قياس لوني سائل عالي الأداء كينورينيني وحمض كينورينيك: الكيمياء الحيوية المتعلقة بالإدراك والنوم في الفئران

Summary

التعديلات في الأيض نيورواكتيفي المسار (KP) كينورينيني متورطون في الأمراض النفسية. تحقق النتائج الفنية كينورينيني غيرت مسار الأيض في فيفو في القوارض قد تساعد في توضيح نهج علاجية جديدة. البروتوكول الحالي يجمع بين نهج الكيمياء الحيوية والسلوكية للتحقيق أثر تحديا كينورينيني الحاد في الفئران.

Abstract

مسار كينورينيني (KP) تدهور التربتوفان متورط في الاضطرابات النفسية. على وجه التحديد، المستمدة من أستروسيتي المستقلب كينورينيك الحامض (كينا)، خصم في كلا ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) ومستقبلات النيكوتين أستيل (α7nACh) α7، كان متورطا في العمليات الإدراكية في الصحة والمرض. كما كينا مستويات مرتفعة في أدمغة المرضى الذين يعانون من مرض الفصام، وعطل فني في جلوتاماتيرجيك والمستقبلات اتروبين يعتقد أن تكون مرتبطة سببياً بالخلل المعرفي، في أحد المجالات أساسية للأمراض النفسية للمرض. كينا قد تلعب دوراً هاما باثوفيسيولوجيكالي في الأفراد مع مرض الفصام. من الممكن رفع كينا الذاتية في الدماغ القوارض بمعاملة الحيوانات مع كينورينيني بيوبريكورسور مباشرة، وقد أثبتت الدراسات الإكلينيكية في الفئران أن الارتفاعات الحادة في كينا قد يؤثر على عمليات التعلم والذاكرة. البروتوكول الحالي يصف هذا النهج التجريبي بالتفصيل، ويجمع بين أ) تحليل الكيمياء الحيوية من مستويات كينورينيني في الدم والدماغ تشكيل كينا (باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء)، اختبار ب) السلوكية للتحقيق هيبوكامبال تعتمد على الذاكرة السياقية (نموذج تجنب السلبية)، وج) تقييما للنوم-اليقظة سلوك [تسجيلات القياس البعدي الجمع بين للالكهربائي (EEG) وإشارات electromyogram (EMG)] في الفئران. مجتمعة، هو دراسة علاقة بين كينا مرتفعة، والنوم، والإدراك، ووصف هذا البروتوكول بالتفصيل نهج تجريبي لفهم نتائج الدالة من ارتفاع كينورينيني وكينا تشكيل في فيفو في الفئران. النتائج التي تم الحصول عليها من خلال أشكال مختلفة من هذا البروتوكول سيتم اختبار الفرضية القائلة بأن عملية كيمبرلي وكينا يخدم دور محوري في تحوير النوم والإدراك في الصحة والمرض.

Introduction

عملية كيمبرلي المسؤولة على اللاإنسانية ما يقرب من 95 في المائة من التربتوفان من الأحماض الأمينية الأساسية¹. في الدماغ الثدييات، ويتم استقلاب كينورينيني في أستروسيتيس في جزيء صغير نيورواكتيفي كينا أساسا من الإنزيم كينورينيني aminotransferase (كات) ثانيا². كينا بمثابة خصم في مستقبلات NMDA و α7nACh في المخ^2،،من³⁴، وأيضا أهداف إشارات مستقبلات بما في ذلك مستقبلات هيدروكربون أريل (فهرس) وز-البروتين إلى جانب مستقبلات 35 (GPR35)^{5 ،6}. في الحيوانات التجريبية، أظهرت ارتفاعات في الدماغ كينا يضر بأدائهم المعرفي في صفيف من فحوصات السلوكية^2،،من^78،9،10 . وتقترح فرضية ناشئة أن كينا يلعب دوراً أساسيا في تحوير الوظائف المعرفية التي تؤثر على سلوك النوم-اليقظة¹¹، ومن ثم زيادة دعم دور الجزيئات المشتقة من أستروسيتي في تحوير بيولوجيا الأعصاب للنوم و ¹²من الإدراك.

سريرياً، وجدت ارتفاعات في كينا في السائل الدماغي النخاعي وأنسجة الدماغ بعد الوفاة من المرضى الذين يعانون من مرض الفصام^13،14،،من¹⁵¹⁶، اضطراب نفسية المنهكة وتتميز بالإعاقات الإدراكية. المرضى الذين يعانون من مرض الفصام وغالباً ما تعاني من اضطرابات النوم التي قد تؤدي إلى تفاقم المرض¹⁷. فهم دور KP الأيض وكينا في تحوير علاقة بين النوم والإدراك، لا سيما بين التعلم والذاكرة، وقد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة لعلاج هذه النتائج السيئة في مرض الفصام وغيرها الأمراض النفسية.

طريقة موثوقة ومتسقة لقياس نواتج الأيض عملية كيمبرلي من المهم أن أؤكد أن البحوث الناشئة من مختلف المؤسسات يمكن أن تدمج في الفهم العلمي للبيولوجيا عملية كيمبرلي. في الوقت الحاضر، يمكننا وصف المنهجية قياس كينورينيني في بلازما الفئران وكينا في الدماغ الفئران بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). هذا البروتوكول، الذي يستفيد من الكشف عن فلوريميتريك حضور Zn^{2 +}، وضعت أولاً شيباتا¹⁸ وتكييفها مؤخرا والأمثل ديريفاتيزي مع خلات الزنك 500 ملم ككاشف العمود بعد، مما يسمح لأكثر الكشف عن كميات nanomolar الذاتية، من كينا في الدماغ¹¹.

لتحفيز إنتاج كينا حيثياته الذاتية كما هو موضح في هذا البروتوكول، يتم حقن كينورينيني بيوبريكورسور مباشرة إينترابيريتونيلي (القائمة) بالنسبة للفئران. في تركيبة مع تقييمات البيوكيميائية تحديد درجة إنتاج كينا، آثار كينورينيني التحدي على الذاكرة هيبوكامبال المعتمدة (نموذج الأبطال السلبي) وبنية النوم-اليقظة (إشارات EEG وفريق الإدارة البيئية) أيضا ¹¹من التحقيق. مزيج من هذه التقنيات تسمح لدراسة أثر البيوكيميائية والوظيفية من كينورينيني التحدي في فيفو في الفئران.

Protocol

لدينا البروتوكولات التجريبية كانت وافقت عليها لجنة الاستخدام ومؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة ميريلاند، واتباع دليل "المعاهد الوطنية للصحة" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

ملاحظة: استخدمت ويستار الذكور البالغين (250 – 350 غ) في جميع التجارب. واستخدمت مجموعات منفصلة من الحيوانات لتحليل الكيمياء الحيوية، والتجارب السلوكية، وتسجيلات النوم-اليقظة. تم إيواء الحيوانات في منشأة للتحكم في درجة الحرارة في مركز أبحاث الأمراض النفسية بولاية ماريلاند. وضعوا على دورة ضوء الظلام ح 12/12، مع الأضواء الوقت زيتجيبير (ZT) 0 والانوار في ZT 12. تلقي الحيوانات متواصلة للحصول على الغذاء والماء خلال التجارب. وكان معتمداً المرفق تماما الرابطة الأمريكية "الاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية".

1-كينورينيني داخل الإدارة للفئران

ملاحظة: في هذا البروتوكول، كينورينيني كانت تدار في ZT 0 (بداية المرحلة الخفيفة) وتم جمع الأنسجة في ZT 2 و ZT 4 لتحديد مسار وقت استقلاب كينورينيني. واستخدمت حقن المحلول الملحي الحيوانات كعنصر تحكم. على سبيل المثال، إذا فأر تزن 500 جرام والجرعة المطلوبة 100 مغ/كغ، يجب أن تتلقى الفئران حقن 5 مل الحل 10 ملغ/مل من كينورينيني.

1. تزن من كبريتات L-كينورينيني ("كينورينيني") ووضعه في قنينة زجاج 20 مل. تأكد من الحفاظ كينورينيني على الجليد في جميع الأوقات.
2. إضافة المحلول الملحي لتحقيق التركيز المطلوب وضبط درجة الحموضة إلى 7.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم N 1 (هيدروكسيد الصوديوم). دوامة و sonicate الحل حتى كينورينيني قد حلت تماما.
   تنبيه: اتبع كل توصية الاحتياطات أثناء التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم.
   1. على سبيل المثال، للتوصل إلى حل 10 ملغ/مل، يزن من 200 مغ كينورينيني ووضعه في قنينة زجاجية. إضافة 15 مل من المحلول الملحي ودوامه و sonicate (20 كيلوهرتز ل 5 – 10 ق، ميكروتيب قطرها 1/8 بوصة) إلى حل. باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، ضبط الأس الهيدروجيني للحل. وأخيراً، استخدام المياه المالحة لضبط حجم الصوت إلى 20 مل.
3. تزن كل الفئران التجريبية وحساب حجم حقن كل على أساس وزن الجسم الحيوان وجرعة العلاج المطلوب. بعناية إزالة الحيوان من قفصة المنزل وحقن الحل إينترابيريتونيلي وإرجاع الحيوان إلى قفصة.

2-كينورينيني القياسات باستخدام عالية الأداء اللوني السائل

1. جمع الأنسجة
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، كينورينيني كانت تدار في ZT 0 (بداية المرحلة الخفيفة) وتم جمع الأنسجة في ZT 2 و ZT 4 لتحديد مسار وقت استقلاب كينورينيني. واستخدمت حقن المحلول الملحي الحيوانات كعنصر تحكم.
   1. استخدام ثاني أكسيد الكربون إلى euthanize الحيوان. بعد توقف علامات التنفس لمدة 1 دقيقة، تنفيذ أسلوب القتل رحيم ثانوية بقطع الرأس.
   2. لجمع الدم الجذع كله، ضع قمع المتاح إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 20 ميكروليتر من ك₃-يدتا (0.5 م). يسمح الدم إلى استنزاف من الجسم في الأنبوب. عكس أنبوب مرارا وتكرارا للتأكد من يدتا مختلطة في جميع أنحاء.
   3. باستخدام مقص، قطع الجلد العلوي من الرأس إلى أسفل خط الوسط لفضح الجمجمة. قم بإزالة أي عضلة الرقبة الزائدة على الجزء الخلفي من الجمجمة، وفي الجلسة الافتتاحية للحبل الشوكي، قطع طريق الجمجمة من الخلف إلى الأمام.
      1. اجذب جانبي الجمجمة مفتوحة لكشف الدماغ، وثم إزالة الدماغ بعناية مع الملقط حتى لا تتعرض للضرر. إزالة المصابيح شمي بشفرة حلاقة وقص الدماغ في نصف أسفل خط الوسط. استخدام الملقط، تشريح هيميبرين في المناطق ذات الاهتمام (أي، في قرن آمون والقشرة).
   4. ضع جميع قطع تشريح الدماغ في رقائق الألومنيوم في الثلج الجاف. بعد أن جمدت تماما الأنسجة، أنه نقل إلى قنينة بلاستيكية 20 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
   5. الطرد المركزي الدم الجذع كله في 300 x ز 10 دقيقة إزالة المادة طافية (البلازما) وتحويلها إلى أنابيب الطرد المركزي الجديدة قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
2. إعداد نموذج
   1. البلازما: جمعت من الحيوانات المعالجة
      1. ذوبان الجليد على أنبوب المجمدة مع البلازما (راجع الخطوة 2، 1 لجمع الأنسجة) على الجليد الرطب.
      2. في أنبوب الطرد مركزي جديد، تخفف العينة بالماء عالي النقاوة (1:2 كينورينيني، 01:10 كينا). إلى 100 ميكروليتر من عينة مخففة، إضافة 25 ميكروليتر من حمض بيرتشلوريك 6%.
         تنبيه: اتبع كل توصية الاحتياطات أثناء التعامل مع حمض بيرتشلوريك.
      3. دوامة جميع العينات، ثم الطرد المركزي لهم في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء من إزالة 100 ميكروليتر من المادة طافية (من كل أنبوبة) ووضعها في أنبوب صغير 0.25 مل ميكروسينتريفوجي كينورينيني أو التصميم كينا.
   2. الدماغ: جمعت من الحيوانات المعالجة
      1. وضع أنابيب مع عينات الدماغ المجمدة (راجع الخطوة 2، 1 لجمع الأنسجة) على الثلج الجاف. فردي وزن كل عينة الدماغ على توازن تحليلية دقيقة. إعادته إلى الأنبوب ووضعه مرة أخرى على الثلج الجاف.
      2. بعد قد تم وزن جميع العينات، تنتقل هذه الأنابيب في الجليد الرطب. تمييع كل عينة 01:10 w/v مع الماء عالي النقاوة وتجانسه لهم باستخدام سونيكاتور (20 كيلوهرتز ل 5 – 10 ق، ميكروتيب قطرها 1/8 بوصة). على سبيل المثال، من أجل 100 مغ أنسجة المخ، إضافة 900 ميكروليتر من الماء عالي النقاوة.
      3. الكوة ميكروليتر 100 كل تضعف عينة إلى أنبوب جديد وأسيديفي أنه مع 25 ميكروليتر من حمض بيرتشلوريك 25%. دوامة، ثم الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق.
      4. بعد الطرد المركزي، إزالة 100 ميكروليتر من المادة طافية ووضعه في أنابيب صغيرة 0.25 مل ميكروسينتريفوجي لتحديد كينا.
3. [هبلك] إنشاء وتشغيل
   1. تحضير خلات الصوديوم 50 مم المرحلة المتنقلة. حل ز 6.81 من ثلاثي اسيتات الصوديوم في 1 لتر الماء عالي النقاوة. ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 باستخدام حمض الخليك الجليدية والفراغ ثم تصفية في تنظيف الأواني الزجاجية. نقل المرحلة المتنقلة خلات الصوديوم باستخدام زجاجة زجاجية 1 لتر نظيفة.
   2. تحضير خلات الزنك 500 ملم. حل 54.88 ز خلات الزنك في 500 مل الماء عالي النقاوة، ثم تصفية الفراغ. أنه نقل إلى زجاجة زجاجية نظيفة 500 مل. ملء زجاجة 1 لتر ماء عالي النقاوة وزجاجة 500 مل مع الاسيتو الانيتريل الصف [هبلك].
