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Resumen

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Resumen

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado 'organoides' o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures ('asteroides') finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.

Introducción

Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5y contribuir a la estabilidad a largo plazo de homeostático ambientes mediante la regulación de potasio extracelular y glutamato, así como la secreción de sustratos de energía y ATP6,7,8. Finalmente, puede contribuir a la neurotransmisión por influir en las corrientes extrasinápticos9e indirectamente puede influir en la actividad a través de otros tipos celulares como la promoción de myelination10. Importante, debido a anomalía o disfunción de los astrocitos puede conducir a muchos síndromes del desarrollo neurológico y neuropatología adulto, es evidente la necesidad de incluir astrocitos junto a las neuronas en redes neuronales Ingeniería en orden para un mejor modelo del ambiente endógeno del cerebro. Una característica integral de astrocitos es su capacidad de interacciones dinámicas forma sinapsis neuronal1,11,12. En la ausencia de glia, las neuronas forman un número limitado de las sinapsis, que en general carecen de madurez funcional13.

Los astrocitos humanos Mostrar características morfológicas, transcripcionales y funcionales — tales como aumento en el tamaño y la complejidad de la ramificación, así como sobre los genes — que no son recapitulados en roedores12,14, 15. Como resultado, los estudios utilizando la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-células neuronales derivadas han aceptado ampliamente como un medio de examinar enfermedades relacionadas con el CNS en vitro en el desarrollo de nuevas terapias, lesiones modelos y paradigmas de la cultura16 ,17. Además, hPSCs permiten el estudio de la formación de la sinapsis humana y función sin necesidad de tejido primario18,19.

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes del cerebro humano. Hay una necesidad de una plataforma adecuada recapitular sus redes sinápticas con alta fidelidad y reproducibilidad. Recientemente, ha surgido interés en la producción de sistemas de cultivo 3D (ampliamente conocido como 'organoides,' 'esferoides', o 'mini cerebros')20 de modelo complejo tridimensional (3D) las estructuras a nivel celular y macro. Sistemas de cultivo 3D mantienen interacciones célula-célula y ECM que son normalmente ausente o limitada en cocultivo 2D típico paradigmas21,22. Existen una gran cantidad de técnicas para el cultivo de esferoides nervios 3D23,24,25; sin embargo, muchos requieren períodos de cultivo prolongado (meses a años) de desarrollo espontáneo y preservación de la capa, con el usuario exhibiendo muy poco control sobre la salida.

Aquí, nos ilustran un método sistemático para rápidamente y constantemente bioingeniero interacciones neuronales entre múltiples tipos de células (previamente diferenciadas neuronas y astrocitos) derivan de hPSCs por Unión de células en cocultures de la esfera (asteroides)26 que recapitulan las complejidades morfológicas específicas de humanos en 3D. Este sistema neuronal alta densidad genera subtipos neuronales dispersos uniformemente que tomar propiedades madura con el tiempo y pueden ser proyectados o analizados de un modo de alto rendimiento. Demostramos por primera vez que los astrocitos humanos inducen la actividad de explosión sináptica red en estos cocultures 3D. Además, este protocolo es fácilmente adaptable para generar esferas de diferentes tamaños, para utilizar células especificadas para diferentes identidades regionales de la CNS y estudiar las interacciones de varios otros tipos celulares como se desee.

Protocolo

1. cultura y preparación de los reactivos de la célula

Nota: Los protocolos en esta sección se escriben en el orden en que aparecen en el protocolo de diferenciación (sección 2). Vea la Tabla de materiales para materiales y números de catálogo.

  1. Preparar placas cubiertas para el cultivo celular.
    1. Solución de capa de matriz extracelular (ECM) con medio DMEM/F12 prepare un 1 mg/mL solución diluida. Alícuota ECM diluido solución de stock en 30 tubos cónicos de 3 mL y almacenar inmediatamente a-20 ° C. Para una solución de trabajo, suspender 3 mL de caldo de ECM en 33 mL de pre enfriados medios DMEM/F12, que el volumen total de 36 mL a una concentración de 80 μg/mL.
    2. Aplique 1 mL por pocillo de una placa de cultivo celular 6-pozo con solución de trabajo de ECM. Añadir un adicional 1 mL de DMEM/F12 por pozo (si es necesario) para asegurar la cobertura completa de la superficie del pozo. Permiten que la célula 6-pozo revestida placas a reposar a temperatura ambiente al menos 1 h antes de su uso.
      Nota: Placas cubiertas se pueden almacenar en la incubadora o a 4 ° C hasta por 2 semanas.
  2. Preparar formulaciones de medios de comunicación, factores de crecimiento y moléculas pequeñas.
    1. Para preparar 500 mL de humanas pluripotentes células madre (hPSC) medio27, añadir 20 x y 500 x suplementos según las instrucciones del fabricante.
    2. Para preparar 500 mL de medio de nervios (NM), añadir heparina a una concentración final de 2 mg/mL, 1 x de solución de antibiótico/antimicótico, 1 suplemento de x B27 o 1 x N2 suplemento a una botella de 500 mL de DMEM/F12 con suplemento de L-glutamina como anteriormente detallada28.
    3. Para preparar un 10 mM (1, 000 x) común solución de Rho-kinasa inhibidor Y27632 (Y), añadir 10 mg de polvo en 3 mL de tampón fosfato salino (PBS). Filtro de esterilizar, alícuota y almacenar a-20 ° C. Utiliza a una concentración de trabajo μm 10 en los medios de comunicación.
    4. Para preparar un 20 mM (10, 000 x) solución de SB431542 de archivo, añadir 10 mg de polvo en 1,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para preparar una de 2 mM (1, 000 x) común solución de DMH1, añadir 10 mg de polvo a 13,1 mL de DMSO. Filtro de esterilizar, alícuota y cada solución a-20 ° C. Usar cada uno en una concentración de trabajo 2 μm en los medios de comunicación (NM + SB431542 + DMH1).
      Nota: Este protocolo recomienda concentraciones de trabajo de 2 μm de ambos SB431542 y DMH1 basado en nuestras observaciones e informes de otros29 que indica que esta concentración promueve efectivamente la inducción neural de hPSCs. Concentraciones más altas también han sido reportados30. Además, con medios alternativos, se ha también demostrado que moléculas pequeñas no son necesarias para la alta conversión neural31. Así, las concentraciones de trabajo variará dependiendo de ambientes de cultivo celular alternativo y concentraciones óptimas deben analizarse por los investigadores individuales.
    5. Para preparar los 100 μg/mL (10, 000 x) las soluciones madre de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2), añadir 1 mg de cada uno en 10 mL de PBS + 0.1% de BSA. EGF alícuota FGF2 soluciones de stock en 50 alícuotas de μl y almacenar a-80 ° C. Usar cada uno en una concentración de trabajo 10 ng/mL en los medios de comunicación; por ejemplo, añadir 5 μl EGF y 5 μl FGF2 a 50 mL de NM (NM + EGF FGF2).
    6. Para preparar una solución de clorhidrato de doxiciclina (Dox), primero disuelva el polvo en DMSO a 100 mg/mL y almacenar a-20 ° C. Además diluir para hacer una 2 mg/mL (1, 000 x) stock solución de PBS y conservar a-20 ° C. Utilizar 2 concentración de trabajo μg/mL en los medios de comunicación; por ejemplo, añada 50 μl Dox a 50 mL de NM (NM + Dox).
      Nota: No volver a congelar las soluciones después de descongelar.

2. generación de subtipos neuronales de las células humanas inducidas pluripotentes (hPSCs)

Nota: Todas las culturas de célula debe mantener una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C. Estas culturas se mantienen en los niveles de oxígeno del ambiente, aunque pueden utilizar niveles más bajos.

