Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

Resumen

Alteraciones en los metabolitos de quinurenina vía (KP) neuroactivos implicados en enfermedades psiquiátricas. Investigar los resultados funcionales de un alterado quinurenina vía metabolismo en vivo en los roedores puede ayudar a elucidar nuevos enfoques terapéuticos. El protocolo actual combina enfoques bioquímicos y de comportamiento para investigar el impacto de un desafío de quinurenina aguda en ratas.

Resumen

La vía de la quinurenina (KP) de la degradación de triptófano ha sido implicada en trastornos psiquiátricos. Específicamente, el metabolito derivado de astrositos ácido quinurénico (KYNA), un antagonista en ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) y α7 los receptores nicotínicos de la acetilcolina (α7nACh), se ha implicado en procesos cognitivos en la salud y la enfermedad. Como los niveles KYNA son elevados en los cerebros de pacientes con esquizofrenia, un mal funcionamiento en los receptores colinérgicos y glutamatérgicos se cree que la causal se relaciona con disfunción cognitiva, un dominio de base de la psicopatología de la enfermedad. KYNA puede jugar un papel patofisiológico importante en individuos con esquizofrenia. Es posible elevar el KYNA endógena en el cerebro de roedor por tratar a los animales con la quinurenina bioprecursor directa y estudios preclínicos en ratas han demostrado que elevaciones agudas en KYNA pueden afectar sus procesos de aprendizaje y la memoria. El protocolo actual describe este acercamiento experimental en detalle y combina a) un análisis bioquímico del nivel de quinurenina y cerebro formación KYNA (utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento), b) comportamiento de prueba para probar la memoria contextual dependiente de hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y c) una evaluación de comportamiento de sueño y vigilia [grabaciones telemétricas combinar señales de electromiografía (EMG) y Electroencefalografía (EEG)] en ratas. Tomados en conjunto, se estudia una relación entre el elevado KYNA, sueño y cognición, y este protocolo describe en detalle un enfoque experimental para comprender los resultados de la función de elevación de la quinurenina y KYNA formación en vivo en ratas. Resultados obtenidos a través de las variaciones de este protocolo pondrá a prueba la hipótesis que el KP y KYNA sirven papeles fundamentales en la modulación de sueño y cognición en Estados de salud y enfermedad.

Introducción

El KP es responsable de degradar casi el 95% del aminoácido esencial triptófano¹. En el cerebro mamífero, quinurenina en los astrocitos se metaboliza en la molécula pequeña neuroactivos KYNA principalmente por la enzima aminotransferasa (KAT) quinurenina II². KYNA actúa como un antagonista en los receptores NMDA y α7nACh en el cerebro^2,3,4, y también objetivos de señalización como el receptor de hidrocarburo de arilo (AHR) y la proteína G de receptores juntados receptor 35 (GPR35)^{5 ,6}. En animales de experimentación, elevaciones en cerebro KYNA han demostrado para deteriorar su rendimiento cognitivo en una matriz de análisis conductual^2,7,8,9,10 . Una hipótesis emergente sugiere que KYNA desempeña un papel integral en la modulación de las funciones cognitivas afectando sueño-vigilia comportamiento¹¹, apoyando así aún más el papel de moléculas derivadas de astrositos en la modulación de la neurobiología del sueño y ¹²de la cognición.

Clínicamente, se han encontrado elevaciones en KYNA en líquido cefalorraquídeo y tejido fino del cerebro post mortem de pacientes con esquizofrenia^13,14,15,16, un debilitante trastorno psiquiátrico caracterizado por debilitaciones cognoscitivas. Pacientes con esquizofrenia a menudo se ven afectados por trastornos del sueño que pueden exacerbar la enfermedad¹⁷. Entender el papel del metabolismo de KP y KYNA en la modulación de una relación entre el sueño y cognición, particularmente entre el aprendizaje y la memoria, puede conducir al desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de estos pobres resultados en la esquizofrenia y otros enfermedades psiquiátricas.

Un método confiable y consistente para la medición de metabolitos de KP es importante para garantizar que la investigación de distintas instituciones puede ser integrada en la comprensión científica de la biología de KP. En la actualidad, se describe la metodología para medir la quinurenina en plasma de rata y KYNA en el cerebro de la rata por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El presente Protocolo, que hace uso de una detección fluorimétrica en presencia de Zn^{2 +}, primero fue desarrollado por Shibata¹⁸ y más recientemente adaptado y optimizado para derivatize con acetato de zinc 500 mM como el reactivo de la columna, lo que permite la detección de endógeno, cantidad nanomolar de KYNA en el cerebro¹¹.

Para estimular la producción endógena de KYNA de novo como se describe en el presente Protocolo, la quinurenina bioprecursor directa se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas. En combinación con evaluaciones bioquímicas para determinar el grado de producción de KYNA, los impactos de un quinurenina desafían la memoria dependiente del hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y la arquitectura de sueño-vigilia (señales de EEG y EMG) es también investigar¹¹. Una combinación de estas técnicas permite el estudio de los efectos bioquímicos y funcionales de un quinurenina reto en vivo en ratas.

Protocolo

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Maryland y siguieron a guía los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Nota: Se utilizaron ratas de Wistar macho adulto (250-350 g) en todos los experimentos. Distintas cohortes de animales fueron utilizados para el análisis bioquímico, experimentos conductuales y grabaciones de sueño-vigilia. Los animales fueron alojados en un centro de control de temperatura en el centro de investigación de Maryland psiquiátrico. Se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, con luces momento de zeitgeber (ZT) 0 y apagar las luces a las 12 de la ZT. Los animales recibieron acceso ad libitum al alimento y al agua durante los experimentos. La instalación fue totalmente acreditada por la Asociación Americana para la acreditación de laboratorio Animal.

1. administración de quinurenina intraperitoneal a las ratas

Nota: En el presente Protocolo, quinurenina fue administrado en ZT 0 (el principio de la fase de luz) y tejido se recolectó en 2 ZT y ZT 4 determina un tiempo para el metabolismo de la quinurenina. Inyección de solución salina animales fueron utilizados como control. Por ejemplo, si una rata pesa 500 g y la dosis deseada es de 100 mg/kg, la rata debe recibir una inyección de 5 mL de una solución de 10 mg/mL de quinurenina.

1. Pesar sulfato de L-quinurenina ("quinurenina") y lo coloca en un frasco de vidrio de 20 mL. Asegúrese de mantener la quinurenina en hielo en todo momento.
2. Añada solución salina para lograr la concentración deseada y ajustar el pH a 7,6 con 1 N de hidróxido de sodio (NaOH). Vórtice y someter a ultrasonidos la solución hasta que la quinurenina se disuelva completamente.
   PRECAUCIÓN: Siga todas las precauciones de la recomendación durante la manipulación de NaOH.
   1. Por ejemplo, para lograr una solución de 10 mg/mL, pesar 200 mg de quinurenina y colocar en un frasco de vidrio. Añadir 15 mL de solución salina y de vortex y someter a ultrasonidos (20 kHz para 5 – 10 s, 1/8 de pulgada de diámetro microtip) se disuelva. NaOH, ajustar el pH de la solución. Por último, utilizar una solución salina para ajustar el volumen a 20 mL.
3. Pesan cada rata experimental y calcular el volumen de cada inyección basado en el peso del cuerpo del animal y la dosis de tratamiento deseado. Cuidadosamente retire el animal de su jaula casera, inyectar la solución por vía intraperitoneal y devolver el animal a su jaula.

2. quinurenina mediciones utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento

1. Colección de tejido
   Nota: En el presente Protocolo, quinurenina fue administrado en ZT 0 (el principio de la fase de luz) y tejido se recolectó en 2 ZT y ZT 4 determina un tiempo para el metabolismo de la quinurenina. Inyección de solución salina animales fueron utilizados como control.
   1. Utilizar dióxido de carbono a la eutanasia del animal. Después de han cesado los signos de respiración durante 1 minuto, realizar un método de eutanasia secundaria por decapitación.
   2. Para recoger la sangre del tronco entero, colocar un embudo desechable en un tubo de 15 mL que contiene 20 μL de K₃-EDTA (0.5 M). Permitir que la sangre en el tubo de drenaje del cuerpo. Invertir el tubo varias veces para asegurar el EDTA se mezcla todo.
   3. Con unas tijeras, cortadas la piel en la parte superior de la cabeza hacia abajo de la línea media para exponer el cráneo. Retire cualquier músculo de cuello exceso en la parte posterior del cráneo y, en la inauguración de la médula espinal, corte a través del cráneo de atrás hacia adelante.
      1. Suavemente Abra los dos lados del cráneo para exponer el cerebro y luego retire con cuidado el cerebro con pinzas para que no se dañe. Sacar los bulbos olfativos con una cuchilla de afeitar y cortar el cerebro por la mitad hacia abajo de la línea media. Con unas pinzas, diseccionar la hemibrain en las regiones de interés (es decir, el hipocampo y la corteza).
   4. Poner todos los pedazos de cerebro disecado en papel de aluminio en hielo seco. Después de que el tejido se ha congelado completamente, transferir a un frasco plástico de 20 mL y almacenar a-80 ° C.
   5. Centrifugar la sangre del tronco entero a 300 x g por 10 minutos retirar el sobrenadante (plasma) y transferir a tubos de centrífuga de nuevo antes del almacenamiento a-80 ° C.
2. Preparación de la muestra
   1. Plasma: recogida de los animales tratados
      1. Descongelar lo congelado tubo con plasma (consulte el paso 2.1 para la colección de tejido) en hielo húmedo.
      2. En un nuevo tubo de centrífuga, diluir la muestra con agua ultrapura (1:2 para quinurenina, 1:10 para KYNA). A 100 μL de la muestra diluida, añadir 25 μL de ácido perclórico de 6%.
         PRECAUCIÓN: Siga todas las precauciones de la recomendación durante la manipulación de ácido perclórico.
      3. Vortex todas las muestras, les Centrifugue luego a 12.000 x g durante 10 minutos. Una vez terminado, retirar 100 μL del sobrenadante (cada tubo) y colocarlos en un tubo de microcentrífuga de pequeño 0.25 mL para la quinurenina o determinación de KYNA.
   2. Cerebro: recogida de los animales tratados
      1. Colocar los tubos con las muestras de cerebro congelado (ver paso 2.1 para la colección de tejido) en hielo seco. Pesar individualmente cada muestra de cerebro en una balanza analítica precisa. Volver al tubo y coloque en hielo seco.
      2. Después de todas las muestras han sido sopesadas, mover los tubos en hielo húmedo. Diluir cada muestra 1:10 p/v con agua ultrapura y homogeneizarlas utilizando un sonicador (20 kHz para 5 – 10 s, 1/8 de pulgada de diámetro microtip). Por ejemplo, para 100 mg de tejido cerebral, agregar 900 μL de agua ultrapura.
      3. Alícuota de 100 μL de cada uno diluidas de la muestra a un tubo nuevo y acidificar con 25 μL de ácido perclórico de 25%. Vórtice, entonces lo centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos.
      4. Después de la centrifugación, retirar 100 μL del sobrenadante y colocar en tubos de microcentrífuga de pequeño 0.25 mL para la determinación de KYNA.
3. Gestión y configuración HPLC
   1. Preparar la fase móvil del acetato de sodio 50 mM. Disolver 6,81 g de acetato de sodio trihidrato en 1 L de agua ultrapura. Ajustar el pH a 6.2 utilizando ácido acético glacial y luego vacío la filtro en material de vidrio limpio. Transferencia de la fase móvil de acetato de sodio a una limpia botella de vidrio de 1 L.
   2. Preparación de acetato de zinc y 500 mM. Disolver 54,88 g de acetato de zinc en 500 mL de agua ultrapura, entonces vacío filtrarla. Transferir a un frasco de vidrio limpio de 500 mL. Llenar una botella de 1 L con agua ultrapura y una botella de 500 mL con acetonitrilo de calidad CLAR.
