أضف 1 مل منظفات إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني لإعداد حل أسهم 10%. عكس عدة مرات مجانسة.
    4. إضافة 250 ميليلتر 10 ٪ حل الأسهم المنظفات (تركيز النهائي من 0.25%) و 500 ميليلتر من كل من الأمصال الماعز والحمير (تركيز النهائي من 5% لكل منهما) إلى 10 مل برنامج تلفزيوني لإعداد المخزن المؤقت حظر الأولية.
    5. إضافة 100 ميليلتر من كل من الأمصال الماعز والحمير (تركيز النهائي من 1% لكل منهما) إلى 10 مل برنامج تلفزيوني لإعداد المخزن المؤقت حظر الثانوية.
  2. إعداد العينات.
    1. نقل المجالات في أنبوب مخروطي 15 مل والسماح لهم بتسوية في الجزء السفلي من الأنبوب، ونضح وسائط الإعلام القديمة. شطف المجالات مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، تتيح تسوية، ونضح PBS. إضافة 500 ميليلتر من 4% منهاج العمل (أو ما يكفي لتغطية المجالات) واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. نضح منهاج عمل بيجين، وتغسل بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة محلول السكروز 20% واحتضان عند 4 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل. عناية نضح أو إضافة محلول السكروز 30%، واحتضان عند 4 درجة مئوية لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني أو السكروز لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إذا لم يكن تشريح، الحفاظ على كمجالات ثلاثية الأبعاد (الشكل 4 أ-ج) في أنبوب 1.5 مل والانتقال إلى الخطوة 5، 3.
    3. إذا كان تشريح المجالات، بعناية نقل المجالات إلى العفن مبردة تضمين فوق الثلج الجاف. نضح محلول السكروز 30% وصب الأنسجة تضمين الحل في القالب حتى يغطي كامل العينة، تجنب فقاعات الهواء ببطء. الانتظار حتى حل تجميد وتخزين في-80 درجة مئوية حتى تقطيع كريوستات.
    4. استخدام كريوستات من-20 درجة مئوية، وشريحة كتل مضمن إلى 30 ميكرومتر أقسام (أو حسب الرغبة) ونقل إلى الشرائح الزجاجية. تخزين في-80 درجة مئوية حتى جاهزة وصمة عار.
  3. إيمونوستين المجالات.
    1. مخطط حواف الشرائح باستخدام قلم PAP مسعور منع انسكاب السوائل. إعداد حلول حظر الابتدائي والثانوي مع الأجسام المضادة (انظر الجدول للمواد). إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر الأولية لكل شريحة أو أنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. إزالة السائل، وإضافة 500 ميليلتر الطازجة المخزن المؤقت حظر الأولية مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف لكل شريحة أو أنبوب، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إزالة الحل جسم الأولية وتغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    3. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر الثانوي مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف لكل شريحة أو أنبوب واحتضان في 4 درجات مئوية حاء 1 إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل وتغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يتم توفير قائمة بالأجسام المضادة الموصى بها في الجدول للمواد. يمكن استخدام الأجسام المضادة أو صبغات أخرى حسب المطلوب. لا تعرض عينات الفلورية الضوء (5.3.3 الخطوة فصاعدا).
    4. إضافة 50 ميليلتر من تصاعد حل دروبويسي لتغطية السطح ومكان ساترة بعناية أكثر من الشريحة، تجنب الفقاعات. السماح للشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة ح 24 وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. صورة الشرائح.
    1. استخدام مجهر فلوري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع 63 × النفط الغمر الهدف إلى الصورة السابقة ووفرة البروتين بعد متشابك وكولوكاليزيشن داخل المجال شرائح (الشكل 4). استخدام X 20 أو 40 س الهدف لتصور السمات المورفولوجية هاستروس.
    2. الأسفار فتح ملفات الصور مع برنامج إيماجيج. عد ما قبل وما بعد بونكتا متشابك يدوياً باستخدام "العداد الخلية" في المكونات، استخدام طريقة عد غير متحيزة ك مفصل سابقا38، أو مع طرق بديلة.

النتائج

عند تنفيذها بشكل صحيح، هذا البروتوكول سوف تنتج معرفة السكان من كوكولتوريس الفنية أستروسيتيس28،،من3334 والخلايا العصبية35 المتولدة من هبسكس (الشكل 1A-1C)، كما مفصلة قبل26 وا?...

Discussion

في هذا البروتوكول، يمكننا وصف أسلوب منهجي لإنتاج 3D مجالات كوكولتوريس العصبية. المجالات تتألف من أستروسيتيس، والخلايا العصبية، مستمدة بشكل مستقل من هبسكس. على الرغم من عدم تركيز هذا البروتوكول، توليد نقية السكان astrocytes من هبسكس28 خطوة بالغة الأهمية ويمكن أن يكون تحديا تقنيا إذ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور إريك أليان (UCSF) للمدخلات الفكرية في تصميم هذه الإجراءات، الدكتور مايكل وارد (المعاهد الوطنية للصحة) للمشورة التقنية بشأن المفاضلة إينيورون، و "سابا برلاس" لتحليل الصورة الأولية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well plateFisher Scientific08-772-1B
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLDetachment solution
AggreWell plateStemcell Technologies34850
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemcell Technologies7010Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Media Supplement
BrainPhys neuronal mediumStemcell Technologies5790Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslipsNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042With GlutaMAX supplement
DMH-1Stemcell Technologies73634HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serumLampire Biological Laboratories7332100Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox)SigmaD3072-1mlHAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF)Peprotech100-18BWorking concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solutionSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisherbrand22-037-246
Goat serumLampire Biological Laboratories7332500Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counterLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUWorking concentration: 2 mg/mL
Magnetic plateDLAB8030170200
Matrigel membrane matrixCorning354230ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 SystemMultichannel SystemsMEA2100
Mounting solution
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
Paraformaldehyde (PFA)Acros Organics169650025HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poly-l-ornithine (PLO)SigmaP3655-100MGWorking concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slipsFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254Working concentration: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Working concentration: 2 μM
Spinner flasksFisher Scientific4500-125
SucroseFisher ChemicalS5-3Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture FlaskOlympus Plastics25-207Vented caps
T75 Culture FlaskOlympus Plastics25-209Vented caps
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal mediumStemcell Technologies5940Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplementsStemcell Technologies5940Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blueInvitrogenT10282
Antibodies
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Secondary antibody
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Secondary antibody
EzrinThermofisherMA5-13862Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAPChemiconMAB360Primary antibody; astrocytes
GFPAvesGFP-1020Primary antibody; astrocytes
Glt1Gift from Dr. Jeffrey Rothsteinn/aPrimary antibody; astrocytes
HomerSynaptic Systems160 011Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2Synaptic Systems188 004Primary antibody; neurons
PSD95Abcamab2723Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100Abcamab868Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1Synaptic Systems106 103Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3)CovanceMMS-435PPrimary antibody; neurons

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 Astrocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved