JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Abstract

מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר דגמים הרלוונטיים עבור הלומדים המוח האנושי. טכנולוגיות מתפתחות אחד כדי לטפל בבעיה זו הוא השימוש של שלוש התרבויות תאי העצבים (3D) תלת-ממדי, הנקרא 'organoids' או 'spheroids', לשם שימור לטווח ארוך של אינטראקציות המערכת כולל מולקולות אדהזיה חוץ-תאית. עם זאת, מערכות התרבות אלו הן זמן רב לא באופן שיטתי שנוצר. כאן, אנחנו פירוט שיטה לייצר במהירות ובאופן עקבי cocultures 3D של נוירונים, תאי גזע האסטרוציטים מ pluripotent אנושי. האסטרוציטים הראשון, הבדיל מראש, אבות עצביים הפומבית, ספרתי. בשלב הבא, תאים משולבים ב ויוצרים כדור מנות עם מעכב Rho-קינאז ועל יחסי מסוים כדי לייצר כדורים בגודל לשחזור. לאחר מספר שבועות של תרבות כמו כדורים צפים, cocultures ("אסטרואידים") סוף סוף למחלקה עבור immunostaining או מצופה על מערכים multielectrode למדידת צפיפות סינפטית וכוח. באופן כללי, הוא צפוי כי פרוטוקול זה תניב הספירות עצבית תלת-ממד להציג סמנים מסוג תאים בוגרים מוגבלים, יוצרות הסינפסות פונקציונלי ולאחר להפגין פעילות פרץ ספונטני רשת סינפטית. יחד, מערכת זו מאפשרת והתרופות הקרנה חקירות מנגנונים של המחלה במודל מתאים יותר לעומת תרבויות חד שכבתי.

Introduction

האסטרוציטים הם סוג תא גליה מאוד שופע בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם מגוון רחב של אחריות פונקציונלי מעבר תמיכה מבנית. באמצעות הפרשת synaptogenic מסיסים גורמי ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), האסטרוציטים לסייע הממסד ואישכול של הסינפסות בוגרת במהלך פיתוח1. הם גם לשחק תפקיד חיוני בשמירה על בריאותם של פלסטיות של הסינפסות דרך חוץ-תאית איתות2,3,4,5, ולתרום יציבות לטווח ארוך של homeostatic סביבות על ידי ויסות אשלגן חוץ-תאית, גלוטמט, כמו גם את הפרשת סובסטרטים אנרגיה ו- ATP6,7,8. לבסוף הם יכולים לתרום עצבית על ידי המשפיעים על זרמים extrasynaptic9, יכולים להשפיע בעקיפין בפעילות באמצעות סוגי תאים אחרים כגון קידום myelination10. חשוב, כי חריגות או תפקוד לקוי של האסטרוציטים יכול להוביל תסמונות התפתחותיות רבות neuropathology למבוגרים, יש צורך ברור כדי לכלול האסטרוציטים לצד נוירונים בתוך רשתות עצביות מהונדסים על מנת גרסה משופרת מודל של הסביבה אנדוגני במוח. מאפיין אינטגרלי של האסטרוציטים הוא היכולת שלהם טופס דינמי אינטראקציות עם הסינפסות עצביים1,11,12. בהיעדר עכשיו, דונלד, נוירונים בצורת מספר מוגבל של הסינפסות, אשר באופן כללי גם חוסר בגרות פונקציונלי13.

האסטרוציטים האנושי להציג מאפיינים מורפולוגיים, תעתיק ופונקציונליים — כגון הגדלת גודלו ומורכבותו של גנים מסעף, כמו גם תלויי מין – כי הם לא recapitulated מכרסמים12,14, 15. כתוצאה מכך, מחקרים ניצול תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC)-תאים עצביים נגזר יש להפוך לנפוץ כאמצעי בחינת מחלות הקשורות CNS במבחנה תוך פיתוח טיפולים חדשניים, פציעה מודלים, פרדיגמות לתרבות16 ,17. יתר על כן, hPSCs היתר חקר היווצרות האדם סינפסה ותפקוד ללא צורך רקמות ראשי18,19.

מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר רלוונטיות מודלים של המוח האנושי. יש צורך פלטפורמה המתאימה לסכם שלה רשתות סינפטית עם נאמנות גבוהה הפארמצבטית. לאחרונה, עניין התפתחה בייצור של מערכות התרבות תלת-ממד (בהרחבה המכונה 'organoids,' 'spheroids', או 'מיני המוח')20 לדגם מורכבים תלת מימדי (3D) מבנים ברמות הסלולר והדואר מאקרו. מערכות תלת-ממד תרבות שומרים על אינטראקציות ECM ו תאים-תאים הנמצאים בדרך כלל נעדר או מוגבלת במהלך coculture 2D אופייני פרדיגמות21,22. שפע של טכניקות קיימות עבור culturing23,spheroids עצבית 3D24,25; עם זאת, רבים מחייבים תקופות ממושכות תרבות (חודשים עד שנים) עבור שכבת שימור ופיתוח ספונטנית, עם המשתמש מפגין שליטה מעט מאוד על הפלט.

. כאן, להמחיש לנו שיטה שיטתית כדי במהירות, באופן עקבי bioengineer עצבית אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים (הנוירונים הבדיל מראש, האסטרוציטים) נגזר hPSCs על ידי הרכבת תאים לתוך כדור cocultures ("אסטרואידים")26 זה מסכם את הדברים המורכבות המורפולוגית אדם ספציפי ב- 3D. מערכת עצבית בצפיפות גבוהה זו יוצרת באופן שווה התפזרו עצבית יחוברו להשתלט על מאפייני בוגרת זמן, יכול להיות מוקרן או לבדיקה באופן תפוקה גבוהה. נדגים בפעם הראשונה האסטרוציטים האנושי זירוז פעילות רשת סינפטית פרץ באלה cocultures תלת-ממד. בנוסף, פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות ליצור כדורים בגדלים שונים, כדי לנצל את התאים שצוינו כדי זהויות אזוריות שונות של מערכת העצבים, וכדי ללמוד אינטראקציות של מספר סוגי תאים אחרים לפי הצורך.

Protocol

1. תא תרבות והכנות ריאגנט

הערה: הפרוטוקולים בסעיף זה נכתבות לפי הסדר שבו הם מופיעים בפרוטוקול בידול (סעיף 2). ראה טבלה של חומרים עבור חומרים ואת מספרי קטלוג.