   3. Coloque el tubo de entrada de la máquina HPLC por separado en la fase móvil, el agua ultrapuro y el 100% de acetonitrilo. Bomba de la solución de acetato de zinc por separado a través de una bomba peristáltica que combina con la columna posterior de la fase móvil y antes de la derivatización.
   4. Usando el panel de control en la máquina, programar para ejecutar 5% acetonitrilo y agua ultrapura de 95% a 0,5 mL/min permiten que funcione durante 20-30 min alcanzar una presión estable y línea de base.
   5. Al establecer una línea base estable, cambiar la composición de la solución al 5% acetonitrilo y fase móvil del acetato de sodio 95%. Equilibre durante 30 minutos.
   6. Encender la lámpara en el detector de fluorescencia y deje que se caliente.
   7. Mientras tanto, también encienda la bomba de la columna a un caudal de 0,1 mL/min permiten alcanzar una presión estable de aproximadamente 500 psi después de aproximadamente 20 minutos.
   8. Preparar los estándares.
      1. KYNA, comienzan con una solución stock de 1 mM y diluir para preparar 5 concentraciones estándar (es decir, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 1 nM y 500 pM).
         Nota: Esto producirá una curva estándar que van desde 200 fmoles 10 fmoles por inyección μL 20.
      2. Quinurenina, comienzan con una solución stock de 1 mM y diluir para preparar 5 concentraciones estándar (es decir, 10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1 μM y 500 nM).
         Nota: Esto producirá una curva estándar que van desde 200 pmoles a 10 pmoles por inyección μL 20.
   9. Configurar el software del sistema HPLC para controlar los parámetros de la secuencia de muestra y permitir la autoinjections de muestras múltiples.
      1. Cuando en la pantalla de "Muestra de ejecutar", haga clic en "Archivo" y arrastre hacia abajo a "Crear nueva muestra Set". Cuando se abre la nueva ventana, selecciona "Empty". Individualmente una lista de todas las normas (ver paso 2.3.8) o muestras en el orden que deben ejecutar.
      2. En la columna de "Función", señalan los estándares y las muestras. Las normas deben ensayarse al principio y al final de la secuencia. Inyectar agua entre cada 5 muestras.
      3. Establecer el tiempo de ejecución para cada muestra en 15 minutos inyectar 20 μL de la muestra de las normas y la preparación de plasma o inyectar 30 μL de la muestra de la preparación de homogeneizado de cerebro.
      4. Ajustar las longitudes de onda de excitación y emisión (dependiente en el compuesto evaluado) de quinurenina a excitación: 365 nm, emisión: 480 nm y el tiempo de retención: ~ 6 min y KYNA a excitación: 344 nm, emisión: 398 nm y el tiempo de retención: ~ 11 min.
      5. Una vez establecidos todos los parámetros y la máquina se ha equilibrado, ejecute la secuencia.
      6. Para cuantificar los datos, desplácese a la pantalla de "Project navegar". En la pestaña de "Conjuntos de muestra", haga doble clic en la muestra a cuantificar. En la lista de todas las inyecciones, resalte todas las normas y haga clic. En la nueva ventana, seleccione "Proceso" y, a continuación, utilice el menú desplegable para seleccionar "Calibrar y cuantificar" junto al "Cómo":.
      7. Destacar otra vez todas las normas, haga clic derecho y seleccionar "Examinar". Cuando los cromatogramas se abren, utilice los botones en la parte superior para "Integrar" y luego "calibrar" a cada estándar; Esto creará automáticamente la curva estándar.
      8. Volver a la ficha "Muestra fija" y haga doble clic en el conjunto de la muestra. A continuación, resalte todas las normas. Repita el proceso indicado arriba, pero en su lugar, seleccionando "Cuantificación" del menú desplegable. Destacar todas las muestras una vez más, luego haga clic derecho y seleccionar "Examinar". Cuando los cromatogramas se abren, utilice los botones en la parte superior para "Integrar" y luego "Cuantificar" cada uno muestra.
         Nota: Esto producirá la concentración de cada muestra partiendo de la curva de estándar previamente creada.

3. paradigma de evitación pasiva

Nota: Estos experimentos conductuales fueron diseñados en base a nuestros hallazgos bioquímicos con el reto de quinurenina aguda. Para maximizar un aumento de cerebro KYNA, quinurenina (100 mg/kg) fue administrado en ZT 0, 2 h antes de la sesión de entrenamiento en el paradigma de evitación pasiva a prueba de aprendizaje mediada por el hipocampo, que se produjo en el ZT 2. El aparato consiste en 2 igual tamaños compartimentos (21,3 cm de alto, 20,3 cm de ancho y 15,9 cm de profundidad) separada por una puerta de guillotina y contenida dentro de una caja insonorizada. Los dos compartimientos del aparato de prueba se denominan "lado luminoso" y el "lado oscuro". Las paredes del lado luminoso son claras y, durante los ensayos, una luz enciende para iluminar más este compartimiento. Las paredes del compartimiento oscuro están completamente cubiertas para mantener una condición de negro.

1. 1 día: ensayo de formación
   1. Antes de la prueba, limpie el aparato con etanol al 70%.
   2. Llevar los animales a la sala de pruebas.
   3. Suavemente Coloque el animal experimental en el lado luminoso de los aparatos y el cierre y cierre la puerta del aparato y la caja insonorizada.
   4. Utilizando el software asociado, iniciar el ensayo. En la pantalla principal, seleccione "Archivo" y luego "Abrir sesión" del menú desplegable. En la nueva ventana, asegurar que el correcto procedimiento y aparatos son seleccionados y haga clic en "Close". A continuación, seleccione "Configurar" y "Señales". En la nueva ventana, seleccionar el aparato correcto y haga clic en "Asunto".
      Nota: El software iniciará una luz en el lado luminoso del aparato y abra la puerta de guillotina entre los dos compartimientos. Se iniciará un temporizador.
   5. Cuando el animal entra totalmente en el lado oscuro del aparato, la cerrará la puerta guillotina y un choque inevitable de pie (0,56 mA 1 s) será entregado.
   6. Registrar el tiempo transcurrido antes de que el animal entró en el compartimiento oscuro.
   7. Después de que el animal ha recibido el choque, permiten 30 s de tiempo de recuperación antes de retirar al animal del aparato.
   8. Colocar la espalda del animal en su jaula casera.
   9. Antes de comenzar el ensayo con el siguiente animal, limpie el aparato con una toalla mojada y elimine cualquier pelotillas fecales.
   10. Después de todos los animales han sido entrenados, les devuelva al centro de animales.
2. Día 2: pruebas de ensayo
   1. Traer animales a la sala de prueba 24 h después del proceso de formación. Comenzar el ensayo de prueba para el primer animal colocándola en el lado luminoso del aparato, cierre y traba la puerta y la caja insonorizada.
   2. Iniciar el prueba ensayo utilizando los mismos comandos de software como el día anterior; la luz se enciende en el lado luminoso del aparato y se abrirá la puerta de guillotina entre los dos compartimientos. Se iniciará un temporizador.
   3. Cuando el animal entra en el compartimento oscuro, se cerrará la puerta de guillotina. Registrar el tiempo transcurrido.
      Nota: El ensayo finalizará mediante el software después de un máximo de 300 s si el animal permanece en el lado luminoso de los aparatos de prueba.
   4. Colocar la espalda del animal en su jaula casera y limpie el aparato (como se describe en el paso 3.1.9) antes de comenzar el ensayo con el siguiente animal.