   3. ضع الأنابيب المدخول من الجهاز [هبلك] على حدة في مرحلة المتنقلة والماء عالي النقاوة والاسيتو الانيتريل 100%. مضخة الحل خلات الزنك بشكل منفصل عن طريق مضخة تمعجية أن يجمع مع العمود بعد انتهاء المرحلة المتنقلة، وقبل derivatization.
   4. استخدام لوحة التحكم على الجهاز، برنامج تشغيله الاسيتو الانيتريل 5% و 95% من الماء عالي النقاوة في 0.5 مل/دقيقة تسمح بتشغيل ل 20-30 دقيقة لتحقيق الضغط مستقر وخط الأساس.
   5. عند إنشاء خط أساس مستقر، قم بتغيير تكوين الحل إلى الاسيتو الانيتريل 5% و 95% خلات الصوديوم المرحلة المتنقلة. حجته لمدة 30 دقيقة.
   6. قم بتشغيل المصباح في الكاشف ومضان والسماح لها بالدفء.
   7. وفي الوقت نفسه، أيضا تشغيل المضخة بعد العمود إلى معدل تدفق 0.1 مل/دقيقة تسمح لها بالوصول إلى ضغط ثابت من حوالي 500 رطل بعد حوالي 20 دقيقة.
   8. إعداد المعايير.
      1. كينا، تبدأ بحل أسهم 1 مم، وتخفف من إعداد 5 التركيزات القياسية (أي، 10 نانومتر، 5 نانومتر، 2.5 نانومتر، 1 نانومتر، و 500 م).
         ملاحظة: هذا سوف ينتج منحنى قياسية تتراوح بين 200 فموليس فموليس 10 الواحدة 20 ميكروليتر الحقن.
      2. كينورينيني، تبدأ بحل أسهم 1 مم، وتخفف من إعداد 5 التركيزات القياسية (أي، 10 ميكرومترات، 5 ميكرومترات، 2.5 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، و 500 nM).
         ملاحظة: هذا سوف ينتج منحنى قياسية تتراوح بين 200 بموليس بموليس 10 الواحدة 20 ميكروليتر الحقن.
   9. قم بإعداد برنامج النظام [هبلك] للتحكم المعلمات تسلسل عينة والسماح أوتوينجيكتيونس لعينات متعددة.
      1. عندما تكون على الشاشة "تشغيل نموذج"، انقر فوق "ملف"، واسحب لأسفل إلى "إنشاء نموذج مجموعة جديدة". عند فتح إطار جديد، حدد "فارغ". منفردة قائمة بجميع المعايير (راجع الخطوة 2.3.8) أو عينات في النظام ينبغي أن يتم تشغيلها.
      2. في العمود "دالة"، تعيين المعايير والعينات. وينبغي أن جزيئي المعايير في بداية ونهاية التسلسل. ضخ المياه من بين كل 5 عينات.
      3. تعيين وقت التشغيل لكل عينة إلى 15 دقيقة حقن 20 ميكروليتر من العينة من المعايير وإعداد البلازما أو حقن 30 ميكروليتر من العينة من إعداد هوموجيناتي الدماغ.
      4. تعيين أطوال موجية الإثارة والانبعاثات (اعتماداً على المجمع يجري تقييمها) كينورينيني للإثارة: 365 نانومتر، والانبعاثات: 480 نانومتر، والاحتفاظ بالوقت: دقيقة ~ 6، كينا للإثارة: 344 نيوتن متر، والانبعاثات: 398 شمال البحر الأبيض المتوسط، والاحتفاظ بالوقت: ~ 11 دقيقة.
      5. مرة واحدة وقد تم تعيين كافة معلمات وقد اكويليبراتيد الجهاز، تشغيل التسلسل.
      6. لتحديد حجم البيانات، انتقل إلى الشاشة "استعراض المشروع". ضمن علامة التبويب "مجموعات عينة"، انقر نقراً مزدوجاً فوق النموذج تعيين كمياً. من قائمة جميع الحقن، تسليط الضوء على جميع المعايير، وانقر بالزر الأيمن. في النافذة الجديدة، اختر "عملية"، ثم استخدم القائمة المنسدلة لتحديد "معايرة وكوانتيتاتي" بجوار "كيف":.
      7. تسليط الضوء على جميع المعايير مرة أخرى، انقر بالزر الأيمن واختر "استعراض". عند فتح تشروماتوجرامس، استخدم الأزرار الموجودة على طول الجزء العلوي إلى "دمج" وثم "معايرة" كل معيار؛ هذا سوف تلقائياً إنشاء المنحنى المعياري.
      8. أرجع إلى علامة التبويب "مجموعات عينة" وانقر نقراً مزدوجاً فوق مجموعة العينات. وبعد ذلك، تسلط الضوء على جميع المعايير. تكرار العملية المذكورة أعلاه، ولكن بدلاً من ذلك، تحديد "كوانتيتاتي" من القائمة المنسدلة. تسليط الضوء على جميع العينات مرة أخرى، ثم انقر بالزر الأيمن واختر "استعراض". عند فتح تشروماتوجرامس، استخدم الأزرار الموجودة على طول الجزء العلوي إلى "دمج" وثم "كوانتيتاتي" كل عينة.
         ملاحظة: هذا سيتم إخراج تركيز كل عينة استناداً إلى المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقاً.

3-نموذج الأبطال السلبي

ملاحظة: تم تصميم هذه التجارب السلوكية استناداً إلى استنتاجاتنا البيوكيميائية مع التحدي كينورينيني الحاد. لتحقيق أقصى زيادة في الدماغ كينا، تدار كينورينيني (100 مغ/كغ) في ZT 0، ح 2 قبل الدورة التدريبية في نموذج الأبطال السلبي لاختبار هيبوكامبال بوساطة التعلم، الذي وقع في ZT 2. الجهاز يتألف من 2 متساوية الحجم مقصورات (21.3 سم ارتفاع، سم 20.3 سم واسعة، و 15.9 العميق) مفصولة بباب مقصلة والواردة ضمن مربع عازلة للصوت. المقصورات اثنين من جهاز اختبار تسمى "ضوء الجانب" و "الجانب المظلم". جدران جانبية خفيفة واضحة، وأثناء المحاكمات، وضوء سوف بدوره على أن تضيء أخرى هذه المقصورة. وتغطي جدران حجرة مظلمة تماما للحفاظ على حالة تعتيم.

1. يوم 1: التدريب الابتدائية
   1. قبل اختبار وتنظيف الجهاز مع الإيثانول 70%.
   2. جلب الحيوانات إلى غرفة الاختبار.
   3. بلطف ضع الحيوانات التجريبية في ضوء الجانب الجهاز وإغلاق ومزلاج باب الجهاز ومربع عازلة للصوت.
   4. باستخدام البرمجيات المرتبطة بها، تبدأ المحاكمة. من الشاشة الرئيسية، اختر "ملف" ثم "دورة مفتوحة" من القائمة المنسدلة. في نافذة جديدة، تأكد من تحديد الإجراء الصحيح، والأجهزة، وانقر فوق "إغلاق". كخطوة تالية، حدد "تكوين" ومن ثم "الإشارات". في النافذة الجديدة، حدد الجهاز الصحيح ثم انقر فوق "القضية".
      ملاحظة: سيتم بدء البرنامج ضوء لتشغيل في الجانب خفيفة على الجهاز وفتح الباب مقصلة بين المقصورات اثنين. وسوف يشرع جهاز ضبط وقت.
   5. عندما يدخل الحيوان تماما الجانب المظلم من الجهاز ومقصلة الباب سيتم إغلاق، وحدوث صدمة قدم التي لا مفر منها (0.56 mA 1 s) سيتم تسليمها.
   6. سجل الوقت الذي انقضى قبل إدخال الحيوان في حجرة مظلمة.
   7. بعد تلقي هذا الحيوان الصدمة، تسمح 30 ثانية وقت الانتعاش قبل إزالة الحيوان من الجهاز.
   8. ضع الجزء الخلفي الحيوان في قفصة المنزل.
   9. قبل بدء المحاكمة بالحيوان القادم، يمسح أجهزة نظيفة مع منشفة رطبة والتخلص من أي الكريات البراز.
   10. بعد أن تم تدريب جميع الحيوانات، إعادتها إلى مرفق الحيوان.
2. يوم 2: اختبار المحاكمة
   1. جلب الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة الاختبار 24 ساعة بعد المحاكمة التدريب. تبدأ المحاكمة اختبار للحيوان أولاً قبل وضعه في الجانب خفيفة على الجهاز وإغلاق وغلق الباب ومربع عازلة للصوت.
   2. بدء محاكمة الاختبار باستخدام الأوامر البرمجيات نفسها كما اليوم السابق؛ سيتم تشغيل الضوء في الجانب خفيفة على الجهاز وسيتم فتح الباب مقصلة بين المقصورات اثنين. وسوف يشرع جهاز ضبط وقت.
   3. عندما يدخل الحيوان في حجرة مظلمة، سيتم إغلاق باب المقصلة. سجل الوقت المنقضي.
      ملاحظة: سيتم إنهاء المحاكمة عن طريق البرنامج بعد مدة أقصاها 300 s إذا كان الحيوان لا يزال على الجانب الضوء جهاز الاختبار.
   4. ضع ظهر الحيوان في قفص المنزل بهم وتنظيف الجهاز (كما هو موضح في الخطوة 3.1.9) قبل بدء المحاكمة بالحيوان القادم.

