Una misura di cromatografia liquida ad alte prestazioni della chinurenina e acido chinurenico: materia biochimica di cognizione e di sonno in ratti

Riepilogo

Alterazioni in metaboliti neuroattivi kynurenine pathway (KP) sono implicate nelle malattie psichiatriche. Indagando i risultati funzionali di un alterato kynurenine pathway metabolismo in vivo nei roditori può contribuire a delucidare approcci terapeutici innovativi. L'attuale protocollo combina approcci biochimici e comportamentali per studiare l'impatto di una sfida di chinurenina acuta nei ratti.

Abstract

La via della chinurenina (KP) di degradazione del triptofano è stata implicata nei disturbi psichiatrici. In particolare, l'Astrocita-derivati metabolita acido chinurenico (KYNA), un antagonista sia N-metilico-d-aspartato (NMDA) e α7 recettori nicotinici per l'acetilcolina (α7nACh), è stato implicato nei processi cognitivi nella salute e nella malattia. Come i livelli di KYNA sono elevati nei cervelli dei pazienti con schizofrenia, un malfunzionamento al glutamatergic e recettori colinergici è creduto per essere causalmente a disfunzione conoscitiva, un dominio di nucleo della psicopatologia della malattia. KYNA può svolgere un ruolo patofisiologico significativo in individui con la schizofrenia. È possibile elevare endogeno KYNA nel cervello del roditore di trattare gli animali con la chinurenina diretto bioprecursor e studi preclinici in ratti hanno dimostrato che le altezze acute in KYNA possono influenzare i processi di apprendimento e memoria. L'attuale protocollo descrive questo approccio sperimentale in dettaglio e combina un) un'analisi biochimica della chinurenina nel sangue e cervello formazione KYNA (mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni), b) comportamentali test per sondare la memoria contestuale hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e c) una valutazione del comportamento di sonno-veglia [telemetriche registrazioni che unisce l'elettroencefalogramma (EEG) e segnali di elettromiografia (EMG)] in ratti. Presi insieme, una relazione tra elevati KYNA, sonno e cognizione è studiata, e questo protocollo viene descritto in dettaglio un approccio sperimentale alla comprensione dei risultati di funzione di elevazione chinurenina e KYNA formazione in vivo nei ratti. Risultati ottenuti attraverso le variazioni di questo protocollo metterà alla prova l'ipotesi che il KP e KYNA servono ruoli chiave nella modulazione del sonno e la cognizione negli Stati di salute e malattia.

Introduzione

Il protocollo di Kyoto è responsabile di degradante quasi il 95% del triptofano aminoacido essenziale¹. Nel cervello di mammifero, chinurenina presa in astrocytes è metabolizzata in neuroattivi piccola molecola KYNA principalmente dall'enzima chinurenina aminotransferasi (KAT) II². KYNA agisce come un antagonista dei recettori NMDA e α7nACh in cervello^2,3,4, e anche obiettivi recettori inclusi il ricevitore arilico dell'idrocarburo (AHR) e la G-proteina di segnalazione accoppiato recettore 35 (GPR35)^{5 ,6}. In animali da esperimento, le elevazioni in cervello KYNA sono state indicate per alterare la loro prestazione conoscitiva in una matrice di analisi comportamentale^2,7,8,9,10 . Un'ipotesi emergente suggerisce che KYNA svolge un ruolo integrale nella modulazione delle funzioni cognitive di un impatto di comportamento di sonno-veglia¹¹, sostenendo così ulteriormente il ruolo di molecole derivate da astrociti nella modulazione della neurobiologia del sonno e cognizione¹².

Clinicamente, le elevazioni in KYNA sono state trovate nel liquido cerebrospinale e tessuto cerebrale post mortem da pazienti con schizofrenia^13,14,15,16, un debilitante disturbo psichiatrico caratterizzata da disturbi cognitivi. I pazienti con schizofrenia sono anche spesso afflitti da disturbi del sonno che possono esacerbare la malattia¹⁷. Comprensione del ruolo del metabolismo di KP e KYNA nella modulazione di una relazione tra il sonno e cognizione, in particolare tra apprendimento e la memoria, può condurre allo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di questi scarsi risultati nella schizofrenia e altro malattie psichiatriche.

Un metodo affidabile e coerenza per la misurazione dei metaboliti di KP è importante assicurare che le ricerche emergenti da varie istituzioni possono essere integrata nella comprensione scientifica della biologia di KP. Attualmente, descriviamo la metodologia per misurare chinurenina nel plasma del ratto e KYNA nel cervello del ratto mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il presente protocollo, che fa uso di una rilevazione fluorimetrica in presenza di Zn^{2 +}, in primo luogo è stato sviluppato da Shibata¹⁸ e più recentemente adattato e ottimizzato per derivatizzare con 500 millimetri di acetato di zinco come il reagente post-colonna, consentendo la rilevazione di endogeno, quantità nanomolari di KYNA nel cervello¹¹.

Per stimolare la produzione endogena di KYNA de novo come descritto nel presente protocollo, la chinurenina bioprecursor diretto viene iniettata intraperitonealmente (i.p.) in ratti. In combinazione con le valutazioni biochimiche per determinare il grado di produzione di KYNA, gli impatti di un chinurenina sfidano sulla memoria hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e l'architettura di sonno-veglia (segnali EEG ed EMG) è anche indagate¹¹. Una combinazione di queste tecniche consente lo studio dell'impatto biochimico e funzionale di un chinurenina sfida in vivo nei ratti.

Protocollo

I nostri protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale dell'Università del Maryland e seguito guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

Nota: Ratti Wistar del maschio adulto (250 – 350 g) sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Separata coorti di animali sono stati utilizzati per l'analisi biochimica, esperimenti comportamentali e registrazioni di sonno-veglia. Gli animali sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata presso il centro di ricerca psichiatrica di Maryland. Erano tenute su un ciclo luce-buio di 12/12 h, con luci fase di zeitgeber (ZT) 0 e luci spente alle ZT 12. Gli animali hanno ricevuto ad libitum accesso a cibo e acqua durante gli esperimenti. La struttura è stata completamente accreditata dall'associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care.

1. intraperitoneale chinurenina amministrazione ai ratti

Nota: In questo protocollo, chinurenina è stata amministrata a ZT 0 (l'inizio della fase di luce) e tessuto è stato raccolto a ZT 2 e 4 ZT per determinare un corso a tempo per il metabolismo della chinurenina. Salino-iniettati gli animali sono stati usati come controllo. Per esempio, se un ratto pesa 500 g e la dose desiderata è di 100 mg/kg, ratto dovrebbe ricevere un'iniezione di 5 mL di una soluzione di 10 mg/mL della chinurenina.

1. Pesare L-kynurenine solfato ("chinurenina") e posizionarlo in un flaconcino di vetro da 20 mL. Assicurarsi di mantenere la chinurenina sul ghiaccio in ogni momento.
2. Aggiungere soluzione fisiologica per ottenere la concentrazione desiderata e regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 N idrossido di sodio (NaOH). Vortice e Sonicare la soluzione fino a quando la chinurenina sarà completamente sciolta.
   Attenzione: Seguire tutte le precauzioni di raccomandazione durante la manipolazione di NaOH.
   1. Ad esempio, per ottenere una soluzione di 10 mg/mL, pesare 200 mg di chinurenina e posizionarlo in un flaconcino di vetro. Aggiungere 15 mL di soluzione fisiologica e vortice e Sonicare (20 kHz per 5 – 10 s, microtip diametro 1/8 di pollice) a dissolversi. Usando NaOH, regolare il pH della soluzione. Infine, è possibile utilizzare soluzione fisiologica per regolare il volume a 20 mL.
3. Pesare ogni ratto sperimentale e calcolare il volume di ogni singola iniezione basata sul peso corporeo dell'animale e la dose di trattamento desiderato. Con attenzione rimuovere l'animale dalla sua gabbia a casa, iniettare la soluzione per via intraperitoneale e restituire l'animale alla sua gabbia.