  1. Generar y mantener los progenitores astrositos (hAstros) de hPSCs.
    Nota: Esta sección proporciona un protocolo breve y simplificado de la diferenciación. Para una descripción detallada (con formación de embryoid cuerpo, selección de roseta y pasos de patrones regionales) consulte el protocolo anteriormente descrito28 (figura 1A, caja verde de puntos).
    1. Racimos de semillas de hPSCs (figura 1B) sobre placas de 6 pozos revestido de ECM (vea el paso 1.1) con 2 mL de medio de hPSC + Y por pozo. Las células se alimentan todos los días hasta que son cerca de 50% confluente y dividido según sea necesario.
      1. Para dividir hPSCs, añadir 1 mL de reactivo de pases a los pocillos y aspirar después de células de incubar 1 minuto a temperatura ambiente durante 5 minutos, agregar 1 mL de medio de hPSC y split de agregados 1:10 en nuevos pozos recubiertos de ECM en 2 mL de medio de hPSC + Y por pozo.
    2. Mantener las células madre hasta que tienen alrededor de 50% confluente, luego cambio medios NM + SB431542 + DMH1 para inducir la diferenciación neural (día 0). Cuando las células están cerca de 95% confluente, dividir 1:6 en nuevos pozos recubiertos de ECM en el mismo medio.
    3. El día 14, disociar las células con solución de separación y transferencia a un matraz sin revestimiento con Y para promover la formación de agregados.
      Nota: La adición de Y se utiliza para promover la formación de la célula de supervivencia y de la esfera, pero no está incluida durante cada alimentación.
    4. Para la generación de progenitores neuronales y de neuronas (hNeurons), utiliza estas células día 14 como se describe a continuación. Como alternativa, utilizar estas células en más puntos del tiempo de cultivos monocapa o esfera antes de maduración neuronal se produce o gliogenesis comienza.
      Nota: Por defecto, este protocolo produce astrocitos dorsal cortical. Sin embargo, los subtipos de astrositos pueden especificarse regionalmente por la adición de patrones morfógenos si desea28,32,33. Ácido retinoico (ar) puede añadirse para caudalize las células en la médula espinal, mientras que de sonic hedgehog (SHH), los fenotipos alisado a agonista (SAG), o purmorphamine se producen fenotipos ventrales.
    5. Para la generación de progenitores de astrositos y astrocitos en formado espontáneamente 3D agregados (hAstrospheres), cambie a NM + EGF FGF2 y alimentar semanalmente (o cuando sea necesario para asegurar el pH estable) como anteriormente detallada34.
      1. Suavemente disociar hAstro agregados con solución de separación cuando centros oscuros aparecen y eliminar las esferas que se adhieren espontáneamente. Romper las esferas suavemente una vez por semana para mantener la salud de la esfera y evitar núcleos necróticos.
        Nota: No exceda los 5 minutos de tratamiento con la solución de la separación.
      2. Después de 4 a 6 meses de expansión, confirmar identidad celular y o congelar en medio de la crioconservación (según las instrucciones del fabricante) o almacenamiento alternativo condiciones para la preservación a largo plazo en nitrógeno líquido, o en uso inmediatamente para experimentación.
    6. Para descongelar un stock congelado de hAstrospheres, rápidamente descongelar un vial a temperatura ambiente, transferencia de contenido a un tubo cónico de vacío de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 1 minuto cuidadosamente aspirar el sobrenadante, lave con DMEM/F12 y repita para un total de lavado de dos a unos pasos. Agregar a un matraz de T25 con un volumen total de 6 mL de EGF, NM + Y + FGF2 o ampliar según sea necesario.
  2. Generar y mantener las neuronas inducibles (iNeurons) de hPSCs.
    1. Semillas transgénicas hPSCs (con un transgén estable neurogenin inducible por doxiciclina 235) en ECM cubierto bien 6 placas con 2 mL de medio de hPSC + Y por bien (como se describió anteriormente para las líneas no transgénicas). Alimentación diaria con 2 mL de medio por pozo hasta que estén listos para levantarlas en confluencia de 70%. Dividir celdas como se describe en el paso 2.1.2.
    2. Cuando las células están alrededor del 35% confluente, añadir NM + Dox para inducir diferenciación en iNeurons. Mantener una cultura de monocapa con NM + Dox por 2 días antes de proceder al paso 3.2.
      Nota: Las células se transición a trasplante de precursores neuronales pero no aún extender neuritas (figura 1).