4. Análisis de sueño

1. Implantación quirúrgica de un transmisor inalámbrico de EEG/EMG
   Nota: Los transmisores de telemetría deben ser esterilizados y preparados antes de la cirugía.
   1. Usando una cuchilla de afeitar, retire con cuidado una pequeña longitud de recubrimiento plástico para revelar que el alambre conduce. Colocar los emisores en un tubo cónico de 50 mL con solución de esterilización [p. ej., Wavecide (2.65% glutaraldehído)].
      1. Deje los transmisores en la solución desinfectante durante al menos 12 h. Entonces, antes de la cirugía, transferir la solución a un contenedor de residuos. Enjuague el transmisor con solución salina estéril.
   2. En el día de la cirugía, peso del animal antes de ser colocado en una cámara de anestesia. Inducir a 3 – 5% isoflurano con 100% O₂.
   3. Una anestesia exitosa, retirar el animal y cuidadosamente afeitado, use una afeitadora eléctrica, la parte superior de la cabeza y cuello, así como un pequeño parche de pelo en la parte posterior del cuerpo, ligeramente a la izquierda y por debajo de la caja torácica.
   4. Administrar carprofen (5 mg/kg) por vía subcutánea para analgesia postoperatoria.
   5. Coloque una almohadilla de calefacción agua caliente termostáticamente controlado establecido a 37 ° C en el animal para mantener la temperatura del cuerpo del animal durante la cirugía.
   6. En un marco estereotáxicas, coloque el animal en un cono de nariz para mantener el estado anestésico y colocar barras de oído para estabilizar la cabeza. Esterilizar la piel depilada por la alternancia de hisopos de betadine scrub y el 70% de etanol. Aplicar pomada de opthalamic en los ojos para lubricarlos.
   7. Para garantizar la adecuada anestesia antes de la primera incisión, utilice la prueba del pellizco del dedo del pie.
   8. Con un bisturí estéril, hacer una incisión de apenas detrás de los ojos hasta la parte posterior del cuello. El cráneo y el músculo del cuello cervical dorsal deben estar expuestas.
   9. Si es necesario para exponer el cráneo, use aplicadores con punta de algodón para quitar cualquier membranas. Micro-Bulldogs pueden utilizarse para mantener la piel del cráneo. Localice y marque la posición de la bregma. Taladro 2 agujeros de las rebabas e inserte los tornillos metal anterior 2,0 mm / + 1,5 mm lateral y 7,0 mm posterior /-1.5 mm laterales en relación con el bregma. Completadas 2 vueltas para apretar los tornillos. Cubre el cráneo expuesto con un trozo de Gasa.
   10. Usando tijeras quirúrgicas estériles, haga una incisión en la cavidad del cuerpo, justo debajo de las costillas.
   11. En la hoja quirúrgica, asegúrese de registrar el número de serie del transmisor para ser implantado.
   12. Inserte el transmisor estéril dentro de la cavidad del cuerpo. Los cables deben estar fuera del cuerpo.
   13. Usar suturas absorbibles para coser la pared muscular, asegurando que todos los cables están reunidos a un extremo de la incisión.
   14. Quitar la gasa de la cabeza y levanta la piel justo debajo de la incisión. Ejecutar un par de pinzas hemostáticas estériles largo debajo de la piel de la incisión principal para la incisión en el lado. Mantener la presión sobre la piel para reducir al mínimo cualquier lesión.
       1. Una vez que las pinzas hemostáticas son visibles cerca de la incisión del cuerpo, clip cualquier membrana que pueda cubrir con tijeras quirúrgicas y agarrar que el transmisor cuatro plomos con las pinzas hemostáticas. Lentamente extraer las pinzas hemostáticas, por lo que los cables ponen debajo de la piel y acumular en el cráneo.
   15. Señalar que 2 cables se conectarán a la calavera. Con unas pinzas, sujete el extremo de un alambre con una mano y justo debajo el extremo de la envoltura del plástico con el otro. Tire del cable hasta lazos individuales sólo se pueden hacer.
   16. Envuelva firmemente el alambre expuesto alrededor de uno de los tornillos de metal x 3 – 4. Una vez seguro, apriete el tornillo para evitar que el cable de desenredar y clip de cualquier cable adicional. Repetir este proceso con el segundo cable y tornillo.
   17. Tire de ambos conductores de EEG de la cavidad del cuerpo para que se sientan cómodamente contra el cráneo.
   18. Cemento dental del uso para cubrir los tornillos y cortical conduce, creando un tapón sobre el cráneo expuesto. Asegúrese de que ningún cemento dental se adhiere a la piel o músculo y que no hay bordes afilados son creados. Permita que el cemento dental secar.
       Nota: La tapa debe ser lo suficientemente pequeña como para que la piel puede ser suturada sobre la parte superior.
   19. Para los conductores de EMG, sostenga el extremo del alambre y envoltura plástica como se describe en el paso 4.1.15. Estire el alambre hasta que los lazos individuales son claramente discernibles.
   20. Ejecute una aguja de 22 G en el músculo del cuello en el lado derecho de 2 – 3 mm antes de permitir que surjan. Utilizando suturas no absorbibles, coloque una sutura simple, floja alrededor de la aguja incrustada.
   21. Enrosque el cable de la EMG en la aguja y tire de la aguja hacia fuera, permitiendo que el alambre EMG al hilo bajo el músculo. Apretar la sutura para asegurar el cable permanece en su lugar y clip extra de alambre puede surgir del músculo.
   22. Repita los pasos 4.1.20 y 4.1.21 el segundo plomo EMG, aproximadamente 1 mm abajo de la primera ventaja.
   23. Jale ambos conductores EMG de la cavidad del cuerpo para que se sientan cómodamente contra el músculo.
   24. Utilizar puntos de sutura no reabsorbibles para cerrar la incisión de cabeza y cuello. Meter todos los cables extra debajo de la piel del cuerpo y utilizar clips de herida para cerrar la incisión del cuerpo.
   25. Aplicar pomada de lidocaína a ambos sitios de incisión para ayudar a los animales con dolor postoperatorio.
   26. Devolver el animal a su jaula de casa, permitiendo que la jaula se siente en el cojín de calentamiento hasta que el animal se ha recuperado de la anestesia.
       Nota: El animal debe recuperarse durante 7 – 10 días antes de comenzar las grabaciones.
2. Grabación de EEG/EMG
   Nota: En el presente Protocolo, administrar solución salina o quinurenina en ZT 0 y luego registran patrones de sueño-vigilia del animal durante 24 h.
   1. Completa todas las grabaciones del sueño en un sitio designado donde los animales no se interrumpirá durante la duración de la grabación.
   2. Coloque la jaula casera del animal (teniendo el transmisor implantado de EEG/EMG) en una unidad receptora. Encienda el transmisor implantado quirúrgicamente usando un imán.
      Nota: Debe aparecer una luz en la unidad de receptor cuando el transmisor está activado.
   3. Configurar el registro de los datos de EEG/EMG utilizando el software asociado.
      1. Seleccione "Experimento" y "Crear" en el menú desplegable. Nombre del experimento y luego guardarlo. A continuación, seleccione "Hardware" y luego "Editar configuración de MX2".
      2. En la nueva ventana, seleccione todos los transmisores utilizados en el experimento e indicar que tecla receptora se empareja con. Cuando esté listo, inicie la grabación pulsando "Iniciar todo continuo".
   4. En la terminación de los experimentos, seleccione "Detener todo continuo" en el software asociado y apagar los transmisores con el imán.
   5. Eutanasia a los animales por CO₂ asfixia seguida por una punción cardiaca. Retire con cuidado el transmisor por reabrir la incisión a lo largo de la parte superior de la cabeza con tijeras quirúrgicas y corte las puntas libres del músculo cemento y cuello dental.
   6. A continuación, abra la cavidad del cuerpo, ubique el transmisor y Extraiga lentamente del cuerpo.
3. Análisis de EEG/EMG
   1. Utilice el software asociado para analizar los datos de sueño-vigilia. Abrir el programa y seleccionar "Agregar nueva ubicación". En la nueva ventana, seleccione los datos a importar en el software de calificación.
      Nota: Esto creará un nuevo archivo en el software que contiene ondas crudas todos recogidos durante el experimento.
   2. Marcar manualmente los Estados de vigilancia para los experimentos deseados. Después de anotar, analizar los parámetros como la duración total, el número de episodios y la duración promedio de combate de los diferentes Estados de vigilancia [movimiento de ojo rápido (REM), no - REM NREM y vigilia].
      Nota: El análisis se realizó durante toda la grabación o acortado a momentos específicos de interés. Aquí, el análisis se realizó para el periodo de grabación 0 ZT ZT 2.