2. chinurenina misurazioni utilizzando alte prestazioni cromatografia liquida

1. Collezione tessuti
   Nota: In questo protocollo, chinurenina è stata amministrata a ZT 0 (l'inizio della fase di luce) e tessuto è stato raccolto a ZT 2 e 4 ZT per determinare un corso a tempo per il metabolismo della chinurenina. Salino-iniettati gli animali sono stati usati come controllo.
   1. Utilizzare anidride carbonica per eutanasia animale. Dopo i segni di respirazione hanno cessato per 1 min, è possibile eseguire un metodo di eutanasia secondario per decapitazione.
   2. Per raccogliere il sangue di tutto il tronco, collocare un imbuto monouso in una provetta da 15 mL contenente 20 μL di K₃-EDTA (0,5 M). Permettere al sangue di nel tubo di scarico dal corpo. Capovolgere la provetta ripetutamente per garantire che l'EDTA è mescolato in tutto.
   3. Utilizzando le forbici, tagliare la pelle sulla sommità della testa verso il basso la linea mediana per esporre il cranio. Rimuovere qualsiasi muscolo del collo in eccesso sulla parte posteriore del cranio e, all'apertura per il midollo spinale, tagliato attraverso il cranio dalla parte posteriore alla parte anteriore.
      1. Tirare delicatamente i due lati del cranio aperto per esporre il cervello e quindi rimuovere delicatamente il cervello con il forcipe per non danneggiarlo. Togliere i bulbi olfattivi con una lama di rasoio e tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Usando il forcipe, sezionare il hemibrain nelle regioni di interesse (cioè, l'ippocampo e la corteccia).
   4. Posto tutti i pezzi di cervello sezionato il foglio di alluminio su ghiaccio secco. Dopo che il tessuto è completamente bloccato, trasferirlo in un flaconcino di plastica da 20 mL e conservare a-80 ° C.
   5. Centrifugare il sangue intero tronco a 300 x g per 10 min. eliminare il surnatante (plasma) e trasferirlo in nuove provette da centrifuga prima di riporli a-80 ° C.
2. Preparazione del campione
   1. Plasma: raccolto da animali trattati
      1. Scongelare il tubo congelato con plasma (Vedi punto 2.1 per la raccolta di tessuto) su ghiaccio bagnato.
      2. In una nuova provetta da centrifuga, diluire il campione con acqua ultrapura (1:2 per chinurenina, 01:10 per KYNA). A 100 μL del campione diluito, aggiungere 25 μL di 6% di acido perclorico.
         Attenzione: Seguire tutte le precauzioni di raccomandazione durante la manipolazione di acido perclorico.
      3. Vortice tutti i campioni, quindi li Centrifugare a 12.000 x g per 10 min. Una volta terminato, rimuovere 100 μL del surnatante (da ciascuna provetta) e inserirli in un tubo del microcentrifuge piccolo 0,25 mL per la chinurenina o determinazione di KYNA.
   2. Cervello: raccolti da animali trattati
      1. Inserire le provette con i campioni di cervello congelato (Vedi punto 2.1 per la raccolta di tessuto) il ghiaccio secco. Pesare individualmente ciascun campione di cervello su una bilancia analitica preciso. Restituirlo al tubo e reimmetterlo sul ghiaccio secco.
      2. Dopo tutti i campioni sono stati valutati, spostare i tubi sul ghiaccio bagnato. Diluire ogni campione 01:10 w/v con acqua ultrapura e omogeneizzarle utilizzando un sonicatore (20 kHz per 5 – 10 s, microtip diametro 1/8 di pollice). Ad esempio, per 100 mg di tessuto cerebrale, aggiungere 900 μL di acqua ultrapura.
      3. Aliquotare 100 μL di ciascuno diluito del campione ad un nuovo tubo e si acidificare con 25 μL di acido perclorico al 25%. Vortice, poi lo Centrifugare a 12.000 x g per 10 min.
      4. Dopo la centrifugazione, rimuovere 100 μL del surnatante e inserirlo nelle provette microcentrifuga piccolo 0,25 mL per la determinazione di KYNA.
3. Esegui e set-up HPLC
   1. Preparare la fase mobile 50 mM sodio acetato. Sciogliere 6,81 g di sodio acetato triidrato in 1 L di acqua ultrapura. Aggiustare il pH a 6.2 utilizzando acido acetico glaciale e quindi filtrare di vuoto in vetro pulito. Trasferire la fase mobile di acetato di sodio in una bottiglia di vetro pulita 1 L.
   2. Preparare 500 millimetri di acetato di zinco. Sciogliere 54,88 g di acetato di zinco in 500 mL di acqua ultrapura, poi vuoto filtrarlo. Trasferirlo in una bottiglia di vetro pulita 500 mL. Riempire una bottiglia da 1 litro con acqua ultrapura e una bottiglia di 500 mL con acetonitrile di grado HPLC.