3. preparación y mantenimiento de Cocultures de esfera 3D

  1. Disociar el hAstros de 3D agregados en suspensión (como se describe en el paso 2.1.5.1).
  2. Disociar a hNeurons o iNeurons de una monocapa 2D.
    1. Retire los medios de comunicación de placa de 6 pozos y agregar 500 μl de solución de separación para cada bien que contenga cultivos de monocapa. Incubar a 37 ° C por 5 minutos suavemente añadir 2-3 mL DMEM/F12 para eliminar las células adjuntas.
    2. Recoger las células y los medios de comunicación en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 1 min aspirar el sobrenadante, agregar 1 mL de medio fresco y pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente con una micropipeta de 1000 μL para lograr una suspensión unicelular.
  3. Forma esferas 3D utilizando placas pocillos.
    1. Preparar placa agregando 0,5 mL de solución de enjuague anti-adherencia a cada pocillo de la placa de micropocillos. Centrifugar la placa a 2.000 x g por 5 min solución lavado aspirado, añadir 1 mL de DMEM/F12 cada pozo para lavar y aspirar nuevamente.
      Nota: Asegúrese siempre de que la centrífuga esté equilibrada durante el uso.
    2. Cuenta cada tipo de célula usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Agregar relación deseada de hAstros disociado y hNeurons o iNeurons para cada pozo en un volumen total de 2 mL de NM + Y (incluye Dox si se utilizan iNeurons). Centrifugar la placa a 100 x g durante 3 minutos y vuelva a la incubadora.
      Nota: las placas de 24 pocillos micropocillos (véase la Tabla de materiales) contienen 300 micropocillos por pozo. Añadir un mínimo de 6 x 105 células (para esferas de 2 x 103 células cada uno) y un máximo de 6 x 106 células (para esferas de 2 x 104 células cada uno) en 2 mL de medio por pozo. Para esferas viables de una densidad específica dentro de esta gama, utilice una cantidad definida de células y dividir por 300 para calcular el número de células por esfera. Alternativa ámbito formación de métodos y herramientas también puede ser utilizado si se desea. Siga las instrucciones del fabricante para los rangos aceptables de densidades celulares.
    3. Permitir que las células de uno mismo-montar en esferas densamente dentro de pocillos de placas durante los próximos 2 días (figura 2A). Reemplazar el 50% media si la cultura es amarillamiento.
      Nota: Sólo la mitad de los medios de intercambio y pipetee suavemente al retirar y agregar medios para no disturbar las esferas. Esferas pueden levantar de micropocillos y fusible con mayor fuerza.
    4. Después de 2 días, quite con cuidado las esferas de los micropocillos con una micropipeta de 1000 μl (figura 1). Suavemente aplique fuerza en el fondo de los micropocillos con los medios de comunicación para eliminar cualquier adicionales esferas adheridas. Que las esferas se instalan en un tubo cónico de 15 mL, aspirar viejos media y añadir medio fresco.
  4. Establecer el sistema de biorreactor de spinner frasco para formar esferas 3D.
    1. Limpie la superficie de una placa de agitación magnética con etanol al 70%, coloque en una incubadora de cultivo celular. Frascos individuales spinner de autoclave para esterilizar.
    2. Añadir esferas con un mínimo de media de 50 – 60 mL en cada matraz de spinner (figura 1, recuadro). Coloque el matraz en la placa de agitación magnética de 60 rpm. Esferas de la cultura en frascos de spinner hasta que están listos para la recolección de datos.
      Nota: Se necesita un mínimo de 3 semanas en cultura para la formación de sinapsis. Si no se desea el sistema de biorreactor de frasco de spinner, esferas pueden cultivarse en condiciones estacionarias en frascos de cultivo celular o platos. Esferas también pueden ser incrustadas en ECM o hidrogel.

4. medición de la Fisiología sináptica vivo con matrices micropozo-microcanal (MEAs)