  1. להכין צלחות מצופה תרבית תאים.
    1. מטריצה חוץ-תאית (ECM) הפתרון ציפוי עם מדיה DMEM/F12 כדי להכין פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל מדולל. Aliquot ה-ECM מדולל במניה פתרון לתוך הצינורות חרוט 30 של 3 מ ל כל אחד ולאחסן מיד ב-20 ° C. הפתרון עובד, resuspend 3 מ"ל של מניות ECM לתוך 33 מ של מדיה DMEM/F12 טרום מקורר, להביא את הנפח הכולל 36 מ"ל על ריכוז של 80 µg/mL.
    2. מעיל 1 מ"ל לכל טוב של צלחת התרבות תאים 6-ובכן עם פתרון ה-ECM עבודה. הוסף אוטם 1 נוספים DMEM/F12 לכל טוב (במקרה הצורך) על מנת להבטיח כי פני השטח של הבאר מכוסה. לאפשר התא 6-ובכן מצופה לוחות תרבות תשב בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה לפני השימוש.
      הערה: צלחות מצופה ניתן לאחסן בחממה או ב 4 ° C עד 2 שבועות.
  2. הכנת פורמולציות מדיה, גורמי גדילה, מולקולות קטנות.
    1. כדי להכין 500 מ"ל pluripotent האנושי תאי גזע (hPSC) בינוני27, להוסיף 20 x ותוספי x 500 לפי הוראות היצרנים.
    2. כדי להכין 500 מ"ל של עצבי בינוני (ננומטר), להוסיף הפארין ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל, 1 x של פתרון אנטיביוטיקה/antimycotic, 1 x B27 השלמה או 1 השלמה x N2 בקבוק 500 מ"ל DMEM/F12 עם תוספת-גלוטמין בעבר מפורט28.
    3. כדי להכין 10 מ"מ (1, 000 x) במלאי פתרון של Y27632 מעכב Rho-קינאז (Y), להוסיף 10 מ ג של אבקת לתוך 3 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). מסנן לחטא, aliquot, ולאחסן ב-20 ° C. השתמש ב- 10 מיקרומטר ריכוז לעבוד בתקשורת.
    4. כדי להכין של 20 מ מ (10, 000 x) במלאי פתרון של SB431542, להוסיף 10 מ ג של אבקת לתוך 1.3 מ של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). כדי להכין של 2 מ מ (1, 000 x) במלאי פתרון של DMH1, להוסיף 10 מ ג של אבקת לתוך 13.1 מ של דימתיל סולפוקסיד. מסנן לחטא, aliquot, ולאחסן את כל הפתרונות ב-20 ° C. השתמש כל אחד בריכוז העבודה 2 מיקרומטר בתקשורת (NM + SB431542 + DMH1).
      הערה: פרוטוקול זה ממליץ על 2 מיקרומטר עבודה ריכוזי בשני SB431542, DMH1 מבוססת על תצפיות שלנו ואת הדוחות האחרים29 המציינת במכלול זה מקדם ביעילות אינדוקציה עצבית של hPSCs. ריכוז גבוה היו גם דווח על30. בנוסף, עם מדיה חלופית, גם הוכח כי מולקולות קטנות אינם הכרחיים עבור ההמרה עצבית גבוהה31. לכן, ריכוז העבודה משתנה בהתאם סביבות תרבות חלופית לתא, ריכוזים מיטביים צריך להיבדק על ידי חוקרים בודדים.
    5. כדי להכין בודדים 100 µg/mL (10, 000 x) פתרונות מניות של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), פיברובלסט גורם גדילה-2 (FGF2), להוסיף 1 מ ג של כל אחד לתוך 10 מ"ל של PBS + 0.1% BSA. Aliquot EGF ו- FGF2 במניה פתרונות לתוך 50 µL aliquots ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. השתמש כל אחד בריכוז העבודה 10 ננוגרם למ"ל בתקשורת; למשל, להוסיף 5 µL EGF ו 5 µL FGF2 50 מ של NM (+ ננומטר EGF + FGF2).
    6. כדי להכין פתרון מניות של דוקסיציקלין הידרוכלוריד (Dox), תחילה לפזר אבקת ב דימתיל סולפוקסיד 100 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-20 ° C. בהמשך למהול אותו כדי להפוך של 2 מ"ג/מ"ל (1, 000 x) במלאי פתרון ב- PBS וחנות ב-20 ° C. להשתמש במלון 2 ריכוז בעבודה µg/mL בתקשורת; למשל, להוסיף 50 µL Dox 50 מ של NM (NM + Dox).
      הערה: אין מחדש להקפיא פתרונות לאחר מפשיר.

2. דור של תת עצביים מתאי האנושי המושרה Pluripotent (hPSCs)

הערה: כל תרביות תאים צריך להישמר בתוך אינקובטור עם 5% CO2 ב 37 º C. תרבויות אלה נשמרות רמות החמצן בחדר, למרות רמות נמוכות יותר עשוי להיות מנוצל.

  1. ליצור ולתחזק אסטרוציט אבות (hAstros) מ- hPSCs.
    הערה: סעיף זה מספק פרוטוקול קצר ומפושטת בידול. לקבלת תיאור מפורט (עם היווצרות הגוף embryoid, הבחירה רוזט והשלבים המתבנת אזוריות) להפנות פרוטוקול שתואר לעיל28 (איור 1A, מנוקד בירוק).
    1. זרע אשכולות של hPSCs (איור 1B) על גבי 6-ובכן צלחות מצופה ECM (ראה שלב 1.1) עם 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל טוב. להאכיל את תאי הגזע בכל יום עד כ-50% confluent ופיצול כנדרש.
      1. כדי לפצל hPSCs, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט passaging בארות, תשאף לאחר מינימלית 1 תאים Incubate בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, להוסיף 1 מ"ל hPSC בינוני, לפצל אגרגטים 1:10, על גבי בארות חדשות מצופים ECM ב 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל טוב.
    2. לשמור את תאי הגזע עד כ-50% confluent, אז השינוי מדיה NM + SB431542 + DMH1 לזירוז בידול עצבית (יום 0). כאשר תאים הם כ- 95% confluent, 1:6 לפצל מצופים ECM בארות מים חדשות במדיום אותו.
    3. ביום 14, לנתק את התאים עם ניתוק פתרון והעברה אל בקבוק שאינו מצופה עם Y כדי לקדם היווצרות אגרגטים.
      הערה: התוספת של Y הוא מנוצל כדי לקדם את הישרדות, ספירת כדוריות אך אינה כלולה במהלך כל הזנה.
    4. הדור של אבות עצביים, נוירונים (hNeurons), להשתמש תאים אלה היום-14 כמתואר להלן. לחלופין, לנצל את התאים הללו בנקודות זמן מאוחר יותר מתרבויות טפט או כדור לפני ההבשלה עצביים מתרחשת או gliogenesis מתחילה.
      הערה: כברירת מחדל, פרוטוקול זה מייצר האסטרוציטים הגבי-קורטיקליים. עם זאת, תת אסטרוציט ניתן לציין כתמורה על ידי הוספת תכנים אורגניזם אם תרצה28,32,33. ניתן להוסיף חומצה Retinoic (RA) כדי caudalize תאים לתוך חוט השדרה הפנוטיפים, בעוד סוניק הקיפוד (ששש), smoothened אגוניסט (סאג), או purmorphamine תפיק פנוטיפים הגחון.
    5. לדור של אבות אסטרוציט ו האסטרוציטים ב אגרגטים 3D שנוצר באופן ספונטני (hAstrospheres), לעבור EGF + ננומטר + FGF2, כהזנה בעבר מפורט34שבועי (או לפי הצורך כדי להבטיח pH יציב).
      1. בעדינות מביצועם hAstro אגרגטים עם ניתוק פתרון כאשר מרכזים כהה מופיעים ולהסיר את הספירות לצרף באופן ספונטני. לשבור את הספירות בעדינות פעם בשבוע כדי לשמור על בריאות כדור וכדי למנוע ליבות עם נמק.
        הערה: לא יעלה על 5 דקות של טיפול עם ניתוק פתרון.
      2. לאחר 4-6 חודשים של התפשטות, לאשר תא זהות, גם הקפאת הקפאה קריוגנית בינוני (בהתאם להוראות היצרן) או חלופית אחסון תנאים לשימור לטווח ארוך חנקן נוזלי או לשימוש באופן מיידי ניסויים.
    6. להפשיר מלאי קפוא של hAstrospheres, במהירות להפשיר בקבוקון בטמפרטורת החדר, העברת התכנים צינור חרוטי ריק 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 300 x גרם עבור מינימלית 1 בקפידה תשאף תגובת שיקוע לשטוף עם DMEM/F12, חזור עבור סכום כולל של שטיפת שני שלבים. להוסיף בקבוקון T25 עם הנפח הכולל של 6 מ של Y FGF2 + EGF + ננומטר (או קנה המידה של פי הצורך).
  2. ליצור ולתחזק inducible נוירונים (iNeurons) מ- hPSCs.
    1. זרע הטרנסגניים hPSCs (עם transgene neurogenin דוקסיציקלין-inducible יציב 235) על לוחות 6-ובכן מצופים ECM עם 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל טוב (כפי שתואר לעיל לקווים שאינם הטרנסגניים). להאכיל כל יום עם 2 מ"ל של מדיה בכל טוב עד שיהיו מוכנים להרים ב 70% confluency. פצל תאים כפי שמתואר בשלב 2.1.2.
    2. כאשר תאים הם כ-35% confluent, להוסיף NM + Dox לזירוז בידול לתוך iNeurons. לשמור על תרבות חד שכבתי עם NM + Dox 2 ימים לפני שתמשיך לשלב 3.2.
      הערה: תאים מעבר לתוך אבות עצביים אבל לא עדיין להרחיב neurites (איור 1C).

3. הכנה ותחזוקה של כדור תלת-ממדי Cocultures

  1. מביצועם hAstros של אגרגטים 3D ההשעיה (כפי שמתואר בשלב 2.1.5.1).
  2. מביצועם hNeurons או iNeurons של טפט 2D.
    1. להסיר מדיה 6-ובכן צלחת ומוסיפים µL 500 של ניתוק פתרון לכל טוב המכיל חד שכבתי תרבויות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק בעדינות מוסיפים 2-3 מ ל DMEM/F12 כדי להסיר תאים המצורפת.
    2. איסוף תאים ומדיה צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 300 x גרם עבור 1 מינימלית לשאוב תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של מדיה חדשה, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עם micropipette 1,000 µL כדי להשיג השעיה תא בודד.
  3. טופס הספירות תלת-ממד באמצעות לוחות תרבות microwell.
    1. להכין צלחת על-ידי הוספת 0.5 מ של פתרון השטיפה למניעת הדבקות מכל קידוח של צלחת microwell. צנטריפוגה הצלחת x 2,000 g עבור 5 דק פתרון השטיפה וביופסיה, להוסיף 1 מ"ל של DMEM/F12 כדי כל טוב לשטוף, את האחות שוב.
      הערה: הקפד תמיד לצנטריפוגה מאוזנת במהלך השימוש.
    2. לספור בכל סוג התא באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית. להוסיף יחס הרצוי של hAstros הפומבית ו hNeurons או iNeurons כל טוב הנפח הכולל של 2 מ של NM + Y (כולל Dox אם iNeurons מנוצלים). צנטריפוגה צלחת ב x 100 g למשך 3 דקות ולחזור החממה.
      הערה: microwell 24-ובכן צלחות (ראה את הטבלה של חומרים) מכילים microwells 300 לכל טוב. מוסיפים מינימום של 6 x 10 תאים5 (עבור תחומי 2 x 103 כל התאים) ועד למקסימום של 6 x 106 תאים (עבור תחומי 2 x 104 כל התאים) 2 מ של מדיה לכל טוב. ספירות קיימא של צפיפות ספציפית בטווח הזה, להשתמש כמות מוגדרת של תאים, לחלק ב- 300 כדי לחשב את מספר התאים לכל כדור. כדור חלופי ויוצרים שיטות וכלים היכולה לשמש גם אם רצונך בכך. בצע את הוראות היצרן מקובל טווחי תאים צפיפות.
    3. מאפשרים לתאים בעצמם אל הספירות בצפיפות בתוך צלחות microwell בימים 2 (איור 2 א). החלפת מדיה 50% אם התרבות לפענח.
      הערה: החלפת מדיה רק חצי, פיפטה בעדינות בעת הסרת והוספת מדיה כדי לא להפריע הספירות. כדורים עשויים להרים מן microwells, הפתיל יחד עם כוח עליון.
    4. לאחר יומיים, להסיר בעדינות הספירות microwells עם micropipette 1,000 µL (איור 1D). בקלילות הפעלת כוח על החלק התחתון של microwells עם התקשורת כדי להסיר את כל הספירות מודבקת נוספים. תן הספירות להתיישב צינור חרוטי 15 מ"ל, וארוקן את המדיה הישנה והוסף מדיה טריים.
  4. להגדיר את המערכת ביוריאקטור טווה את הבקבוק מעצבות הספירות תלת-ממד.
    1. לנקות את פני השטח של צלחת מגנטית מערבבים עם 70% אתנול, למקם אותו לתוך החממה תרבות התא. אוטוקלב מבחנות טווה בודדים לחטא.
    2. להוסיף את הבקבוק טווה כל הספירות עם מינימום של 50 – 60 מ"ל מדיה (איור 1D, הזחה). מקם את הבקבוקון בצלחת מערבבים מגנטי שוכן בגובה 60 סל ד. התחומים תרבות ב טווה מבחנות עד שיהיו מוכנים עבור איסוף נתונים.
      הערה: מינימום של 3 שבועות בתרבות יש צורך היווצרות סינפסה. אם המערכת ביוריאקטור טווה את הבקבוק אינו רצוי, הספירות עשוי להיות מחונן בתנאים נייח תא תרבות מבחנות או מנות הספירות עשוי גם להיות מוטבעת ECM או הידרוג.