   3. Posizionare il tubo di aspirazione dalla macchina separatamente in fase mobile, l'acqua ultrapura e il 100% acetonitrile HPLC. Pompa la soluzione di acetato di zinco separatamente attraverso una pompa peristaltica che combina con la post-colonna fase mobile e prima la derivatizzazione.
   4. Utilizzando il pannello di controllo sulla macchina, programmare per eseguire acetonitrile 5% e 95% acqua ultrapura a 0,5 mL/min far funzionare per 20 – 30 min raggiungere una pressione stabile e la linea di base.
   5. Dopo aver stabilito una linea di base stabile, è necessario modificare la composizione della soluzione al 5% acetonitrile e fase mobile 95% sodio acetato. Equilibrare per 30 min.
   6. Accendere la lampada nel rivelatore a fluorescenza e consentono di riscaldare.
   7. Nel frattempo, anche accendere la pompa di post-colonna per una portata di 0,1 mL/min permettono di raggiungere una pressione stabile di circa 500 psi dopo circa 20 min.
   8. Preparare gli standard.
      1. Per KYNA, iniziare con una soluzione di riserva di 1 mM e diluirlo per preparare 5 concentrazioni standard (cioè, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM e 500 pM).
         Nota: Questo produrrà una curva standard che vanno da 200 fmoles a 10 fmoles per iniezione da 20 μL.
      2. Per chinurenina, iniziare con una soluzione di riserva di 1 mM e diluirlo per preparare 5 concentrazioni standard (cioè, 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM e 500 nM).
         Nota: Questo produrrà una curva standard che vanno da 200 pmoles a 10 pmoles per iniezione da 20 μL.
   9. Installare il software di sistema HPLC per controllare i parametri di sequenza campione e consentire il autoinjections dei campioni multipli.
      1. Quando sullo schermo "Eseguire Sample", fare clic su "File" e trascinare verso il basso "Crea nuovo Set di esempio". Quando si apre la nuova finestra, selezionare "Svuota". Individualmente elencare tutti gli standard (Vedi punto 2.3.8) o campioni nell'ordine che deve essere eseguiti.
      2. Nella colonna "Funzione", designano gli standard e i campioni. Gli standard devono essere analizzati all'inizio e alla fine della sequenza. Iniettare l'acqua tra ogni 5 campioni.
      3. Impostare il tempo di esecuzione per ogni campione a 15 min. iniettare 20 μL del campione dagli standard e della preparazione dei plasma o iniettare 30 μL del campione dalla preparazione di omogeneato del cervello.
      4. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione (a seconda del composto in fase di valutazione) per chinurenina all'eccitazione: 365 nm, emissione: 480 nm e tempo di ritenzione: ~ 6 min e per KYNA all'eccitazione: 344 nm, emissione: 398 nm e tempo di ritenzione: ~ 11 min.
      5. Una volta impostati tutti i parametri e la macchina ha equilibrato, eseguire la sequenza.
      6. Per quantificare i dati, passare alla schermata "Sfoglia Project". Sotto la scheda "Sample Sets", fare doppio clic sul campione impostato per essere quantificati. Dall'elenco di tutte le iniezioni, evidenziare tutti gli standard e fare clic destro. Nella nuova finestra, selezionare "Processo", quindi utilizzare il menu a discesa per selezionare "Calibrare e Quantitate" accanto a "Come":.
      7. Evidenziare tutti gli standard di nuovo, fare clic destro e selezionare "Modifica". Quando cromatogrammi aprire, utilizzare i pulsanti nella parte superiore di "Integrare" e quindi "calibrare" ogni standard; Questo creerà automaticamente la curva standard.
      8. Tornare alla scheda "Set di esempio" e fare doppio clic su set di esempio. Evidenziare tutti gli standard. Ripetere il processo di cui sopra, ma invece, selezionando "Quantitate" dal menu a discesa. Evidenziare tutti i campioni di nuovo, quindi fare clic destro e selezionare "Modifica". Quando cromatogrammi aprire, utilizzare i pulsanti nella parte superiore per il "Integrazione" e poi "Quantificare" ogni campione.
         Nota: Questa sarà uscita la concentrazione di ogni campione basato sulla curva standard creata in precedenza.