  1. Preparar de MEAs para el cultivo celular.
    1. Limpie la superficie de cada MEA con 1 mL de detergente por 1 h. Enjuague con agua desionizada estéril de (DI), enjuagar con etanol al 70% para esterilizar y luego déjelo secar al aire en bioseguridad gabinete bajo luz UV.
      Nota: MEAs pueden almacenarse en DI agua a 4 ° C en condiciones estériles hasta su uso.
    2. Preparar una solución de 0,5 mg/mL de poly-ornitina (OLP) disolviendo 50 mg de OLP en 100 mL de tampón ácido bórico. Capa de la superficie de cada MEA con 1 mL de PLO a renderizar la superficie hidrofílica e incubar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h. quitar el PLO, lave la superficie con agua desionizada, agregue 1 mL de ECM (vea el paso 1.1.1) e incubar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h.
    3. ECM de retirar y colocar las esferas en 1,5 mL de medio en una superficie MEA, asegurando que las esferas se colocan en la parte superior del conjunto de electrodo (figuras 3A, 3A'). Permiten adherirse durante 2 días. Cambiar la mitad de los medios de comunicación cada 2 – 3 días (o más a menudo si es necesario), asegurando que las esferas no son perturbadas.
      Nota: La adición de factores de crecimiento puede mejorar la maduración y supervivencia de la cultura.
  2. Medir la actividad eléctrica de nervios esferas.
    1. Establecer un sistema de matriz micropozo-microcanal (MEA) con un headstage de temperatura controlada. Crear un programa de software con un filtro de paso alto de 5 Hz y un filtro de paso bajo de 200 Hz y un umbral de espiga de 5 x desviación de estándar (SD).
    2. Coloque el MEA en la actividad eléctrica espontánea headstage y registro (figura 3BB'). Guardar los datos raws incluyendo aumento de frecuencia y amplitud para el análisis estadístico.
      Nota: Puede utilizarse un sistema de perfusión con el MEA para agregar a agentes farmacológicos o para aumentar el flujo de medios frescos para la grabación de largo plazo. Más post-proceso de picos puede realizarse como deseado36,37.

5. medición de la densidad sináptica con inmunocitoquímica

  1. Preparar los reactivos.
    1. Para hacer una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) 500 mL, añadir 400 mL de 1 x PBS a un vaso de precipitado de vidrio o una placa de agitación en una campana de ventilación. Añadir barra de agitación y el calor a 60 ° C mientras revuelve; no hierva. Añadir 20 g de polvo de la PFA a la solución de PBS climatizada y aumentar el pH a 6,9 añadiendo lentamente 1 N NaOH gota a gota.
      Nota: solución PFA 4% puede ser alícuotas y almacenado a 4 ° C hasta por un mes.
    2. Añadir 20 g o 30 g de sacarosa en 100 mL de PBS para hacer soluciones 20% y 30% de sacarosa, respectivamente.
    3. Añadir 1 mL de detergente por 10 mL de PBS para preparar una solución stock al 10%. Invertir varias veces para homogeneizar.
    4. Añadir 250 μl de solución detergente 10% (concentración final de 0.25%) y 500 μl de suero de cabra y burro (concentración final de 5% cada uno) a 10 mL de PBS para preparar la solución amortiguadora de bloqueo primaria.
    5. Añadir 100 μl del suero de cabra y burro (concentración final de 1% cada uno) a 10 mL de PBS para preparar la solución amortiguadora de bloqueo secundario.
  2. Preparar las muestras.
    1. Transferencia de las esferas en un tubo cónico de 15 mL, que puedan instalarse en la parte inferior del tubo y aspirar viejos media. Enjuagar las esferas con 500 μl de PBS, que asiente y aspirar el PBS. Agregar 500 μl de 4% PFA (o suficiente para cubrir las esferas) e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
    2. Aspire la PFA y lave suavemente dos veces con PBS. Añadir solución de sacarosa al 20% e incube a 4 ° C durante varias horas o toda la noche. Cuidadosamente aspirar, Añadir 30% solución de sucrosa e incube a 4 ° C durante varias horas o durante la noche.
      Nota: Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C en PBS o sacarosa hasta 1 semana antes de proceder al siguiente paso. Si no, mantener como esferas 3D (Figura 4A-C) en un tubo de 1,5 mL y proceda al paso 5.3.
    3. Si las esferas de la corte, cuidadosamente transferir esferas a un molde criogénico empotrar sobre hielo seco. Aspirar la solución de sacarosa de 30% y volcar lentamente el tejido incorporación de solución en el molde hasta que cubra completamente la muestra, evitando burbujas de aire. Espere hasta que la solución se congela y almacenar a-80 ° C hasta cortar criostato.
    4. Usando un criostato a-20 ° C, sector los bloques integrados en 30 secciones μm (o como se desee) y traslado a portaobjetos de vidrio. Almacenar a-80 ° C hasta que esté listo para teñir.
  3. Immunostain las esferas.
    1. Delinear los bordes de los portaobjetos con un lápiz hidrofóbico del PAP para evitar derrame de líquidos. Preparar soluciones de bloqueo primarias y secundarias con los anticuerpos (véase la Tabla de materiales). Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo primaria a cada diapositiva o tubo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Extraer el líquido, Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo primaria fresco con anticuerpos primarios diluidos a cada tubo o portaobjetos e incubar durante una noche a 4 ° C. Solución de anticuerpo primario de quitar y lavar 3 veces con PBS durante 10 minutos.
    3. Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo secundario con anticuerpos secundarios diluidos a cada tubo o portaobjetos e incubar a 4 ° C por 1 h. solución de anticuerpo secundario de quitar y lavar 3 veces con PBS durante 10 minutos.
      Nota: Se proporciona una lista de anticuerpos recomendadas en la Tabla de materiales. Otros anticuerpos o tintes pueden ser utilizados como deseado. No exponga las muestras fluorescentes a la luz (adelante paso 5.3.3).
    4. Añadir 50 μl de la solución gota a gota para cubrir la superficie y coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre el portaobjetos, evitando burbujas de montaje. Deje que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente durante 24 h y almacenar a 4 ° C.
  4. Imágenes de las diapositivas.
    1. Usar un microscopio de fluorescencia confocal o dos fotones con un 63 X objetivo de inmersión de aceite a la imagen y abundancia de proteína postsináptica y colocalización en rebanadas de la esfera (figura 4). Use un 20 X o 40 X objetivo visualizar las características morfológicas de la hAstros.
    2. Archivos de imagen abiertos fluorescencia con el software ImageJ. Cuenta pre y post sináptica puncta manualmente utilizando el contador celular plug-in, utilizando un método de conteo imparcial como anteriormente detallado38, o con métodos alternativos.