4. מדידה של פיזיולוגיה סינפטית בשידור חי עם מערכים Multielectrode (אותי)

  1. להכין אותי תרבית תאים.
    1. השטח נקי של כל MEA עם 1 מ"ל של סבון עבור 1 ח' יש לשטוף במים סטריליים יונים (DI), לשטוף עם 70% אתנול לחטא ולאחר מכן אוויר יבש ב אבטחה ארון תחת אור UV.
      הערה: לי ניתן לאחסן במים DI ב 4 מעלות צלזיוס בתנאים סטריליים עד השימוש.
    2. להכין פתרון 0.5 מ"ג/מ"ל של פולי-ornithine (אש ף) על ידי המסת 50 מ"ג של אש"ף לתוך 100 מ ל חומצה בורית המאגר. מעיל השטח של כל MEA 1 מ של אש ף לעיבוד פני השטח הידרופיליות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 4 h. הסר אש ף, לשטוף את השטח במים DI, להוסיף 1 מ"ל של ECM (ראה שלב 1.1.1), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
    3. הסר ECM ולמקם הספירות 1.5 מ של המדיה על משטח MEA, המבטיח הכדורים ימוקמו מעל האלקטרודות (דמויות 3A, 3A'). אפשר לדבוק במשך יומיים. לשנות את מחצית התקשורת כל 2-3 ימים (או יותר לפי צורך), המבטיח הכדורים לא מופרע.
      הערה: תוספת של גורמי גדילה עשוי לשפר את תרבות הישרדות, ההבשלה.
  2. מודדים את הפעילות החשמלית של הספירות עצבית.
    1. להגדיר את מערכת multielectrode מערך (מאה) עם headstage טמפרטורה מבוקרת. צור תוכנית מעבר גבוה 5 הרץ מסנן, מסנן נמוך לעבור 200 Hz ואת סף ספייק של סטיית תקן x 5 (SD).
    2. במקום כר הדשא על headstage ולהקליט ספונטנית פעילות חשמלית (איור 3Bב'). שמור את הנתונים הגולמיים כולל תדירות ספייק ו משרעת לשם ניתוח סטטיסטי.
      הערה: מערכת זלוף היכולה לשמש עם כר הדשא כדי להוסיף סוכנים תרופתי או כדי להגדיל את זרימת המדיה טריים עבור הקלטה לטווח ארוך. ניתן לבצע עיבוד שלאחר נוסף של קוצים כמו הרצוי36,37.