4. النوم في التحليل

1. جراحة زرع جهاز إرسال لاسلكي EEG/EMG
   ملاحظة: ينبغي تعقيم أجهزة الإرسال القياس البعدي وإعدادها قبل الجراحة.
   1. باستخدام شفرة حلاقة، إزالة طول صغيرة من طلاء البلاستيك لتكشف عن الأسلاك ويؤدي بلطف. وضع أجهزة الإرسال في أنبوب 50 مل مخروطية مليئة تعقيم الحل [مثلاً، وافيسيدي (2.65 ٪ glutaraldehyde)].
      1. ترك أجهزة الإرسال في الحل تطهير لمالا يقل عن 12 ح. ثم، قبل الجراحة، نقل الحل إلى حاوية نفايات. شطف الإرسال مع المالحة العقيمة.
   2. في يوم الجراحة، وزن الحيوان قبل وضعه في دائرة لتخدير. حمل isoflurane 3 – 5% مع 100% O₂.
   3. بناء تخدير ناجح، إزالة الحيوان ويحلق بعناية، باستخدام حلاقة الكهربائية، الجزء العلوي من الرأس والرقبة، وكذلك قطعة صغيرة من الشعر على الجزء الخلفي من الجسم، ويترك قليلاً فقط، وأدناه في القفص الصدري.
   4. إدارة والايبوبروفين (5 مغ/كغ) تحت الجلد للمسكنات بعد العملية الجراحية.
   5. ضع وسادة تدفئة المياه الدافئة التي تسيطر عليها حرارياً تعيين عند 37 درجة مئوية تحت الحيوان للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء الجراحة.
   6. في إطار ستيريوتاكسيك، ووضع الحيوان على مخروط الآنف الحفاظ على شرط مخدر ووضع أشرطة الإذن لتحقيق الاستقرار في الرأس. تعقيم الجلد حلق بالتناوب مسحات إيثانول تدين فرك و 70%. تطبيق مرهم أوبثالاميك للعيون لتليين لهم.
   7. للتأكد من التخدير الكافي قبل الشق الأول، استخدم اختبار تو-قرصه.
   8. استخدام مشرط معقم، جعل شق من خلف العينين وصولاً إلى الجزء الخلفي الرقبة. ينبغي أن تتعرض الجمجمة والعضلات الظهرية عنق الرحم.
   9. إذا لزم الأمر للكشف عن الجمجمة، استخدم القطن ذات الرؤوس قضيب تطبيق لإزالة أي أغشية. يمكن استخدام المشابك الصغيرة-لدغ عقد الجلد بعيداً عن الجمجمة. قم بتحديد موقع ووضع علامة على موضع بريجما. حفر ثقوب لدغ 2 وإدراج مسامير معدنية الأمامي 2.0 مم/+ 1.5 مم الجانبي و 7.0 ملم الخلفي/1.5 مم الأفقي بالنسبة بريجما. الثورات 2 كاملة تضييق الخناق. تغطي الجمجمة المكشوفة بقطعة من الشاش.
   10. باستخدام مقص الجراحية المعقمة، جعل شق في تجويف الجسم، أسفل الأضلاع.
   11. في صفحة العمليات الجراحية، تأكد من تسجيل الرقم التسلسلي لجهاز الإرسال يتم زرعها.
   12. قم بإدراج جهاز الإرسال العقيمة داخل تجويف الجسم. العملاء المتوقعون الأسلاك ينبغي أن يظل خارج الجسم.
   13. استخدام خيوط قابلة للامتصاص لغرزة الجدار العضلات، ضمان أن كافة العملاء المتوقعين مجتمعون لنهاية واحدة للشق.
   14. إزالة الشاش من رأسه ورفع الجلد فقط دون الشق. تشغيل زوج من هيموستاتس العقيمة منذ فترة طويلة تحت الجلد من شق رأسه إلى الشق في الجانب. إبقاء الضغط على الجلد لتقليل أي ضرر.
       1. بمجرد هيموستاتس مرئية قرب شق الجسم، مقطع أي الغشاء الذي قد تغطي لهم المقص الجراحي وانتزاع يؤدي الإرسال أربعة مع هيموستاتس. رسم ببطء إلى هيموستاتس، حيث أن الأسلاك تقع تحت الجلد، والتي سبقت في الجمجمة.
   15. المعين الذي يؤدي 2 سوف تكون متصلاً بالجمجمة. استخدام الملقط، فهم نهاية سلك يد واحدة وأسفل نهاية غمد البلاستيك مع الآخر. سحب على السلك حتى يمكن فقط إجراء الحلقات الفردية.
   16. أحكام التفاف الأسلاك المكشوفة حول واحدة من مسامير معدنية العاشر 3 – 4. بمجرد تأمين، تشديد المسمار الحيلولة دون كشف الأسلاك وقصاصات إيقاف أي سلك إضافي. كرر هذه العملية مع الرصاص الثانية والمسمار.
   17. اسحب كلا يؤدي التخطيط الدماغي من تجويف الجسم حيث كانوا يجلسون دافئ ضد الجمجمة.
   18. استخدام الأسمنت الأسنان لتغطية المسامير ويؤدي القشرية، وخلق غطاء الجمجمة المكشوفة. تأكد من أنه لا يوجد أسمنت الأسنان العصي للجلد أو العضلات وأن يتم إنشاء لا حواف حادة. تسمح للإسمنت الأسنان الجافة.
       ملاحظة: ينبغي أن تكون صغيرة بما يكفي أن يمكن خياطة الجلد على أعلى الغطاء.
   19. ليقود فريق الإدارة البيئية، فهم نهاية الأسلاك وغمد البلاستيك كما هو موضح في الخطوة 4.1.15. تمدد الأسلاك حتى فرد الحلقات بوضوح ملحوظ.
   20. تشغيل إبرة ز 22 تحت عضلة الرقبة إلى الجانب الأيمن ل 2 – 3 مم قبل السماح له بالظهور. استخدام خيوط نونابسوربابل، ضع خياطة واحدة، فضفاضة حول الإبرة المضمنة.
   21. سلك مؤشر ترابط فريق الإدارة البيئية في الإبرة وسحب سلك الإبرة، السماح لفريق الإدارة البيئية إلى مؤشر ترابط تحت العضلات. تشديد الخياطة التأكد من الأسلاك لا يزال قائما ومقطع الأسلاك الإضافية التي قد تنشأ من العضلات.
   22. كرر الخطوات 4.1.20 و 4.1.21 لقيادة فريق الإدارة البيئية الثانية، حوالي 1 ملم إلى أسفل من زمام المبادرة الأولى.
   23. اسحب كلا يؤدي فريق الإدارة البيئية من تجويف الجسم حيث كانوا يجلسون دافئ ضد العضلات.
   24. استخدام غرز نونابسوربابل لإغلاق شق الرأس والرقبة. شد جميع الأسلاك الزائدة تحت جلد الجسم واستخدام مقاطع الجرح لإغلاق شق الجسم.
   25. تطبيق مرهم الليدوكايين على كلا الموقعين شق لمساعدة الحيوان مع الألم بعد العمل الجراحي.
   26. إرجاع الحيوان إلى قفصة المنزل، السماح للقفص الجلوس على منصة التدفئة حتى الحيوان وتعافي من التخدير.
       ملاحظة: ينبغي أن تسترد الحيوان لمدة 7 – 10 أيام قبل بداية التسجيلات.
2. تسجيل EEG/EMG
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، نحن إدارة المياه المالحة أو كينورينيني في ZT 0 وتسجيلها ثم أنماط النوم-التنبيه للحيوان ح 24.
   1. إكمال جميع التسجيلات النوم في غرفة معينة حيث لا تتم مقاطعة الحيوانات خلال مدة التسجيل.
   2. ضع القفص منزل الحيوان (مع جهاز الإرسال EEG/EMG مزروع) في وحدة استقبال. قم بتشغيل جهاز الإرسال مزروع جراحيا باستخدام مغناطيس.
      ملاحظة: يجب أن تظهر ضوء على وحدة المتلقي عند تنشيط جهاز الإرسال.
   3. إعداد تسجيل البيانات التخطيط الدماغي/فريق الإدارة البيئية باستخدام البرنامج المقترن.
      1. حدد "التجربة"، ثم "إنشاء" من القائمة المنسدلة. اسم التجربة، ومن ثم حفظه. وبعد ذلك، حدد "الأجهزة" ومن ثم "تحرير تكوين MX2".
      2. في نافذة جديدة، قم بتحديد جميع أجهزة الإرسال المستخدمة في التجربة وتشير إلى يقترن فيها لوحة تلقي كل. عندما تكون جاهزاً، بدء التسجيل عن طريق الضغط على '' "استمرار جميع ابدأ" ''.
   4. في إنهاء التجارب، حدد '' "استمرار جميع وقف" '' في البرمجيات المرتبطة بها وإيقاف تشغيل أجهزة الإرسال باستخدام المغناطيس.
   5. Euthanize الحيوانات CO₂ خنقاً متبوعاً بثقب القلب ب. إزالة جهاز الإرسال بعناية قبل إعادة فتح شق على طول الجزء العلوي من الرأس بالمقص الجراحي وقطع يؤدي خالية من الأسنان العضلات الأسمنت والرقبة.
   6. بعد ذلك، فتح تجويف الجسم وتحديد موقع جهاز الإرسال وإزالته ببطء من الجسم.
3. تحليل EEG/EMG
   1. استخدام البرمجيات المرتبطة بتحليل البيانات النوم-اليقظة. افتح البرنامج وحدد "إضافة موقع جديد". في نافذة جديدة، قم بتحديد البيانات المراد استيرادها إلى البرنامج التهديف.
      ملاحظة: هذا سوف إنشاء ملف جديد داخل البرنامج التي تحتوي على كل من الطول الموجي الخام التي تم جمعها من خلال التجربة.
   2. يدوياً نقاط الدول اليقظة لتجارب المرجوة. بعد التسجيل، تحليل المعلمات مثل المدة الإجمالية وعدد نوبات نوبة متوسط مدة مختلف الدول اليقظة [حركة العين السريعة (REM) وغير REM نريم-أعقاب].
      ملاحظة: يمكن أن يقوم على تسجيل كامل التحليل أو تقصير لوقت محدد النقاط المثيرة للاهتمام. هنا، أجرى التحليل لفترة التسجيل بين ZT 0 إلى ZT 2.

النتائج

للتحقق من صحة استخدام حقن كينورينيني داخل كوسيلة للارتقاء بالدماغ كينا، أجرى تحليل الأنسجة [هبلك]. المنحنيات القياسية (الشكل 1) وشيدت باستخدام البرمجيات المرتبطة بها، وسمح للتحديد الكمي لعينات الأنسجة. تشروماتوجرامس ممثل كينورينيني وكينا ترد في

Discussion

لتقييم موثوق كينا في الدماغ بعد إقامة كينورينيني طرفية، من المهم لجمع وتفسير التجارب البيوكيميائية والوظيفية. نقدم هنا، بروتوكول تفصيلية تسمح للمستخدمين الجدد وضع أساليب فعالة لقياس كينورينيني البلازما والمخ كينا فئران. قياس كينورينيني في البلازما وأكدت حقن دقيقة وقياس المستقلب كينا ي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wistar rats	Charles River Laboratories		adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate	Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm)	Dr. Maisch GmbH
EZ Clips	Stoelting Co.	59022
Mounting materials screws	PlasticsOne	00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures	MedRep Express	699B	CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures	Ethicon	J310H	4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement	Stoelting Co.	51458
Drill Bit	Stoelting Co.	514551	0.45 mm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module	Waters	176269503
2475 fluorescence detector	Waters	186247500
post-column reagent manager	Waters	725000556
Lenovo computer	Waters	668000249
Empower software	Waters	176706100
Name	Company	Catalog Number	Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle	MedAssociates	ENV-018MD	Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber	MedAssociates	ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat	MedAssociates	ENV-010MB-GF
Auto guillotine door	MedAssociates	ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat	MedAssociates	ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel	MedAssociates	ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber	MedAssociates	ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package	MedAssociates	DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes	MedAssociates	ENV-253C
Infrared source and dectector array strips	MedAssociates	ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module	MedAssociates	ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module	MedAssociates	ENV-412
Dual A/B shock control module	MedAssociates	ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension	MedAssociates	SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F	MedAssociates	SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6	MedAssociates	SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080D
PCI interface package	MedAssociates	DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package	MedAssociates	SOF-700RA-7
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software	Data Sciences International (DSI)	PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface	Data Sciences International (DSI)	PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit	Data Sciences International (DSI)	271-0112-013
Dell 19" computer monitor	Data Sciences International (DSI)	271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x	Data Sciences International (DSI)	272-6001-001
Cisco RV130 VPN router	Data Sciences International (DSI)	RV130
Matrix 2.0	Data Sciences International (DSI)	271-0119-001
Network switch	Data Sciences International (DSI)	SG200-08P
Neuroscore software	Data Sciences International (DSI)	271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET	Data Sciences International (DSI)	270-0134-001