Resultados

Para validar el uso de una inyección intraperitoneal de quinurenina como método para elevar el cerebro KYNA, se realizó un análisis HPLC de tejido. Curvas estándar (figura 1) fueron construidas usando el software asociado y permite la cuantificación de las muestras de tejido. Cromatogramas representativos de quinurenina y KYNA se presentan en la figura 2. Quinurenina se observó en un tiempo de retención de 6 min y KYNA te...

Discusión

Para una evaluación confiable de KYNA en el cerebro después de una administración periférica de la quinurenina, es fundamental combinar e interpretar experimentos bioquímicos y funcionales. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite a los usuarios nuevos para establecer métodos eficaces para la medición de la quinurenina de plasma y el cerebro KYNA de ratas. La medición de la quinurenina en plasma confirma la inyección precisa y la medición del metabolito KYNA confirma la síntesis de novo e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wistar rats	Charles River Laboratories		adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate	Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm)	Dr. Maisch GmbH
EZ Clips	Stoelting Co.	59022
Mounting materials screws	PlasticsOne	00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures	MedRep Express	699B	CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures	Ethicon	J310H	4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement	Stoelting Co.	51458
Drill Bit	Stoelting Co.	514551	0.45 mm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module	Waters	176269503
2475 fluorescence detector	Waters	186247500
post-column reagent manager	Waters	725000556
Lenovo computer	Waters	668000249
Empower software	Waters	176706100
Name	Company	Catalog Number	Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle	MedAssociates	ENV-018MD	Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber	MedAssociates	ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat	MedAssociates	ENV-010MB-GF
Auto guillotine door	MedAssociates	ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat	MedAssociates	ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel	MedAssociates	ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber	MedAssociates	ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package	MedAssociates	DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes	MedAssociates	ENV-253C
Infrared source and dectector array strips	MedAssociates	ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module	MedAssociates	ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module	MedAssociates	ENV-412
Dual A/B shock control module	MedAssociates	ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension	MedAssociates	SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F	MedAssociates	SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6	MedAssociates	SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080D
PCI interface package	MedAssociates	DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package	MedAssociates	SOF-700RA-7
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software	Data Sciences International (DSI)	PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface	Data Sciences International (DSI)	PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit	Data Sciences International (DSI)	271-0112-013
Dell 19" computer monitor	Data Sciences International (DSI)	271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x	Data Sciences International (DSI)	272-6001-001
Cisco RV130 VPN router	Data Sciences International (DSI)	RV130
Matrix 2.0	Data Sciences International (DSI)	271-0119-001
Network switch	Data Sciences International (DSI)	SG200-08P
Neuroscore software	Data Sciences International (DSI)	271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET	Data Sciences International (DSI)	270-0134-001