5. מדידה של דחיסות סינפטית עם Immunocytochemistry

  1. הכינו את ריאגנטים.
    1. כדי להפוך את פתרון מניות 500 מ של 4% paraformaldehyde (PFA), להוסיף 400 מ של 1 x PBS גביע זכוכית או צלחת מערבבים בשכונה מאוורר. להוסיף בר מערבבים ומחממים עד 60 ° צלזיוס תוך ערבוב; לא להרתיח. להוסיף 20 גרם של אבקת PFA הפתרון PBS מחוממת, להעלות את רמת החומציות ל 6.9 בהוספת לאט את 1 N NaOH, dropwise.
      הערה: 4% PFA הפתרון יכול להיות aliquoted ומאוחסן ב 4 ° C עד לחודש.
    2. להוסיף 100 מ של PBS לעשות פתרונות 20%-30% סוכרוז, בהתאמה 20 g או 30 גרם של סוכרוז.
    3. להוסיף 1 מ"ל של דטרגנט 10 מ"ל של PBS להכין פתרון המניות 10%. היפוך מספר פעמים כדי homogenize.
    4. להוסיף 10 מ"ל PBS להכין חסימה המאגר הראשי 250 µL של 10% הפתרון מניות דטרגנט (הריכוז הסופי של 0.25%) ו- 500 µL כל של סרומים עז, חמור (ריכוז הסופי של 5% כל אחד).
    5. להוסיף 100 µL כל של סרומים עז, חמור (ריכוז סופי של 1% כל אחת) 10 מ"ל PBS להכין מאגר חסימה משני.
  2. הכינו את הדגימות.
    1. להעביר את הכדורים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לאפשר להם להתיישב בחלק התחתון של הצינור, וארוקן את המדיה הישנה. לשטוף הספירות עם µL 500 ל- PBS, ניתן ליישב, תשאף PBS. להוסיף 500 µL של 4% מחברים (או מספיק כדי לכסות את הספירות) דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. האחות של כדורגלן ולשטוף בעדינות פעמיים עם PBS. הוספת 20% סוכרוז פתרון, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה. בזהירות מחוק לגמרי, להוסיף 30% סוכרוז פתרון, ולא דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה.
      הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב 4 ° C ב- PBS או סוכרוז במשך עד שבוע לפני שתמשיך לשלב הבא. אם לא פורסים, לשמור על כמו 3D הספירות (איור 4A-C) צינור 1.5 מ ל והמשך לשלב 5.3.
    3. אם פורסים את הכדורים, בזהירות העברה הספירות תבנית להטבעה קריוגני על קרח יבש. האחות הפתרון 30% סוכרוז, מוזגים רקמות הטמעת פתרון לתבנית עד שהוא מכסה במלואה את הדגימה, הימנעות בועות אוויר. המתן עד פתרון קופא ולא לאחסן ב- 80 ° C עד cryostat לחתוך.
    4. שימוש cryostat ב-20 ° C, פרוסה הבלוקים מוטבע למקטעים 30 מיקרומטר (או לפי הצורך), העברת שקופיות זכוכית. לאחסן ב- 80 ° C עד מוכן כתם.
  3. Immunostain הכדורים.
    1. חלוקה לרמות את קצות השקופיות עם עט PAP הידרופובי למניעת זליגת נוזלים. להכין והמשניים פתרונות חסימה עם נוגדנים (ראה את הטבלה של חומרים). להוסיף 500 µL ראשי המאגר חסימה לכל שקופית או צינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. הסר את הנוזל להוסיף 500 µL טריים מאגר חסימה ראשי עם נוגדנים העיקרי מדולל לכל שקופית או צינור, דגירה בין לילה ב 4 º C. הסרת פתרון נוגדן ראשוני ולשטוף x 3 עם PBS למשך 10 דקות.
    3. להוסיף 500 µL משני מאגר חסימה עם נוגדנים משניים מדולל לכל שקופית או צינור, דגירה ב 4 ° C עבור ה 1 הסרת פתרון נוגדנים משניים ולשטוף x 3 עם PBS למשך 10 דקות.
      הערה: רשימה של נוגדנים המומלץ הינו מסופק טבלה של חומרים. ניתן להשתמש נוגדנים או צבעים אחרים לפי הצורך. אל תחשוף דגימות פלורסנט אור (שלב 5.3.3 ואילך).
    4. הוסף µL 50 של הרכבה פתרון dropwise כדי לכסות את המשטח ומניחים בזהירות coverslip מעל לשקופית, הימנעות בועות. לאפשר את השקופיות יבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה ולאחסן ב 4 º C.
  4. תמונה של השקופיות.
    1. השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים פלורסנט עם 63 X שמן טבילה אובייקטיבית תמונת קדם, שפע חלבונים פוסט-סינפטיים, colocalization בתוך כדור פרוסות (איור 4D). השתמש 20 X או המטרה X 40 להמחיש תכוניות מורפולוגיות של hAstros.
    2. קרינה פלואורסצנטית פתוח קבצי תמונה עם תוכנת ImageJ. לספור מראש, שלאחר puncta סינפטיים באופן ידני באמצעות תא הדלפק plug-in, באמצעות שיטת הספירה לא משוחדת כמו בעבר מפורט38, או עם שיטות אלטרנטיביות.