Resultados

Cuando se realiza correctamente, este protocolo produce poblaciones definidas de cocultures funcionales de astrocitos28,33,34 y neuronas35 generados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detallado anteriormente26 y aquí descritos en los pasos 2.1, 2.2. Este procedimiento paso a paso, con la utilizaci?...

Discusión

En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well plateFisher Scientific08-772-1B
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLDetachment solution
AggreWell plateStemcell Technologies34850
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemcell Technologies7010Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Media Supplement
BrainPhys neuronal mediumStemcell Technologies5790Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslipsNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042With GlutaMAX supplement
DMH-1Stemcell Technologies73634HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serumLampire Biological Laboratories7332100Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox)SigmaD3072-1mlHAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF)Peprotech100-18BWorking concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solutionSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisherbrand22-037-246
Goat serumLampire Biological Laboratories7332500Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counterLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUWorking concentration: 2 mg/mL
Magnetic plateDLAB8030170200
Matrigel membrane matrixCorning354230ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 SystemMultichannel SystemsMEA2100
Mounting solution
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
Paraformaldehyde (PFA)Acros Organics169650025HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poly-l-ornithine (PLO)SigmaP3655-100MGWorking concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slipsFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254Working concentration: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Working concentration: 2 μM
Spinner flasksFisher Scientific4500-125
SucroseFisher ChemicalS5-3Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture FlaskOlympus Plastics25-207Vented caps
T75 Culture FlaskOlympus Plastics25-209Vented caps
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal mediumStemcell Technologies5940Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplementsStemcell Technologies5940Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blueInvitrogenT10282
Antibodies
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Secondary antibody
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Secondary antibody
EzrinThermofisherMA5-13862Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAPChemiconMAB360Primary antibody; astrocytes
GFPAvesGFP-1020Primary antibody; astrocytes
Glt1Gift from Dr. Jeffrey Rothsteinn/aPrimary antibody; astrocytes
HomerSynaptic Systems160 011Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2Synaptic Systems188 004Primary antibody; neurons
PSD95Abcamab2723Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100Abcamab868Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1Synaptic Systems106 103Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3)CovanceMMS-435PPrimary antibody; neurons

Referencias

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