3. passiva dell'evitare paradigma

Nota: Questi esperimenti comportamentali sono stati progettati base sui nostri risultati biochimici con la sfida di chinurenina acuta. Per ottimizzare un aumento nel cervello KYNA, chinurenina (100 mg/kg) è stata amministrata a ZT 0, 2 h prima della sessione di allenamento nel paradigma passiva dell'evitare di testare apprendimento hippocampal-mediata, che si sono verificati a ZT 2. L'apparato è costituito da 2 scomparti uguali dimensioni (21,3 cm di altezza, 20,3 cm di larghezza e 15,9 cm di profondità) separati da una porta a ghigliottina e contenuti all'interno di un box insonorizzante. I due compartimenti dell'apparato di test sono definiti come "lato chiaro" e "lato oscuro". Le pareti del lato chiaro sono chiare e, durante le prove, una luce si accende per illuminare ulteriormente questo comparto. Le pareti del vano scuro sono completamente coperti per mantenere una condizione di black-out.

1. Giorni 1: versione di prova formazione
   1. Prima della prova, pulire l'apparecchio con etanolo al 70%.
   2. Portare gli animali per la sala di collaudo.
   3. Delicatamente posizionare l'animale da laboratorio nel lato chiaro delle apparecchiature e la Chiudi e fermo porta l'apparecchio e il box insonorizzante.
   4. Utilizzando il software associato, iniziare la prova. Dalla schermata iniziale, selezionare "File" e poi "Sessione aperta" dal menu a discesa. Nella nuova finestra, verificare che la procedura corretta e l'apparecchio siano selezionati e scegliere "Chiudi". Successivamente, seleziona "Configura" e poi "Segnali". Nella nuova finestra, selezionare l'apparecchio corretto e fare clic su "Problema".
      Nota: Il software avvierà una luce per accendere a lato della luce dell'apparato e aprire la porta a ghigliottina tra i due compartimenti. Sarà avviato un timer.
   5. Quando l'animale entra completamente il lato oscuro dell'apparecchio, la ghigliottina porta si chiude e una piede inevitabile scossa (0,56 mA per 1 s) saranno consegnati.
   6. Registrare il tempo che è trascorso prima che l'animale inserito il vano scuro.
   7. Dopo che l'animale ha ricevuto la scossa, lasciare 30 s di tempo di recupero prima di rimuovere l'animale dall'apparecchio.
   8. Posto sul retro degli animali nella sua gabbia a casa.
   9. Prima di iniziare la prova con il prossimo animale, pulire l'apparecchio pulire con un panno bagnato e smaltire qualsiasi pellet fecali.
   10. Dopo che tutti gli animali sono stati addestrati, restituirli all'alloggio degli animali.
2. Giorno 2: test di prova
   1. Portare animali nuovamente dentro la sala di collaudo 24 h dopo il processo di formazione. Iniziare la prova di collaudo per il primo animale inserendola nel lato luce dell'apparato, chiusura e bloccaggio della porta e il box insonorizzante.
   2. Avviare il processo di test utilizzando i comandi del software stesso come il giorno precedente; la luce si accende nel lato della luce dell'apparato e si aprirà la porta a ghigliottina tra i due compartimenti. Sarà avviato un timer.
   3. Quando l'animale entra nel vano scuro, si chiuderà la porta a ghigliottina. Registrare il tempo trascorso.
      Nota: La versione di prova verrà terminata tramite il software dopo un massimo di 300 s se l'animale rimane sul lato luce dell'apparato di test.
   4. Mettere sul retro degli animali nella loro gabbia a casa e pulire l'apparecchio (come descritto al punto 3.1.9) prima di iniziare la prova con il prossimo animale.

4. analisi di sonno

1. Impianto chirurgico di un trasmettitore wireless di EEG/EMG
   Nota: I trasmettitori telemetrici dovrebbero essere sterilizzati e preparati prima dell'intervento.
   1. Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere delicatamente una piccola lunghezza del rivestimento in plastica per rivelare che il filo conduce. Posizionare i trasmettitori in una provetta conica da 50 mL riempita con soluzione sterilizzante [ad es., Wavecide (2,65% glutaraldeide)].
      1. Lasciare i trasmettitori nella soluzione disinfettante per almeno 12 ore. Quindi, prima della chirurgia, trasferire la soluzione in un contenitore per rifiuti. Sciacquare il trasmettitore con soluzione salina sterile.
   2. Il giorno dell'intervento chirurgico, pesare l'animale prima di posizionarlo in un'aula di anestesia. Indurre il 3 – 5% isoflurane con 100% O₂.
   3. Al momento un successo anestesia, rimuovere l'animale e radere con cura, utilizzando un rasoio elettrico, parte superiore della testa e del collo, così come una piccola patch di capelli sulla parte posteriore del corpo, solo leggermente a sinistra e sotto la gabbia toracica.
   4. Amministrare il carprofen (5 mg/kg) per via sottocutanea per analgesia postoperatoria.
   5. Posizionare un cuscinetto di riscaldamento acqua calda termostaticamente controllato impostato a 37 ° C sotto l'animale per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'intervento chirurgico.
   6. In una cornice stereotassica, metti l'animale su un cono di naso per mantenere la condizione di anestetica e barre di orecchio per stabilizzare la testa. Sterilizzare la pelle rasata alternando i tamponi di betadine scrub e 70% di etanolo. Applicare opthalamic unguento per gli occhi da lubrificarli.
   7. Per garantire un'anestesia adeguata prima della prima incisione, utilizzare il toe-pinch test.
   8. Usando un bisturi sterile, fare un'incisione da appena dietro gli occhi verso la parte posteriore del collo. Il cranio e il muscolo dorsale cervicale collo devono essere esposti.
   9. Se necessario esporre il cranio, utilizzare cotone punta applicatori per rimuovere eventuali membrane. Morsetti micro-bulldog possono essere utilizzati per tenere la pelle dal cranio. Individuare e segnare la posizione del bregma. 2 burr-forare ed inserire viti metalliche 2,0 mm anteriore / + 1,5 mm laterale e 7,0 mm posteriore /-1.5 mm laterale rispetto il bregma. 2 giri completi per serrare le viti. Coprire il cranio esposto con un pezzo di garza.
   10. Utilizzando le forbici chirurgiche sterili, fare un'incisione nella cavità del corpo, appena sotto le costole.
   11. Sul foglio chirurgico, assicurarsi di registrare il numero di serie del trasmettitore per essere impiantati.
   12. Inserire il trasmettitore sterile all'interno della cavità del corpo. I conduttori dovrebbero essere ancora fuori del corpo.
   13. Utilizzare suture assorbibili da ricamare della parete muscolare, assicurando che tutti i cavi sono riuniti a un'estremità dell'incisione.
   14. Rimuovere la garza dalla testa e sollevare la pelle appena sotto l'incisione. Eseguire un paio di lunghi sterili emostatiche sotto la pelle dall'incisione testa all'incisione sul lato. Mantenere la pressione sulla pelle in modo da minimizzare eventuali danni.
       1. Una volta che gli emostatiche sono visibili presso l'incisione del corpo, clip di qualsiasi membrana che può coprire con forbici chirurgiche e afferrare che il trasmettitore quattro conduce con gli emostatiche. Lentamente disegnare fuori emostatiche, in modo che i fili laici sotto la pelle ed eseguire al cranio.
   15. Designare quale 2 cavi saranno collegati al cranio. Usando il forcipe, afferrare l'estremità di un filo con una mano e appena sotto l'estremità della guaina in plastica con l'altro. Tirare il filo fino a singoli circuiti possono solo essere fatto fuori.
   16. Strettamente avvolgere il filo esposto intorno a una delle viti di metallo x 3 – 4. Una volta sicuro, stringere la vite per evitare che il filo da dipanare e clip fuori qualsiasi filo supplementare. Ripetere questa operazione con il secondo cavo e la vite.
   17. Tirare entrambi i cavi EEG da cavità del corpo in modo che si siedono comodamente contro il cranio.
   18. Utilizzare cemento dentale per coprire le viti e corticali conduce, creando un tappo sopra esposte del cranio. Garantire che nessun cemento dentale si attacca alla pelle o ai muscoli e che non sono stato creato spigoli vivi. Lasciare che il cemento dentale ad asciugare.
       Nota: Il tappo dovrebbe essere abbastanza piccolo in modo che la pelle può essere suturata sopra la parte superiore.
   19. Per i cavi di EMG, afferrare l'estremità del filo e guaina di plastica, come descritto nel passaggio 4.1.15. Allungare il filo fino a quando i singoli circuiti sono chiaramente individuabili.
   20. Eseguire un ago 22G sotto il muscolo del collo sul lato destro per 2 – 3 mm prima di consentirne ad emergere. Usando i suturare nonabsorbable, collocare una sutura singola, sciolto intorno all'ago incorporato.
   21. Infilare il filo di EMG nell'ago e tirare l'ago fuori, permettendo che il filo di EMG al thread sotto il muscolo. Stringere la sutura per assicurare il filo rimane al suo posto e clip extra filo che possono emergere dal muscolo.
   22. Ripetere i passaggi da 4.1.20 e 4.1.21 per il secondo cavo EMG, circa 1 mm verso il basso dal primo cavo.
   23. Tirare entrambi i cavi EMG da cavità del corpo in modo che si siedono comodamente contro il muscolo.
   24. Utilizzare punti di sutura non assorbibile per chiudere l'incisione del collo e della testa. Infilare tutti i cavi supplementari sotto la pelle del corpo e utilizzare ferita clip per chiudere l'incisione del corpo.
   25. Applicare pomata di lidocaina per entrambi siti di incisione per assistere l'animale con dolore postoperatorio.
   26. Restituire l'animale alla sua gabbia, permettendo la gabbia per sedersi il rilievo di riscaldamento fino a quando l'animale ha recuperato dall'anestesia.
       Nota: L'animale dovrebbe recuperare per 7 – 10 giorni prima di iniziare le registrazioni.
2. Registrazione EEG/EMG
   Nota: In questo protocollo, abbiamo amministrato chinurenina presso ZT 0 o soluzione fisiologica e poi registrato modelli di sonno-risveglio dell'animale per 24 h.
   1. Completare tutte le registrazioni di sonno in una camera dove gli animali non verranno interrotto per tutta la durata della registrazione.
   2. Posto dalla gabbia dell'animale (tenendo il trasmettitore impiantato di EEG/EMG) un'unità ricevente. Accendere il trasmettitore impiantato chirurgicamente usando un magnete.
      Nota: Una luce dovrebbe apparire sul ricevitore quando il trasmettitore è attivato.
   3. Impostare la registrazione dei dati EEG/EMG utilizzando il software associato.
      1. Selezionare "Esperimento" e quindi "Crea" dal menu a discesa. Nome dell'esperimento e quindi salvarlo. Avanti, selezionare "Hardware" e poi "Modifica configurazione MX2".
      2. Nella nuova finestra, selezionare tutti i trasmettitori utilizzati nell'esperimento e indicare quale pad ricevente ogni è abbinato. Quando si è pronti, è possibile avviare la registrazione premendo "Start tutti continuo".
   4. Al termine degli esperimenti, selezionare "Interrompere tutte le continue" nel software associati e spegnere i trasmettitori utilizzando il magnete.
   5. Eutanasia degli animali da CO₂ asfissia seguita da una puntura cardiaca. Rimuovere il trasmettitore con attenzione riapertura l'incisione lungo la parte superiore della testa con forbici chirurgiche e tagliando i cavi liberi dal muscolo del collo e del cemento dentale.
   6. Successivamente, aprire la cavità del corpo, individuare il trasmettitore e rimuovere lentamente dal corpo.
3. Analisi di EEG/EMG
   1. Utilizzare il software associato per analizzare i dati di sonno-veglia. Aprire il programma e selezionare "Aggiungi nuovo percorso". Nella nuova finestra, selezionare i dati da importare il software notante.
      Nota: Questo creerà un nuovo file all'interno del software contenente tutte le forme d'onda crude raccolte durante l'esperimento.
   2. Punteggio manualmente gli Stati di vigilanza per gli esperimenti desiderati. Dopo aver segnato, analizzare i parametri quali la durata complessiva, il numero di attacchi e la durata media incontro dei vari Stati di vigilanza [movimento di occhio veloce (REM), non - REM NREM e scia].
      Nota: L'analisi può essere eseguita sopra l'intera registrazione o abbreviato in tempo specifici punti di interesse. Qui, l'analisi è stata effettuata per il periodo di registrazione tra ZT 0 a ZT 2.

Risultati

Per convalidare l'uso di un'iniezione intraperitoneale chinurenina come metodo per elevare il cervello KYNA, è stata eseguita un'analisi HPLC del tessuto. Le curve standard (Figura 1) sono state costruite utilizzando il software associato e permesso per la quantificazione dei campioni di tessuto. Cromatogrammi rappresentativi per chinurenina e KYNA sono presentati nella Figura 2. Chinurenina è stata osservata in un periodo di c...

Discussione

Per una valutazione affidabile di KYNA nel cervello dopo somministrazione periferica chinurenina, è fondamentale per combinare e interpretare esperimenti biochimici e funzionali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che permette nuovi utenti a stabilire efficaci metodi per misurare il plasma chinurenina e cervello KYNA dei ratti. La misura della chinurenina nel plasma ha confermato l'iniezione esatta e la misurazione del metabolita KYNA conferma la sintesi de novo nel cervello. Ci sono diversi vantaggi de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wistar rats	Charles River Laboratories		adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate	Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm)	Dr. Maisch GmbH
EZ Clips	Stoelting Co.	59022
Mounting materials screws	PlasticsOne	00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures	MedRep Express	699B	CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures	Ethicon	J310H	4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement	Stoelting Co.	51458
Drill Bit	Stoelting Co.	514551	0.45 mm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module	Waters	176269503
2475 fluorescence detector	Waters	186247500
post-column reagent manager	Waters	725000556
Lenovo computer	Waters	668000249
Empower software	Waters	176706100
Name	Company	Catalog Number	Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle	MedAssociates	ENV-018MD	Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D)
Center channel modulator shuttle box chamber	MedAssociates	ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat	MedAssociates	ENV-010MB-GF
Auto guillotine door	MedAssociates	ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat	MedAssociates	ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel	MedAssociates	ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber	MedAssociates	ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package	MedAssociates	DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes	MedAssociates	ENV-253C
Infrared source and dectector array strips	MedAssociates	ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module	MedAssociates	ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module	MedAssociates	ENV-412
Dual A/B shock control module	MedAssociates	ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension	MedAssociates	SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F	MedAssociates	SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6	MedAssociates	SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080D
PCI interface package	MedAssociates	DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package	MedAssociates	SOF-700RA-7
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software	Data Sciences International (DSI)	PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface	Data Sciences International (DSI)	PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit	Data Sciences International (DSI)	271-0112-013
Dell 19" computer monitor	Data Sciences International (DSI)	271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x	Data Sciences International (DSI)	272-6001-001
Cisco RV130 VPN router	Data Sciences International (DSI)	RV130
Matrix 2.0	Data Sciences International (DSI)	271-0119-001
Network switch	Data Sciences International (DSI)	SG200-08P
Neuroscore software	Data Sciences International (DSI)	271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET	Data Sciences International (DSI)	270-0134-001