תוצאות

כאשר מבוצעת כהלכה, פרוטוקול זה יפיק אוכלוסיות מוגדרות של cocultures תפקודית של האסטרוציטים28,33,34 / נוירונים35 המופקים hPSCs (איור 1 א'-1C), כמו מפורט בעבר26 , המתוארים כאן בשלבים 2.1 –...

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שיטתית לייצור של תלת-ממד תחומי cocultures עצבית. הספירות המורכבות האסטרוציטים, הנוירונים, אשר נגזרות hPSCs באופן עצמאי. אבל לא המוקד של פרוטוקול זה, הדור של אוכלוסיות טהור של האסטרוציטים מ hPSCs28 הוא שלב קריטי והוא יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית אם מבוצע ללא...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ד ר אריק Ullian (UCSF) עבור קלט רוחני על העיצוב של נהלים אלה, ד ר מייקל וורד (NIH) לקבלת ייעוץ טכני על בידול iNeuron, סבא Barlas לניתוח תמונה ראשונית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well plateFisher Scientific08-772-1B
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLDetachment solution
AggreWell plateStemcell Technologies34850
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemcell Technologies7010Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Media Supplement
BrainPhys neuronal mediumStemcell Technologies5790Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslipsNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042With GlutaMAX supplement
DMH-1Stemcell Technologies73634HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serumLampire Biological Laboratories7332100Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox)SigmaD3072-1mlHAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF)Peprotech100-18BWorking concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solutionSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisherbrand22-037-246
Goat serumLampire Biological Laboratories7332500Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counterLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUWorking concentration: 2 mg/mL
Magnetic plateDLAB8030170200
Matrigel membrane matrixCorning354230ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 SystemMultichannel SystemsMEA2100
Mounting solution
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
Paraformaldehyde (PFA)Acros Organics169650025HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poly-l-ornithine (PLO)SigmaP3655-100MGWorking concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slipsFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254Working concentration: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Working concentration: 2 μM
Spinner flasksFisher Scientific4500-125
SucroseFisher ChemicalS5-3Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture FlaskOlympus Plastics25-207Vented caps
T75 Culture FlaskOlympus Plastics25-209Vented caps
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal mediumStemcell Technologies5940Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplementsStemcell Technologies5940Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blueInvitrogenT10282
Antibodies
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Secondary antibody
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Secondary antibody
EzrinThermofisherMA5-13862Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAPChemiconMAB360Primary antibody; astrocytes
GFPAvesGFP-1020Primary antibody; astrocytes
Glt1Gift from Dr. Jeffrey Rothsteinn/aPrimary antibody; astrocytes
HomerSynaptic Systems160 011Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2Synaptic Systems188 004Primary antibody; neurons
PSD95Abcamab2723Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100Abcamab868Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1Synaptic Systems106 103Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3)CovanceMMS-435PPrimary antibody; neurons

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138CocultureMultielectrode

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved